复合益生菌产品中副干酪乳酪杆菌活菌定量的PMA-qPCR方法研究

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作者 焦颖欣 郭立峥 +5 位作者 宋程羽 宋智泉 冯会粉 迮晓雷 葛媛媛 姚粟 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第22期360-367,共8页

复合益生菌产品的活菌数是评估其质量和功效的关键参数。然而,如何在复合益生菌产品中实现特定菌种活菌数的精准检测是目前行业内面临的技术难题。叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)结合荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)技术,... 复合益生菌产品的活菌数是评估其质量和功效的关键参数。然而,如何在复合益生菌产品中实现特定菌种活菌数的精准检测是目前行业内面临的技术难题。叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)结合荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)技术,可有效区分死活菌,精确检测多菌种体系中目标菌种的活菌数。该研究以副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)为研究对象,通过比较7种常用DNA提取方法的效率并优化PMA前处理条件,建立了基于PMA-qPCR的活菌定量检测方法,并对其特异性和适用性进行了验证。结果表明,采用珠式研磨仪破碎法一步式提取DNA时,其提取效率优于其他方法。当PMA浓度为50μmol/L,暗孵育5 min并曝光15 min时,此条件能够有效区分死活菌。该方法的定量限为8.07×10^(3)CFU/mL。特异性和适用性验证结果表明,所建立的PMA-qPCR方法特异性较好,能够在复合益生菌产品中精确测定L.paracasei的活菌数,并能有效识别未标示添加量的样品中是否存在活性L.paracasei。该方法为复合益生菌产品的质量控制和行业标准化提供了可靠的技术支持,为益生菌产品的质量监管提供了新的技术选择。 展开更多

关键词 副干酪乳酪杆菌 活菌定量 pma-qpcr技术 复合益生菌产品 质量控制

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黄瓜细菌性角斑病PMA-qPCR检测方法的建立和应用 被引量：8

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作者 孔维文 李云龙 +4 位作者 王敬琦 刘婷婷 陈南 金一 何晓青 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期70-75,共6页

黄瓜细菌性角斑病为黄瓜常见的一种细菌病害,其致病菌为丁香假单胞菌黄瓜致病型。目前该病在全球范围内已经造成严重的经济损失。针对于PMA染料能够区分细胞死活的特性将其与荧光定量PCR技术结合。(1)通过比对分析Gen Bank中该菌种不同... 黄瓜细菌性角斑病为黄瓜常见的一种细菌病害,其致病菌为丁香假单胞菌黄瓜致病型。目前该病在全球范围内已经造成严重的经济损失。针对于PMA染料能够区分细胞死活的特性将其与荧光定量PCR技术结合。(1)通过比对分析Gen Bank中该菌种不同株的gap1基因序列,找出gap1基因的保守区并根据保守区基因序列设计了一对特异性引物Dxf1和Dxr1,以其他5种非丁香假单胞菌基因组为模板进行实时定量PCR扩增,只有丁香假单胞菌有扩增曲线,证明引物非常特异。(2)以gap1基因为目的基因构建其克隆载体,将克隆载体导入到大肠杆菌感受态细胞中进行培养,使其大量复制。再将质粒提取,以提取的质粒作为标准品,根据其浓度将其稀释为5×101-5×107 7个梯度绘制标准曲线,获得的扩增效率为96.6%,并做组内重复和组间重复,变异系数均在2%内,证明标准曲线重复性良好。(3)将构建好的方法用于实际样品的检测,得到的Ct值为27.99,根据标准曲线所得的起始模板与Ct值之间的线性关系公式,检测到100 mg患病叶片中含有的菌体为7.69×102拷贝。研究表明,该方法可以快速鉴定并检测实际样品中的活的致病菌的数量,为黄瓜细菌性角斑病的防控提供技术支持。 展开更多

关键词 黄瓜细菌性角斑病 pma-qpcr 丁香假单胞菌 检测 有活力菌体

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不同诱导条件下的VBNC状态副溶血弧菌的PMA-qPCR定量检测及其呼吸活性分析 被引量：3

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作者 刘羽霏 方祥 +2 位作者 廖振林 王丽 钟青萍 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2017年第20期215-221,共7页

