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Panton-Valentine杀白细胞毒素(PVL)lukS-PV基因的克隆、原核表达及初步鉴定 被引量：6
1
作者 高玉录 马筱玲 +5 位作者 沈继龙 戴媛媛 付广林 张义永 鲁怀伟 李华 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2008年第5期493-496,共4页
目的构建Panton-Valentine杀白细胞毒素(PVL)lukS-PV基因表达载体,并在大肠杆菌中表达相应蛋白。方法提取PVL阳性金黄色葡萄球菌的基因,PCR方法扩增lukS-PV,A-T克隆至pGEM-T载体上,经PCR、双酶切和测序鉴定后,亚克隆到pET28a(+)表达载体... 目的构建Panton-Valentine杀白细胞毒素(PVL)lukS-PV基因表达载体,并在大肠杆菌中表达相应蛋白。方法提取PVL阳性金黄色葡萄球菌的基因,PCR方法扩增lukS-PV,A-T克隆至pGEM-T载体上,经PCR、双酶切和测序鉴定后,亚克隆到pET28a(+)表达载体上,鉴定并转化至Rosetta(DE3)plys表达宿主菌中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定。结果构建了lukS-PV-pGEM-T和lukS-PV-pET28a(+)重组质粒,经PCR扩增和限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切均得到939bp的目的片段,基因测序与GENEBANK中的PVL的序列一致,宿主菌表达带HIS标签的重组LukS-PV蛋白。结论成功克隆lukS-PV基因和构建重组表达质粒,并在宿主菌中成功表达重组LukS-PV蛋白,为PVL免疫学检测方法的建立奠定基础。 展开更多
关键词 杀白细胞素类/遗传学 基因表达 克隆 分子
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Panton-Valentine杀白细胞素原核表达、纯化及生物学活性鉴定 被引量：11
2
作者 常文娇 马筱玲 +5 位作者 沈继龙 高朋 戴媛媛 张翠萍 周馨 周文静 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2011年第1期6-10,共5页
目的原核表达金黄色葡萄球菌Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)蛋白,并进行生物学活性鉴定。方法提取PVL阳性金黄色葡萄球菌DNA,利用PCR扩增LukF-PV和LukS-PV编码基因,亚克隆入表达载体pET28 a,转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21株,经异丙基-... 目的原核表达金黄色葡萄球菌Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)蛋白,并进行生物学活性鉴定。方法提取PVL阳性金黄色葡萄球菌DNA,利用PCR扩增LukF-PV和LukS-PV编码基因,亚克隆入表达载体pET28 a,转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21株,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,纯化后获得可溶性的蛋白,Western blot对其鉴定。并以人多形核粒细胞(PMNs)为靶细胞检测其生物学活性。结果成功构建了LukF-PV和LukS-PV基因的表达载体,经IPTG诱导和亲和层析纯化法获得重组蛋白,Western blot鉴定证实其为重组PVL蛋白。实验表明该蛋白具有诱导人多形核粒细胞(PMNs)凋亡的作用。结论成功地表达获得了具有生物学活性的PVL重组蛋白,为PVL快速检测方法的建立和致病机制研究奠定基础。 展开更多
关键词 杀白细胞素类/遗传学 基因表达 细胞凋亡 葡萄球菌 金黄色
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表达Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)的金黄色葡萄球菌诱导人THP-1单核细胞自噬和凋亡 被引量：4
3
作者 陆娟 邹治情 +7 位作者 夏雯 戴晓玥 席月 丁龙坤 张敏 吴亮 阴晴 许化溪 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期406-414,共9页
