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基于PiggyBac转座子优化稳定表达细胞系的新型瞬时受体电位M2通道抑制剂筛选
1
作者 应凯悦 华宁 +3 位作者 骆燕萍 刘星宇 刘敏 杨巍 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期604-614,共11页
目的:使用PiggyBac(PB)转座系统建立稳定表达瞬时受体电位M2(TRPM2)通道的人胚胎肾细胞HEK293T,并进行TRPM2通道抑制剂筛选,为治疗脑缺血等疾病寻找潜在的药物。方法:根据PB转座原理,构建pPB-hTRPM2真核表达载体。将重组质粒和辅助质粒... 目的:使用PiggyBac(PB)转座系统建立稳定表达瞬时受体电位M2(TRPM2)通道的人胚胎肾细胞HEK293T,并进行TRPM2通道抑制剂筛选,为治疗脑缺血等疾病寻找潜在的药物。方法:根据PB转座原理,构建pPB-hTRPM2真核表达载体。将重组质粒和辅助质粒共同转染至HEK293T细胞中,利用系统携带的荧光与膜片钳鉴定TRPM2基因表达,通过Z'因子评估细胞模型是否适用于钙成像法的高通量筛选。利用钙成像法和膜片钳对11个先导化合物分子进行初步活性评价,测定化合物分子对TRPM2通道的抑制活性。利用氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)损伤模型和细胞计数试剂盒8(CCK-8)方法验证筛选得到的化合物分子对损伤细胞的保护作用。利用流式细胞术检测细胞活性氧水平。利用小鼠短暂性大脑中动脉栓塞(tMCAO)模型评价化合物的神经保护作用。结果:成功构建pPB-hTRPM2真核表达载体,构建出可高效表达TRPM2基因的HEK293T细胞系,并同时表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。在筛选获得的嘌呤霉素抗性细胞中,所有细胞荧光明亮可见,诱导后细胞表现出经典的TRPM2通道电流特征,TRPM2通道电流值与瞬时转染对照组差异无统计学意义(P>0.05)。该筛选系统进行钙成像实验的Z'因子为0.5416,表明其适用于高通量筛选。通过钙成像法结合膜片钳筛选出化合物6,其具有显著的TRPM2通道抑制作用,且1.0μmol/L的化合物6能够显著提高OGD/R后SH-SY5Y细胞的存活率(P<0.05),降低活性氧水平(P<0.05),0.3、1.0 mg/kg的化合物6能降低tMCAO小鼠脑梗死体积百分比(均P<0.05)。结论:利用PiggyBac基因编辑技术成功构建了TRPM2基因稳定表达细胞系,利用钙成像法和膜片钳在候选化合物中成功筛选出一个高亲和力的新的TRPM2通道抑制剂。该抑制剂可以通过降低细胞活性氧水平缓解OGD/R后细胞损伤,并对小鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用。 展开更多
关键词 piggybac转座系统 瞬时受体电位M2型 高通量筛选 膜片钳 氧糖剥夺/再灌注损伤 短暂性大脑中动脉栓塞 小鼠
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piggyBac转座子介导的家蚕细胞转基因研究初探 被引量：10
2
作者 周文林 王崇龙 +4 位作者 刘波 曹广力 薛仁宇 沈卫德 贡成良 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期30-35,共6页
为探讨稳定转化家蚕细胞表达外源基因的新方法,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)极早期蛋白基因(ie-1)启动子元件驱动新霉素抗性基因(neor),并克隆至具有绿色荧光蛋白基因(gfp)标记的昆虫转座子载体piggyBac中,构建转基因载体pigA3-IE-Neo... 为探讨稳定转化家蚕细胞表达外源基因的新方法,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)极早期蛋白基因(ie-1)启动子元件驱动新霉素抗性基因(neor),并克隆至具有绿色荧光蛋白基因(gfp)标记的昆虫转座子载体piggyBac中,构建转基因载体pigA3-IE-Neo。以该载体转染家蚕BmN细胞,用终浓度800μg/mL的遗传霉素(geneticin,G418)筛选3个月,获得了稳定转化的细胞,呈现绿色荧光的细胞数达80%以上。通过PCR鉴定证实了细胞基因组DNA中neor基因和gfp基因的存在。 展开更多