定量检测不同诱导条件下的活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态副溶血弧菌的变化情况,并对VBNC菌的呼吸活性进行分析。采用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与荧光定量聚合酶链式反应(fluorescence quantitative po... 定量检测不同诱导条件下的活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态副溶血弧菌的变化情况,并对VBNC菌的呼吸活性进行分析。采用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与荧光定量聚合酶链式反应(fluorescence quantitative polymerase chain reaction,q PCR)结合的技术(PMA-q PCR)定量检测副溶血弧菌活菌数。结合激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪优化传统CTC(5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride)呼吸检测法对VBNC状态的副溶血弧菌进行分析。结果表明PMA-q PCR检测技术结合平板计数的方法,可用于定量检测副溶血弧菌诱导过程中活菌数和可培养菌数的变化情况,并利用差值测定出VBNC细胞的浓度。在不同的温度、Na Cl含量和氯霉素含量的诱导条件下,副溶血弧菌在其中的7种条件下在60 d内进入了VBNC状态。VBNC细胞终浓度最低为5.75×10~2 CFU/m L,最高为1.70×10~5 CFU/m L。在细胞呼吸实验中,采用CTC与4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)双染法能在激光扫描共聚焦显微镜下清晰地观察到VBNC细胞表面的红色荧光,有效区分死活细胞。同时利用流式细胞仪能够根据荧光强度快速区分呼吸活性呈阴性和阳性的细胞。本研究为VBNC细菌的检测和生理特性的研究提供了新的思路和依据。 展开更多

关键词 副溶血弧菌 活的非可培养(VBNC)状态 pma-qpcr 流式细胞仪 激光扫描共聚焦显微镜

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橡胶树白粉病PMA-qPCR检测体系及应用 被引量：4

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作者 官鑫 涂敏 +3 位作者 蔡海滨 王云月 曾霞 胡彦师 《广东农业科学》 CAS 2022年第5期102-109,共8页

【目的】橡胶树白粉病是迄今为止我国橡胶树最重要的叶部病害,通过将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量PCR技术(qPCR)相结合,构建橡胶树白粉病PMA-qPCR检测体系,为及时高效检测橡胶树白粉菌分生孢子活菌量提供技术支撑。【方法】根据橡... 【目的】橡胶树白粉病是迄今为止我国橡胶树最重要的叶部病害,通过将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量PCR技术(qPCR)相结合,构建橡胶树白粉病PMA-qPCR检测体系,为及时高效检测橡胶树白粉菌分生孢子活菌量提供技术支撑。【方法】根据橡胶树白粉菌核糖体内转录间隔区(ITS)序列保守区设计引物,验证其特异性,以该菌重组质粒pMD-19T-Eq绘制标准曲线,建立橡胶树白粉病PMA-qPCR检测体系,对其重复性和灵敏度进行评价,并运用该体系对丙环唑处理橡胶树白粉病病叶后的活菌数进行检测。【结果】研究设计的引物特异性良好,构建的橡胶树白粉菌qPCR标准曲线循环阈值(Ct)与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.9981,扩增效率为107.97%。PMA-qPCR对活孢子悬浮液扩增几乎无影响,检测灵敏度为4.77×10^(2) copies/μL。在丙环唑处理橡胶树白粉病15 min后,活菌比例从66.13%下降至23.18%。【结论】PMA-qPCR检测体系能快速定量检测橡胶树白粉病活菌量,具有灵敏、准确和高效的优点,为该病害的预测预报及防治效果提供理论依据和技术手段。 展开更多

关键词 橡胶树 白粉病 pma-qpcr技术 分生孢子 丙环唑

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PMA-qPCR快速检测结核活菌方法的建立 被引量：4

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作者 温书香 王慧勤 +7 位作者 曹旭东 赵新霞 李亚 张亚丽 陈鹏博 纪太旺 陈创夫 袁莉 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2014年第2期143-147,共5页

为建立快速鉴别诊断结核活/死菌的方法,本研究应用PMA染料与实时定量PCR技术结合(PMA-qPCR),以结核标准株16 sRNA基因为靶基因,PMA对样品基因组提取物进行处理,PMA能够与死细胞DNA分子共价交联并抑制DNA分子扩增。结果显示:PMA浓度在3μ... 为建立快速鉴别诊断结核活/死菌的方法,本研究应用PMA染料与实时定量PCR技术结合(PMA-qPCR),以结核标准株16 sRNA基因为靶基因,PMA对样品基因组提取物进行处理,PMA能够与死细胞DNA分子共价交联并抑制DNA分子扩增。结果显示:PMA浓度在3μg/mL,曝光时间大于15 min时,PMA既不影响活菌的的扩增,又能有效抑制死菌的扩增;当PMA浓度大于20μg/mL时,PMA影响活菌DNA的扩增;PMA-qPCR技术能够定量不同比例的结核活/死菌悬液中的活菌。结论:PMA-qPCR技术能够快速准确检测出结核杆菌中的活细胞。 展开更多