目的研究表达Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)的金黄色葡萄球菌诱导人THP-1细胞自噬和凋亡机制。方法在大肠杆菌中表达重组杀白细胞素(rPVL),并免疫家兔制备多克隆抗血清。采用反转录PCR和Western blot法鉴定表达PVL的耐甲氧西林金黄... 目的研究表达Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)的金黄色葡萄球菌诱导人THP-1细胞自噬和凋亡机制。方法在大肠杆菌中表达重组杀白细胞素(rPVL),并免疫家兔制备多克隆抗血清。采用反转录PCR和Western blot法鉴定表达PVL的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。分别使用表达PVL的MRSA(MRSA^(PVL+))和不表达PVL的MRSA(MRSA^(PVL-))感染THP-1细胞,于感染后1、3、6 h收集细胞,采用实时定量PCR检测自噬相关基因3(ATG3)、ATG4B、ATG5、ATG7、ATG12;Western blot法检测beclin-1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化的PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化的AKT(p-AKT)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化的mTOR(p-mTOR)、裂解型胱天蛋白酶3(c-caspase-3)、caspase-3的蛋白水平;二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针负载法检测细胞活性氧(ROS)水平;异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡。结果成功制备PVL多克隆抗体,鉴定出1株MRSA^(PVL-)菌和1株MRSA^(PVL+)菌。分别以两株菌与THP-1细胞共培养1 h,MRSA^(PVL+)组仅ATG7表达量显著高于MRSA^(PVL-)组和正常对照组;共培养3 h,MRSA^(PVL+)组ATG7和ATG12表达量高于MRSA^(PVL-)组和正常对照组,其他基因表达量变化不明显。感染1、3、6 h,MRSA^(PVL+)感染组细胞PI3K、AKT和mTOR磷酸化水平显著低于MRSA^(PVL-)感染组和正常对照组;感染1 h和3 h,MRSA^(PVL-)感染组细胞PI3K、AKT和mTOR磷酸化水平显著低于正常对照组;感染6 h,MRSA^(PVL-)菌感染组细胞mTOR磷酸化水平显著低于正常对照组。感染1、3、6 h,MRSA^(PVL+)组细胞ROS水平和凋亡率均高于MRSA^(PVL-)组和正常对照组,且随着感染时间的延长细胞ROS水平和凋亡率持续增加;MRSA^(PVL-)组细胞ROS水平和凋亡率也高于正常对照组。结论MRSA^(PVL+)对THP-1细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制作用更强,可促进ATG12/ATG7/ATG5自噬通路活化增加THP-1细胞自噬;同时,MRSA^(PVL+)诱导THP-1细胞ROS产生增加,促进细胞凋亡。 展开更多
关键词 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) panton-valentine杀白细胞素(PVL) 巨噬细胞 自噬 凋亡
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皮肤软组织及创伤感染金黄色葡萄球菌分离株的毒素基因检测 被引量：3
4
作者 邓家德 陈惠玲 +4 位作者 叶惠芬 凌艳英 李焕庭 杨银梅 周小棉 《中国感染与化疗杂志》 CAS 北大核心 2012年第5期368-371,共4页
目的了解皮肤软组织及创伤感染的金葡菌携带的杀白细胞素(Panton—Valentine Leukocidin,PVL)基因、表皮剥脱性毒素(ETs)基因、中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)的tst基因的特点。方法对连续收集的皮肤软组织感染中分离的90株金葡菌,采... 目的了解皮肤软组织及创伤感染的金葡菌携带的杀白细胞素(Panton—Valentine Leukocidin,PVL)基因、表皮剥脱性毒素(ETs)基因、中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)的tst基因的特点。方法对连续收集的皮肤软组织感染中分离的90株金葡菌,采用多重PCR同时检测金葡菌特异性16SrRNA基因、mecA基因、PVL基因,采用PCR法检测TSST-1及EtsA、B基因。结果金葡菌mecA基因阳性47株(占金葡菌52.2%)为耐甲氧西林金葡菌(MRSA)。有1株MRSA的EtsB基因阳性,1株MRSA的TSST-1阳性,有7株金葡菌携带PVL基因,其中3株为mecA基因阳性株(MRSA)。结论金葡菌可分泌多种毒素,携带PVL毒素的金葡菌常可以引起严重的侵袭性感染,尤其对产毒的MRSA感染引起足够的重视,是防控的重点。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌 表皮剥脱性毒素 中毒性休克综合征毒素-1 杀白细胞素 基因