关键词 转基因 家蚕 piggybac转座子 家蚕细胞
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A3启动子缺陷piggyBac转座子在家蚕中的转基因研究 被引量：5
3
作者 杨惠娟 庄兰芳 +4 位作者 范伟 兰天云 丁农 陆长德 钟伯雄 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期41-44,共4页
构建了A3启动子缺陷piggyBac转座质粒,以增强型绿色荧光蛋白基因EGFP为标记基因对家蚕品种N is-tari进行转基因实验,发现其具有较高的表达EGFP的转化效率,G0代中EGFP阳性蛾区检出占总注射蚕卵的比率达0.618%,且EGFP的表达呈组织特异性。... 构建了A3启动子缺陷piggyBac转座质粒,以增强型绿色荧光蛋白基因EGFP为标记基因对家蚕品种N is-tari进行转基因实验,发现其具有较高的表达EGFP的转化效率,G0代中EGFP阳性蛾区检出占总注射蚕卵的比率达0.618%,且EGFP的表达呈组织特异性。PCR实验分析也证实了标记基因的成功导入。该实验中标记基因及转基因阳性个体均易于检出,为启动子缺陷转基因方法在家蚕组织特异性启动子筛选研究上的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 家蚕 转基因 启动子缺陷 piggybac转座子
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piggyBac转座子应用研究进展 被引量：7
4
作者 杨欢欢 魏峰 刘全 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第12期91-94,共4页
piggyBac转座子是来源于鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的DNA型转座子。目前piggyBac转座子已成为在昆虫中应用最广泛的转座子之一。近年来国内外研究者更将其应用领域拓宽到了鱼类,寄生虫和哺乳动物等转基因研究中。随着对piggy... piggyBac转座子是来源于鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的DNA型转座子。目前piggyBac转座子已成为在昆虫中应用最广泛的转座子之一。近年来国内外研究者更将其应用领域拓宽到了鱼类,寄生虫和哺乳动物等转基因研究中。随着对piggyBac转座子功能和分布的深入认识,piggyBac转座子将更多应用于基因功能研究,基因治疗,转座子介导的细胞系基因诱变及基因工程蛋白表达等基础研究和应用研究中。 展开更多
关键词 piggybac转座子 转基因 应用
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piggyBac转座子介导的牛A-FABP表达载体的构建与鉴定 被引量：2
5
作者 杨宁 昝林森 +2 位作者 成功 付常振 李耀坤 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2013年第9期8-14,20,共8页
【目的】构建以piggyBac(PB)转座子为载体元件,绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,Neomycin(NEO)为抗性基因,alpha-肌动蛋白(α-actin)为启动子的A-FABP基因特异性表达载体pPB-AFABP,并验证其转座活性。【方法】通过PCR方法合成PB转座子骨... 【目的】构建以piggyBac(PB)转座子为载体元件,绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,Neomycin(NEO)为抗性基因,alpha-肌动蛋白(α-actin)为启动子的A-FABP基因特异性表达载体pPB-AFABP,并验证其转座活性。【方法】通过PCR方法合成PB转座子骨架序列、NEO-EGFP、α-actin启动子以及A-FABP基因序列,并将各个序列连接构建成转基因载体pPB-AFABP;用脂质体法将供体质粒pPB-AFABP和辅助质粒pCAG-PBase组成的PB二元系统及质粒pPB-AFABP分别转染牛成纤维细胞,通过G418筛选得到转基因细胞。【结果】经过酶切和测序鉴定,载体pPB-AFABP构建正确;PB二元系统的阳性克隆数明显多于转座子载体pPB-AFABP的克隆数;PCR鉴定结果表明,牛成纤维细胞中存在目的基因A-FABP。【结论】成功构建了转基因表达载体pPB-AFABP,且证实PB转座子在牛成纤维细胞中具有较高的转座活性。 展开更多