关键词 叠氮溴化丙锭(PMA) pma-qpcr技术 活 死菌

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3种死菌悬液制备方法对PMA-qPCR结果的影响 被引量：2

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作者 王慧党 温书香 +2 位作者 王慧勤 曹旭东 陈创夫 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第12期15-19,共5页

本试验利用热灭活致死法、超声裂解致死法和紫外线照射法3种制备结核分支杆菌死菌悬液的方法,比较不同灭菌方法制备的死菌对PMA-qPCR偶联技术结果的影响,选择结核分支杆菌死菌悬液的最佳制备方法制备后续试验中用到的结核分支杆菌死菌;... 本试验利用热灭活致死法、超声裂解致死法和紫外线照射法3种制备结核分支杆菌死菌悬液的方法,比较不同灭菌方法制备的死菌对PMA-qPCR偶联技术结果的影响,选择结核分支杆菌死菌悬液的最佳制备方法制备后续试验中用到的结核分支杆菌死菌;探索PMA-qPCR偶联技术的适用范围和局限性。结果表明,热灭活法和超声裂解致死法制备的结核分支杆菌死菌悬液影响PMA-qPCR检测的Ct值的变化;紫外线照射法制备的结核分支杆菌死菌悬液对PMA-qPCR检测的Ct值没有影响;热灭活法是制备结核分支杆菌死菌悬液的最佳方法;PMA-qPCR偶联技术不适用于细胞膜无损伤致死法制备死菌的检测。 展开更多

关键词 pma-qpcr偶联技术 热灭活 超声 紫外线照射

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黄瓜白粉病的PMA-qPCR方法建立及应用 被引量：2

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作者 李金婷 张佐然 +3 位作者 梁雅静 孔维文 李云龙 何晓青 《福建农林大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2019年第5期550-555,共6页

鉴于叠氮溴化丙锭(PMA)染料可辨别细菌活性,将其与实时荧光定量PCR(qPCR)相结合,建立PMA-qPCR方法,以检测黄瓜白粉病的活性致病菌.在黄瓜白粉菌核糖体DNA的ITS区设计引物,将扩增片段重组到pGM-Simple-T载体中构建标准质粒.以5×10-5... 鉴于叠氮溴化丙锭(PMA)染料可辨别细菌活性,将其与实时荧光定量PCR(qPCR)相结合,建立PMA-qPCR方法,以检测黄瓜白粉病的活性致病菌.在黄瓜白粉菌核糖体DNA的ITS区设计引物,将扩增片段重组到pGM-Simple-T载体中构建标准质粒.以5×10-5×10^6个??μL^-1 6个梯度稀释质粒来绘制标准曲线,并做组内和组间重复.(1)qPCR标准曲线显示有良好的扩增结果,其相关系数(R2)为0.994.(2)利用qPCR检测臭氧处理后PMA染料处理组和对照组中有活性的黄瓜白粉菌数量.结果显示,PMA染料处理组拷贝数为4.335×10^2个??μL^-1,对照组拷贝数为9.448×10^6个??μL^-1.(3)利用PMA-qPCR方法检测臭氧处理后的黄瓜叶片不同部位(全组织、表面、内部)活菌数占总菌数的比例,处理50 min后的活菌比例分别较处理前下降了58.8%、67.0%、48.0%.这表明该方法可快速鉴定黄瓜白粉病中的活性致病菌数量,为该病的预防和控制提供技术支持. 展开更多

关键词 黄瓜白粉病 pma-qpcr 标准曲线 臭氧处理

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PMA-qPCR方法快速检测活性E.coli O157:H7 被引量：9

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作者 李聪聪 余以刚 +3 位作者 邱杨 李美玲 肖性龙 吴晖 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2012年第22期217-220,共4页