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猪源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药表型及其SCCmec基因分型研究 被引量：9
5
作者 王雪敏 姚建楠 +4 位作者 李蓓蓓 杨传定 邵东华 王少辉 马志永 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期841-845,共5页
目的了解上海猪场及屠宰场耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的流行状况、耐药谱特征及其SCCmec基因分型特点。方法我们于2011年8月—2012年5月分别在上海市5个规模化猪场和1个屠宰场,采集猪鼻腔拭子样品共计232份。通过7.5%氯化钠肉汤预... 目的了解上海猪场及屠宰场耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的流行状况、耐药谱特征及其SCCmec基因分型特点。方法我们于2011年8月—2012年5月分别在上海市5个规模化猪场和1个屠宰场,采集猪鼻腔拭子样品共计232份。通过7.5%氯化钠肉汤预增菌,显色培养基显色培养分离金黄色葡萄球菌(SA),采用双重PCR方法扩增其中是否含有nuc基因和mecA基因进行MRSA鉴定;以肉汤稀释法进行药物敏感性试验;应用多重PCR方法进行SCCmec基因分型;同时检测杀白细胞素(PVL)基因。结果共计分离得到139株SA,其中70株MRSA,MRSA的检出率为30.2%(70/232)。基因分型显示均为SCCmecⅣb型,未检测到PVL基因,药敏结果显示MRSA除对利奈唑胺,万古霉素,阿米卡星全部敏感外,对头孢噻呋,庆大霉素,诺氟沙星耐药率分别为74.3%,62.9%和42.9%,对阿奇霉素,红霉素,氟苯尼考,氯霉素,苯唑西林的耐药率均为100%,值得注意的,本研究中分离的全部MRSA都对截短侧耳类药物泰妙菌素、沃尼妙林以及人医新药瑞他帕林表现高水平耐药。结论结果显示了上海地区猪源MRSA主要流行SCCmecⅣb型,并且具有多重耐药的特点,尤其对截断侧耳类人医新药全部耐药,这也提示我们要防控动物源耐药菌或耐药基因通过食物链或者环境向人类的传播的潜在风险。 展开更多
关键词 MRSA 耐药性 SCCMEC基因分型 杀白细胞素
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长春市金葡菌耐药状况及耐甲氧西林金葡菌基因分型 被引量：4
6
作者 姜秀虹 牛俊奇 +5 位作者 王辉 孙宏莉 王峰 续薇 许建成 段琼 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期25-29,共5页
目的调查长春地区临床分离金葡菌的耐药状况及Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)分布情况;确定耐甲氧西林金葡菌(MRSA)染色体及葡萄球菌mec盒式染色体(SCCmec)基因分型。方法琼脂稀释法测定苯唑西林等17种抗菌药物对2004年6月～2005年1... 目的调查长春地区临床分离金葡菌的耐药状况及Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)分布情况;确定耐甲氧西林金葡菌(MRSA)染色体及葡萄球菌mec盒式染色体(SCCmec)基因分型。方法琼脂稀释法测定苯唑西林等17种抗菌药物对2004年6月～2005年1月长春市3家教学医院临床标本分离的83株金葡菌的最低抑菌浓度(MIC);聚合酶链式反应(PCR)进行金葡菌的PVL基因检测;脉冲场凝胶电泳(PFGE)对MRSA菌株作染色体同源性分析,多重PCR方法检测MRSA的SCCmec基因分型。结果83株金葡菌中MRSA12株(占14.5%);金葡菌PVL的基因阳性7株(占8.4%)。MRSA对β-内酰胺类、红霉素、克林霉素、庆大霉素、四环素、氟喹诺酮类耐药率均超过90%,对氯霉素、利福平耐药率分别为8.3%、58.3%,未发现对糖肽类及复方磺胺甲口恶唑耐药的MRSA。甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)对青霉素G、红霉素、克林霉素、四环素、庆大霉素耐药率分别为95.8%、67.6%、49.3%、45.1%、26.8%,对头孢菌素、氯霉素、利福平、氟喹诺酮类、复方磺胺甲口恶唑耐药率均低于20%。MRSA的PFGE显示为A、B两种类型,以A型为主,占92%(11/12),三家医院均有分布。MRSA的SCCmec分型,III型为主75%(9/12)。结论长春市MRSA发生率低于国内报道平均水平;MRSA为两种不同类型克隆株,在不同医院间存在克隆传播;未发现社区获得性MRSA菌株。 展开更多