关键词 piggybac转座子 A-FABP基因 表达载体 牛成纤维细胞
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PiggyBac转座子介导的转FGF5s基因绒山羊胎儿成纤维细胞的制备 被引量：2
6
作者 何晓琳 袁超 +1 位作者 屈雷 陈玉林 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第12期1926-1931,共6页
本研究旨在建立可稳定表达FGF5s的绒山羊胎儿成纤维细胞系。采用RT-PCR方法,从陕北白绒山羊皮肤组织cDNA中克隆FGF5s基因,构建PB转座子介导的真核表达载体PB-EGFP-FGF5s;在脂质体的介导下,将PB-EGFP-FGF5s载体和转座酶载体共转染绒山羊... 本研究旨在建立可稳定表达FGF5s的绒山羊胎儿成纤维细胞系。采用RT-PCR方法,从陕北白绒山羊皮肤组织cDNA中克隆FGF5s基因,构建PB转座子介导的真核表达载体PB-EGFP-FGF5s;在脂质体的介导下,将PB-EGFP-FGF5s载体和转座酶载体共转染绒山羊胎儿成纤维细胞,通过嘌呤霉素进行稳定筛选。并利用PCR和RT-PCR鉴定FGF5s基因在细胞基因组中的整合及表达情况。结果表明,成功克隆了陕北白绒山羊FGF5s基因并构建了PB-EGFP-FGF5s真核表达载体;PCR结果显示,FGF5s已整合到细胞基因组中;RT-PCR结果表明,该基因在转录水平上表达。另外,转染试验表明PB转座子可在绒山羊胎儿成纤维细胞中发生高效转座。本研究为制备绒山羊转基因细胞系提供了一种高效的方法,并为下一步通过核移植方法获得转基因绒山羊奠定了基础。 展开更多
关键词 陕北白绒山羊 FGF5s piggybac转座子 稳定转染
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一种由piggyBac转座子介导高效构建稳定细胞株的策略 被引量：2
7
作者 盛哲津 王亮 +1 位作者 周斌 李利妹 《实验技术与管理》 CAS 北大核心 2021年第3期45-50,共6页
构建稳定细胞株的关键是如何提高外源目的基因插入基因组的效率。piggyBac转座子(简称PB)通过"切离-粘贴"的机制实现在基因组上的转座,其本质是在基因组的不同位点间进行插入。利用PB转座子高效插入基因组的特性,并通过改造... 构建稳定细胞株的关键是如何提高外源目的基因插入基因组的效率。piggyBac转座子(简称PB)通过"切离-粘贴"的机制实现在基因组上的转座,其本质是在基因组的不同位点间进行插入。利用PB转座子高效插入基因组的特性,并通过改造该转座系统,即分别在PB转座酶的3’端和5’端加入核定位信号肽,然后在人源胚胎肾293细胞系中评价改造后的PB转座子介导获得稳定细胞株的能力。结果表明,野生型PBase组的克隆形成率是对照组的6.7倍,3’NLSPBase组比野生型PBase组再提高1.3倍。利用人宫颈癌HeLa细胞进一步验证上述结果。可见,经改造后的PB转座子能够提高外源目的基因插入基因组的效率,实现高效构建稳定细胞株。 展开更多
关键词 piggybac转座子 稳定细胞株 基因组整合
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基于piggyBac转座子系统的西方蜜蜂Rubia基因转移研究 被引量：1
8
作者 柯俐 胡小芬 +2 位作者 王子龙 曾志将 何旭江 《江西农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期1042-1047,共6页
为探讨piggy Bac载体在西方蜜蜂(Apis mellifera)中的基因转移功能,并检测其可行性,研究以西方蜜蜂为实验材料,利用piggy Bac转座子系统将外源性Rubia红色荧光蛋白基因转移至西方蜜蜂受精卵中,分析检测外源基因的整合与荧光表达情况。PC... 为探讨piggy Bac载体在西方蜜蜂(Apis mellifera)中的基因转移功能,并检测其可行性,研究以西方蜜蜂为实验材料,利用piggy Bac转座子系统将外源性Rubia红色荧光蛋白基因转移至西方蜜蜂受精卵中,分析检测外源基因的整合与荧光表达情况。PCR扩增和测序分析结果显示piggy Bac转座子能够将外源性Rubia红色荧光蛋白基因整合到蜜蜂基因组上,且在显微注射组中检测到微弱的红色荧光蛋白表达。本研究证实piggy Bac转座子系统可将外源性基因植入蜜蜂基因组。为今后的蜜蜂转基因基础研究和分子育种技术开发提供支撑。 展开更多