建立将叠氮溴化丙锭(PMA)与定量PCR(qPCR)技术结合,用于检测热灭活菌背景条件下的大肠杆菌活菌的方法。结果表明:5min以上的强烈光照可以使PMA与DNA共价交联,同时完全钝化游离的PMA以避免"假阴性"结果;抑制死菌DNA扩增的最低... 建立将叠氮溴化丙锭(PMA)与定量PCR(qPCR)技术结合,用于检测热灭活菌背景条件下的大肠杆菌活菌的方法。结果表明:5min以上的强烈光照可以使PMA与DNA共价交联,同时完全钝化游离的PMA以避免"假阴性"结果;抑制死菌DNA扩增的最低PMA质量浓度为10μg/mL,不抑制活菌DNA扩增的最高PMA质量浓度为20μg/mL。当活菌/总菌大于1%时,经PMA预处理,可以消除热灭活菌DNA的干扰,实现对活菌的定量检测。 展开更多

关键词 叠氮溴化丙锭 定量PCR 活菌 检测

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乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法的建立 被引量：8

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作者 盖冬雪 任洪林 +9 位作者 卢士英 胡盼 孟宪梅 刘熙 宋德刚 金雯 张嵩 常江 刘艳艳 柳增善 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第2期493-498,共6页

本试验旨在建立一种乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法。优化qPCR检测方法,探究菌浓度为1×108 CFU/mL的大肠杆菌活菌悬液、热致死菌悬液细胞数来确定不同的PMA剂量、暗孵育时间、曝光时间对死菌抑制效果的影响,确定最佳PMA处理... 本试验旨在建立一种乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法。优化qPCR检测方法,探究菌浓度为1×108 CFU/mL的大肠杆菌活菌悬液、热致死菌悬液细胞数来确定不同的PMA剂量、暗孵育时间、曝光时间对死菌抑制效果的影响,确定最佳PMA处理方案。结果表明,qPCR检测可特异性扩增大肠杆菌,1×108 CFU/mL的大肠杆菌经90℃水浴30s全部致死后,采用10μg/mL的PMA暗孵育15min后冰上曝光10min为最佳处理方案,这种处理方案可最大程度抑制死细胞信号,而对活细胞几乎没有影响,样品中微生物初始浓度不低于1×108 CFU/mL时较稳定,得到标准曲线回归方程y=-3.356x+47.413,R2=0.9989,最低检测限为103 CFU/mL,加标样本检测结果与实际相符。该方法为利用PMA-qPCR检测食品中的活大肠杆菌杆菌奠定了基础。 展开更多

关键词 大肠杆菌 叠氮溴化丙啶 qPCR 计数

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PMA-qPCR方法检测陕西猕猴桃溃疡菌优势病原菌活菌的研究 被引量：8

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作者 肖妍 刘芸宏 +4 位作者 高贵田 曹凡 马燕萍 赵武奇 雷玉山 《食品与机械》 北大核心 2019年第4期48-53,59,共7页

将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量(qPCR)相结合定量检测陕西猕猴桃溃疡菌优势病原菌(Psa)活菌的数量。通过优化PMA最佳浓度、暗孵育时间、曝光时间,确定PMA-qPCR区别溃疡菌活、死菌的最佳条件。结果表明,Psa经98.3℃沸水浴处理13min... 将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量(qPCR)相结合定量检测陕西猕猴桃溃疡菌优势病原菌(Psa)活菌的数量。通过优化PMA最佳浓度、暗孵育时间、曝光时间,确定PMA-qPCR区别溃疡菌活、死菌的最佳条件。结果表明,Psa经98.3℃沸水浴处理13min可完全致死,Psa死菌浓度为1×10^7 CFU/mL时PMA与死菌共价交联的最佳浓度为105μg/mL,最佳暗育时间为8min,最佳曝光时间为20min,在此条件下死菌DNA无扩增,而对活菌DNA扩增无影响;Psa质粒标准品建立的线性回归方程为Y=-3.220 4x+37.73,R2=0.9955,最低可检出6.39×10^2拷贝/μL的溃疡菌;建立的PMA-qPCR方法最低可检出2.38×10^2拷贝/μL的溃疡菌;采用人工染菌枝条样品的最低检出限为6.30×10^4 CFU/mL,与菌落计数检测结果相符。 展开更多

关键词 PMA qPCR 猕猴桃溃疡菌 活菌检测

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乳品中的酵母活菌数PMA-qPCR检测方法的建立及初步应用 被引量：4