关键词 耐甲氧西林金葡菌 葡萄球菌基因盒染色体 杀白细胞素 社区获得性耐甲氧西林金葡菌
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多重PCR检测临床分离金黄色葡萄球菌lukS/F-PV和mecA基因 被引量：1
7
作者 闫中强 沈定霞 +1 位作者 罗燕萍 曹敬荣 《中国感染与化疗杂志》 CAS 2008年第4期255-259,共5页
目的建立一种新的多重PCR方法,检测临床分离金葡菌的杀白细胞素毒力基因(lukS/F-PV)和甲氧西林耐药基因(mecA)。方法收集我院2006年1—12月从临床多种标本中分离鉴定的不重复金葡菌,应用多重PCR技术,优化反应条件,同时扩增葡萄球菌属特... 目的建立一种新的多重PCR方法,检测临床分离金葡菌的杀白细胞素毒力基因(lukS/F-PV)和甲氧西林耐药基因(mecA)。方法收集我院2006年1—12月从临床多种标本中分离鉴定的不重复金葡菌,应用多重PCR技术,优化反应条件,同时扩增葡萄球菌属特异性基因16S rRNA、金葡菌种特异性基因nuc、lukS/F-PV基因和mecA基因,扩增产物经凝胶成像系统分析。结果217株金葡菌经多重PCR检测,31株是16S rRNA+nuc+lukS/F-PV+mecA基因型,3株是16SrRNA+nuc+lukS/F-PV基因型,135株是16S rRNA+nuc+mecA基因型,40株是16S rRNA+nuc基因型,其中5株仅扩增出16S rRNA基因,3株仅扩增出nuc基因。lukS/F-PV基因和mecA基因测序显示与GenBank中的已有序列具有高度同源性,其阳性率分别为15.7%(34/217)和76.5%(166/217);34株lukS/F-PV基因阳性的分离株中,31株为MRSA,占91.2%(31/34)。结论本方法适用于快速检测和鉴定产杀白细胞素MRSA,lukS/F-PV基因阳性的菌株以MRSA为主,应加强监控。 展开更多
关键词 金葡菌 杀白细胞素毒力基因 MECA基因 聚合酶链反应
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全国多中心细菌耐药监测网中血流感染相关金黄色葡萄球菌的分子流行病学研究 被引量：27
8
作者 毛镭篥 肖盟 +2 位作者 王贺 赵颖 徐英春 《中国感染与化疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期120-125,共6页
目的首次研究全国多中心血流感染相关金黄色葡萄球菌(金葡菌)的分子流行病学特征。方法全国17省市34所医院共149株血流感染相关的金葡菌,分析杀白细胞毒素(pvl)基因,多位点序列分型(MLST)和spa分型(编码葡萄球菌A蛋白)及甲氧西林耐药金... 目的首次研究全国多中心血流感染相关金黄色葡萄球菌(金葡菌)的分子流行病学特征。方法全国17省市34所医院共149株血流感染相关的金葡菌,分析杀白细胞毒素(pvl)基因,多位点序列分型(MLST)和spa分型(编码葡萄球菌A蛋白)及甲氧西林耐药金葡菌(MRSA)琼脂稀释法的药敏结果。结果受试菌计有71株MRSA和78株甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)。pvl阳性株为11株,MRSA只占1株。MLST显示有23种不同的序列型(ST)结果,MRSA含6种ST分型,主要型别为ST239及ST5;MSSA有20种ST分型,但是各型别比例均不超过15%。spa分型共45种型别,MRSA含8种型别,优势型别为t030和t037;MSSA有38种型别,优势型别为t091和t189。MRSA对常用抗菌药物耐药率依次为环丙沙星91.18%,左氧氟沙星91.18%,红霉素76.47%,莫西沙星73.53%,克林霉素70.59%,利福平58.82%,甲氧苄啶-磺胺甲口恶唑17.65%;对利奈唑胺、万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁、替加环素等药物均100%敏感。结论血流感染相关MRSA传播的优势型别为ST239-t037和ST239-t030,并对多种抗菌药物存在不同程度耐药,需加强细菌耐药性监测。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌 panton-valentine杀白细胞素基因 多位点序列分型 葡萄球菌A蛋白分型 多重聚合酶链反应 药敏试验
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社区获得甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌 被引量：24
9
作者 汪复 《中国抗感染化疗杂志》 2005年第6期376-380,共5页
关键词 耐甲氧西林金葡菌 葡萄球菌基因盒染色体 杀白细胞素 脉冲场电泳
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