关键词 piggybac转座子 Rubia 西方蜜蜂 基因转移 显微注射
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绵羊高效转基因通用型piggyBac转座子载体构建及功能验证 被引量：1
9
作者 胡广东 郝科兴 +3 位作者 黄涛 曾维斌 谷新利 王静 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期647-656,共10页
piggy Bac(PB)是一种能在多种动物细胞中进行转座的DNA转座子,作为一种转基因工具已被广泛应用于各种哺乳动物转基因研究中。针对不同物种对PB转座子进行改造,是提升其通用性的必要手段。为构建基于绵羊细胞进行转基因操作的通用型PB转... piggy Bac(PB)是一种能在多种动物细胞中进行转座的DNA转座子,作为一种转基因工具已被广泛应用于各种哺乳动物转基因研究中。针对不同物种对PB转座子进行改造,是提升其通用性的必要手段。为构建基于绵羊细胞进行转基因操作的通用型PB转座子载体,本研究对PB转座酶(PBase)基因进行绵羊密码子偏好性优化并将其克隆到p BNW-TP1载体中,成功构建了PB转座子载体p BNW-TP2。将p BNW-TP2转染到绵羊成纤维细胞和乳腺上皮细胞中,利用G418筛选获取稳定转染细胞株;利用Tail-PCR检测稳定转染细胞株的PB转座位点,对细胞阳性克隆进行亚甲蓝染色;利用非配对t检验确认其转座效率。结果表明,p BNW-TP2成功介导了绵羊成纤维细胞和乳腺上皮细胞转基因阳性细胞株的生产;PB转座位点检测表明p BNW-TP2能特异性整合到绵羊基因组TTAA位点,其整合位点倾向于功能基因间;亚甲蓝染色统计分析结果提示p BNW-TP2介导的转基因效率显著提升。本研究成功构建了绵羊通用型PB转座子载体p BNW-TP2,并在绵羊体细胞中对其特性进行验证和分析,为PB转座子在绵羊体细胞中开展转基因相关研究提供了科学依据。 展开更多
关键词 piggybac转座子 转座酶 转基因 绵羊成纤维细胞 绵羊乳腺上皮细胞
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piggyBac转座子介导HepG2细胞不同亚型药物代谢酶稳定共表达方法比较 被引量：1
10
作者 庞士慧 钟国瑞 +5 位作者 谢水林 李浩健 邹淑香 贾英 戴仁科 黄黎珍 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期125-134,共10页
目的在piggy Bac(PB)转座子介导下,探索在HepG2细胞中实现多个药物代谢酶稳定共表达的策略,为建立体外药物代谢和肝毒性研究的理想细胞模型奠定基础。方法首先选择3种目前针对大片段DNA使用较广的转染方法:Lipofectamine~?LTX,Gen Jet^(... 目的在piggy Bac(PB)转座子介导下,探索在HepG2细胞中实现多个药物代谢酶稳定共表达的策略,为建立体外药物代谢和肝毒性研究的理想细胞模型奠定基础。方法首先选择3种目前针对大片段DNA使用较广的转染方法:Lipofectamine~?LTX,Gen Jet^(TM)(Ver.Ⅱ)和Neon~?Transfection System,分别转染N端标记增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N2)和2A串联重组细胞色素3A4(CYP3A4)和CYP2C19的PB转座子质粒(pPB-CYP3A4-2A-2C19)至HepG2细胞,48 h后比较不同方法的转染效率和细胞毒性,确立高效低毒的HepG2细胞转染方法。然后选择该法进行转染,将设计的3组PB重组转座子:单基因转座子(PB-CYP3A4)、2A串联多基因转座子(PB-CYP3A4-2A-2C19)、多个单基因转座子混合物[PB-CYP3A4,PB-CYP2C8,PB-CYP2A6,有机阴离子转运多肽1B1的PB转座子(PB-OATP1B1)]分别转染HepG2细胞,利用嘌呤霉素和GFP进行单克隆细胞筛选:挑选具有抗性且表达GFP的细胞单克隆并进行扩大培养,采用实时荧光定量PCR、Western蛋白质印迹和高效液相色谱-串联质谱联用法分别检测各组药物代谢酶m RNA、蛋白质水平及酶活性,并进行统计分析。