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作者 李畅 赵柯 +11 位作者 常江 张嵩 李萌 关玉婷 孟宪梅 柳增善 胡盼 任洪林 卢士英 李岩松 孙宇 刘熙 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2018年第22期128-132,共5页

本实验旨在对乳品中酵母菌活菌总数进行准确的定量检测,深入研究PMA处理乳品中酵母热损伤菌的最佳工作条件,去除热损伤死菌DNA的影响。针对从乳品中分离的三株酵母菌26S rDNA D1/D2区域序列设计引物Y3和Y4,运用实时荧定定量PCR进行序列... 本实验旨在对乳品中酵母菌活菌总数进行准确的定量检测,深入研究PMA处理乳品中酵母热损伤菌的最佳工作条件,去除热损伤死菌DNA的影响。针对从乳品中分离的三株酵母菌26S rDNA D1/D2区域序列设计引物Y3和Y4,运用实时荧定定量PCR进行序列扩增,以重组质粒pMD-18T-26S拷贝数对数与扩增循环数(Ct)值为坐标轴建立标准曲线,建立PMA-qPCR检测方法,并对实际样品中的酵母菌活菌富集后进行数量检测。PMA-q PCR法可达到国标规定的食品中酵母菌最高限量值1×10~2CFU/mL的检测标准,对应Ct值为36.67±0.43,重复性良好,总耗时6～7 h,可对酵母菌数量进行准确和快速的定量分析,为乳品中腐败微生物的鉴定与监控提供有价值的借鉴。 展开更多

关键词 乳品 PMA qPCR 酵母活菌计数

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PMA-qPCR定量检测青枯菌活菌方法的建立

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作者 王帅 徐进 +2 位作者 许景升 张昊 冯洁 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期122-128,135,共8页

本文将叠氮溴化丙锭(PMA)与荧光实时定量PCR技术相结合,建立了一种适于青枯菌不同小种菌株活细胞精准、快速检测的PMA-qPCR方法。通过单因素变化试验对PMA预处理反应体系中的各参数进行优化,确立了PMA终浓度为15 ng/μL,黑暗孵育时间为1... 本文将叠氮溴化丙锭(PMA)与荧光实时定量PCR技术相结合,建立了一种适于青枯菌不同小种菌株活细胞精准、快速检测的PMA-qPCR方法。通过单因素变化试验对PMA预处理反应体系中的各参数进行优化,确立了PMA终浓度为15 ng/μL,黑暗孵育时间为10 min,曝光时间为5 min的PMA预处理体系。试验结果表明,当活菌比例大于10%,PMA-qPCR的测定结果均在理论活菌数相对应的95%置信区间内。检测灵敏度测试结果显示,该方法适用于活菌数在5.0×10^(2)~5.0×10^(8)cfu/mL范围内菌悬液的检测。本文建立的PMA-qPCR方法可在一定范围内有效去除青枯菌死菌的干扰,定量检测出活菌数量,研究结果可为植物细菌性青枯病的流行规律研究提供新的技术支撑。 展开更多

关键词 pma-qpcr 青枯菌 活菌检测

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食品中乳酸菌定量检测方法研究进展 被引量：17

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作者 刘艳容 舒永红 +2 位作者 杨佳玮 顾慧丹 杨瑶 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2020年第12期358-365,共8页

目前,乳酸菌发酵剂因其益生作用在乳制品生产中广泛应用。由于乳酸菌活菌数量是重要的指标,因此对乳酸菌活菌的定量检测已然成为产品质量和功能评价的一项重要工作。本文就食品中乳酸菌的定量检测方法展开综述,详细介绍了平板菌落计数... 目前,乳酸菌发酵剂因其益生作用在乳制品生产中广泛应用。由于乳酸菌活菌数量是重要的指标,因此对乳酸菌活菌的定量检测已然成为产品质量和功能评价的一项重要工作。本文就食品中乳酸菌的定量检测方法展开综述,详细介绍了平板菌落计数法、流式细胞术、荧光定量PCR法的检测原理、关键影响因素和研究进展,重点阐述了PMA结合荧光定量PCR法的优势和技术难点以及数字PCR法的前景和可行性,为推动食品中乳酸菌定量检测技术的进步提供了参考。 展开更多