结果 3种转染方法比较发现,Gen Jet^(TM)法的转染效率显著高于其他2种(P<0.01),介导pEGFP-N2和pPB-CYP3A4-2A-2C19的转染效率分别高达(94.2±2.5)%和(89.3±3.3)%,且该法具有较低的细胞毒性。因此选择Gen Jet^(TM)法进行后续PB转座子转染。分别转染3组PB重组转座子发现,单个转座子PB-CYP3A4和PB-CYP3A4-2A-2C19转染后,筛选获得的抗性细胞克隆中各个药物代谢酶在m RNA、蛋白质及活性水平均显著提高,其中2A可实现CYP3A4和CYP2C19药物代谢酶协同稳定表达;而多个转座子混合共转染细胞中,仅有随机几个基因表达;且各药物代谢酶基因的表达不均衡,仅CYP3A4药物代谢酶基因在单克隆细胞中表达水平明显升高。结论 Gen Jet^(TM)法可成为PB重组转座子转染HepG2细胞的有效方法。PB转座子可介导基因稳定表达;但在实现多基因共表达时,与病毒载体法不同,理论上可行的PB多转座子共转染方法其基因表达效率下降,且各基因表达不均衡。相比之下,应用2A串联多个基因串联重组PB单转座子可实现各基因稳定表达。 展开更多
关键词 piggybac转座子 HEPG2细胞 药物代谢酶 多基因共表达
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酿酒酵母中PiggyBac转座子筛选系统的构建 被引量：1
11
作者 周林希 柳艺石 +3 位作者 赵神保 张慧杰 高晓冬 藤田盛久 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期15-22,共8页
PiggyBac(PB)是来源于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的TTAA型转座子。PB转座子系统可作为一种插入型突变工具,应用于多种真核细胞中。本研究在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中构建了一个基于PB转座子的筛选系统。系统由插入ADE2基因... PiggyBac(PB)是来源于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的TTAA型转座子。PB转座子系统可作为一种插入型突变工具,应用于多种真核细胞中。本研究在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中构建了一个基于PB转座子的筛选系统。系统由插入ADE2基因编码框的PB转座子及由半乳糖启动子调控表达的PB转座酶(PBase)两部分组成。在PBase诱导下,PB转座子可以从原始位点无痕移除并随机插入新的基因位点。PB转座子在转座过程中保持单一拷贝数,在每个突变细胞中只有一个插入位点,并可快速检测突变基因。实验结果表明:所构建的PB转座子筛选系统可应用于酿酒酵母中的基因筛选。 展开更多
关键词 酿酒酵母 piggybac转座子 基因筛选
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piggyBac转座子在牛基因组的整合位点及特征分析 被引量：6
12
作者 杜新华 高雪 +3 位作者 张路培 高会江 李俊雅 许尚忠 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期771-777,共7页
piggyBac(PB)转座子作为一种遗传工具被广泛应用于多个物种的转基因及插入突变研究,目前PB转座子在牛中的相关研究还较少。为了获得PB转座子在牛基因组中的整合位点,总结其转座特征,文章构建了PB[CMV-EGFP]和pcDNA-PBase二元转座系统,... piggyBac(PB)转座子作为一种遗传工具被广泛应用于多个物种的转基因及插入突变研究,目前PB转座子在牛中的相关研究还较少。为了获得PB转座子在牛基因组中的整合位点,总结其转座特征,文章构建了PB[CMV-EGFP]和pcDNA-PBase二元转座系统,利用细胞核电转技术共转染牛耳组织成纤维细胞,经G-418筛选,获得了稳定转染EGFP的转基因细胞系;提取细胞基因组DNA,利用基因组步移技术扩增PB转座子5′Bac区插入位置的DNA序列;通过与牛基因组序列进行BLAST比对,得到PB转座子在牛基因组中的插入位点。文章共获得了8个有效的整合位点,但仅有5个位点定位到染色体1、2、11和X染色体上。序列分析表明:在牛基因组中,PB转座子可特异性的插入到"TTAA"位置,并整合到基因间的非调控区;分析整合位点"TTAA"相邻一侧的5个碱基组成,发现PB转座子5′端倾向于插入到GC(62.5%)碱基富集区。该研究表明,PB转座子可以在牛基因组中发生转座,获得的整合位点信息为利用PB转座子在牛上开展遗传学研究提供了理论参考。 展开更多