关键词 乳酸菌 定量检测 活菌计数 pma-qpcr 数字PCR

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叠氮溴化丙锭结合实时荧光定量PCR技术检测发酵乳中植物乳杆菌P-8活菌数 被引量：8

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作者 韩之皓 郭帅 +5 位作者 黄天 郑岩 王月娇 白梅 王记成 张和平 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期183-189,共7页

采用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)结合实时荧光定量PCR对乳制品中活菌DNA进行定量分析,建立一种快速而准确检测发酵乳品中植物乳杆菌P-8(Lactobacillus plantarum P-8)活菌数的新方法。通过对影响PMA作用的浓度、暗孵育和曝... 采用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)结合实时荧光定量PCR对乳制品中活菌DNA进行定量分析,建立一种快速而准确检测发酵乳品中植物乳杆菌P-8(Lactobacillus plantarum P-8)活菌数的新方法。通过对影响PMA作用的浓度、暗孵育和曝光时间等因素进行试验,确定最佳PMA处理方案。结果表明:L. plantarum P-8经80℃处理60 s,即为膜损伤菌;当PMA质量浓度为40μg/m L,暗孵育时间10 min,曝光时间为20 min时,PMA既不影响活菌DNA的PCR扩增,又能渗透进入细胞膜受损的死菌并抑制其PCR扩增;通过制备L.plantarum P-8质粒标准品并建立标准曲线,其表现出良好的线性关系,相关系数(R2)为0. 992 9,最低检测限为103CFU/m L,特异性良好。该方法为完善发酵乳产品益生菌活菌数的检测奠定了基础。 展开更多

关键词 植物乳杆菌 叠氮溴化丙锭(propidium monoazide PMA) 实时荧光定量PCR

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叠氮溴化丙锭结合荧光定量PCR测定布鲁氏菌活菌数方法的建立 被引量：3

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作者 张士军 常恒祯 +9 位作者 王路鹿 翟菲菲 鞠丹迪 胡盼 卢士英 李岩松 周玉 柳增善 李兆辉 任洪林 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期352-359,共8页

为简便、快速测定宿主体内或细胞内布鲁氏菌的活菌数,本研究以布鲁氏菌单拷贝bcsp31基因为检测靶标,设计特异性引物,经优化反应条件及叠氮溴化丙锭(PMA)最佳使用浓度与曝光时间,建立了一种测定布鲁氏菌活菌数的叠氮溴化丙锭--荧光定量PC... 为简便、快速测定宿主体内或细胞内布鲁氏菌的活菌数,本研究以布鲁氏菌单拷贝bcsp31基因为检测靶标,设计特异性引物,经优化反应条件及叠氮溴化丙锭(PMA)最佳使用浓度与曝光时间,建立了一种测定布鲁氏菌活菌数的叠氮溴化丙锭--荧光定量PCR方法(PMA-qPCR),并评估了该方法的特异性、敏感性、重复性。结果显示,建立的qPCR标准曲线Ct值与质粒标准品拷贝数对数值之间线性关系良好;特异性试验结果显示,该方法对布鲁氏菌S2株扩增结果为阳性,对大肠杆菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶氏菌、副溶血弧菌扩增结果均为阴性;其对布鲁氏菌S2的检测限为10~3cfu/mL,比常规PCR方法敏感性高100倍;重复性试验结果显示,批间及批内重复试验的变异系数均为0.63%~2.04%,重复性好。利用该方法对不同比例布鲁氏菌S2活菌/死菌混合样品定量测定,结果显示随活菌比例的增大,测得的活菌数与常规qPCR测定值越接近,表明经优化处理的PMA有效抑制了qPCR对死菌DNA的扩增,但对活菌的qPCR扩增无影响。将该方法与平板计数法共同测定TSB纯培养的布鲁氏菌S2活菌数,结果二者的测定值无统计学差异。随后利用这两种方法同时测定两种不同浓度的S2侵染巨噬细胞后的胞内活菌数,结果显示两种方法测定值虽然均差异显著(p<0.05),但测得的活菌数均在一个数量级且变化趋势一致,并均与侵染的活菌数呈正相关。上述结果表明,本研究建立的PMA-qPCR检测方法可以对布鲁氏菌活菌实现快速定量检测,为布鲁氏菌活菌数测定相关研究提供可行技术。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 bcsp31 叠氮溴化丙锭(PMA) 荧光定量PCR 标准曲线

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