关键词 piggybac 转基因 牛基因组 整合位点
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基于piggyBac转座子转hGM-CSF基因家蚕的研究 被引量：17
13
作者 曹广力 薛仁宇 +3 位作者 何泽 郑小坚 沈卫德 贡成良 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期324-327,447,共5页
将由家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子控制下的hGM-CSF基因克隆到p igA3GFP载体中,构建了家蚕转基因载体p igA3GFP[IE-GMCSF],利用压力渗透法和精子介导法将其与辅助质粒helper p igA3一起导入家蚕蚕卵,获得产生绿色荧光的家蚕,次代产... 将由家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子控制下的hGM-CSF基因克隆到p igA3GFP载体中,构建了家蚕转基因载体p igA3GFP[IE-GMCSF],利用压力渗透法和精子介导法将其与辅助质粒helper p igA3一起导入家蚕蚕卵,获得产生绿色荧光的家蚕,次代产生荧光蚕的比例分别为0.17%,0.15%。将次代荧光蚕与正常蚕交配后代(G1)的荧光蚕个体再相互杂交,连续进行多代选育,获得了稳定遗传的转hGM-CSF基因家蚕品系。 展开更多
关键词 piggybac因子 转基因家蚕 人类粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 IE-1启动子 精子介导法
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piggyBac转座子AgoPLE1.1在黑腹果蝇种系转化中的应用
14
作者 张浩淼 王晓芳 +4 位作者 罗光华 韩湘豫 王秋霞 韩召军 吴敏 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第6期676-681,共6页
【目的】通过检测黑腹果蝇Drosophila melanogaster中piggyBac(PB)转座子AgoPLE1.1的转化活性,明确AgoPLE1.1开发为昆虫转基因载体的潜力。【方法】构建AgoPLE1.1转座酶辅助质粒pAgoHsp和带有红色荧光标记的供体质粒pXLAgo-PUbDsRed,辅... 【目的】通过检测黑腹果蝇Drosophila melanogaster中piggyBac(PB)转座子AgoPLE1.1的转化活性,明确AgoPLE1.1开发为昆虫转基因载体的潜力。【方法】构建AgoPLE1.1转座酶辅助质粒pAgoHsp和带有红色荧光标记的供体质粒pXLAgo-PUbDsRed,辅助质粒和供体质粒以170 ng/μL∶400 ng/μL,90 ng/μL∶200 ng/μL和90 ng/μL∶100 ng/μL 3种不同的比例混合后分别注射新鲜的W1118黑腹果蝇胚胎,筛选注射后代中的转基因黑腹果蝇个体;利用Southern杂交验证转基因黑腹果蝇中AgoPLE1.1转座子的插入拷贝数;利用染色体步移技术克隆AgoPLE1.1插入位点旁侧序列,明确AgoPLE1.1转座子的转座特征。【结果】AgoPLE1.1转座子在黑腹果蝇中具有转化活性,转基因频率为1.32%~1.94%。Southern杂交结果显示,AgoPLE1.1转座子在黑腹果蝇中至少有6个插入位点。染色体步移法克隆了其中4个位点,分别位于黑腹果蝇的3R,3L,2L和X染色体,并且AgoPLE1.1转座子在黑腹果蝇染色体中的整合带有供体质粒的骨架。【结论】PB转座子AgoPLE1.1仅可以在黑腹果蝇中以较低的频率进行非精确的剪切和转座,不具有开发为新型昆虫转基因载体的潜力。 展开更多
关键词 黑腹果蝇 piggybac转座子 PB类似因子 种系转化 剪切 转座
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PiggyBac转座子:人类基因编码研究的新工具 被引量：3
15
作者 于正洪 姜恩泽 +1 位作者 张杰明 陈龙邦 《医学研究生学报》 CAS 北大核心 2014年第2期199-202,共4页
转座子是一种不依赖于同源性重组即可在宿主基因组中发生基因座位置改变的DNA片段。PiggyBac(PB)转座子是一种可移动的遗传元素,并通过"剪切-黏贴"机制在有效载体和染色体之间调换。在换位过程中,PB转座子识别具体转座子的反... 转座子是一种不依赖于同源性重组即可在宿主基因组中发生基因座位置改变的DNA片段。PiggyBac(PB)转座子是一种可移动的遗传元素,并通过"剪切-黏贴"机制在有效载体和染色体之间调换。在换位过程中,PB转座子识别具体转座子的反向末端重复序列(inverted terminal repeat sequences,ITRS)位于转座子载体的2端,有效地移动原来位置的内容,并整合到TTAA染色体。PB转座子系统强大的活动使在PB载体上位于2个ITRS之间的基因容易地动员到靶基因。PB转座子因其高转座活性,转座安全、稳定与无痕移除的特性而备受关注,在分子医学研究中有较好的应用前景。针对其特性,PiggyBac转座子可被用于基因转移载体、癌基因筛选工具和基因治疗的载体。文中就其在基因编码研究中的应用作一综述。 展开更多
关键词 piggybac 转座子 转基因
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昆虫转基因载体——piggyBac转座子 被引量：6
16
作者 颜海燕 钟伯雄 汪方炜 《蚕业科学》 CAS CSCD 2000年第z1期98-101,共4页
piggyBac转座子在分类上属于真核生物的第二类转座子 ,是一个自主因子 ,长 2 4 76bp ,有短的末端反向重复序列 (ITR)和一个可读编码框 (ORF) ,ITR长 1 3bp ,ORF长 2 1kb。piggyBac转座子可以在基因组中切出和转座 ,切出和转座总是发生... piggyBac转座子在分类上属于真核生物的第二类转座子 ,是一个自主因子 ,长 2 4 76bp ,有短的末端反向重复序列 (ITR)和一个可读编码框 (ORF) ,ITR长 1 3bp ,ORF长 2 1kb。piggyBac转座子可以在基因组中切出和转座 ,切出和转座总是发生在特征性的TTAA四核苷酸目标位点序列 ,转座频率较高 ,而且piggyBac转座子受生物体种类的限制性较少。利用piggyBac转座子构成的载体———辅助质粒系统已成功地获得了转基因地中海果蝇、黑腹果蝇和家蚕。 展开更多
关键词 piggybac 转基因载体 转基因昆虫
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纳米载体介导的PiggyBac转座子制备CAR-NK细胞 被引量：3
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作者 岳冉 刘子洋 +6 位作者 郑岩 陆小丹 胡珊珊 张炳勇 李修岭 李景果 韩双印 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期109-114,共6页
目的:探索新型阳离子聚合物纳米载体mPEG-P(Asp-AED-g-HFB)(PAEF)和PiggyBac转座子介导嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰自然杀伤(natural killer,NK)细胞的基因转染方法,为肿瘤细胞免疫治疗制剂研发提供新策略。方法:... 目的:探索新型阳离子聚合物纳米载体mPEG-P(Asp-AED-g-HFB)(PAEF)和PiggyBac转座子介导嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰自然杀伤(natural killer,NK)细胞的基因转染方法,为肿瘤细胞免疫治疗制剂研发提供新策略。方法:制备PAEF/DNA(转座酶+转座子)复合物,通过Nano-ZSE动态光散射系统(Malvern Instruments)测量PAEF/DNA复合物的粒径分布和表面电位;DNA凝胶电泳验证PAEF的DNA包封率、释放性和稳定性,结合粒径电位选择进入细胞合适的N/P值;CCK-8细胞毒性实验分析不同N/P值条件下PAEF/DNA复合物的细胞毒性;荧光显微镜及流式细胞术检测细胞转染效率,评估PAEF基因转染载体的可行性。结果:PAEF可包裹DNA形成粒径100~150 nm的纳米复合物,后者易于介导DNA进入细胞;当N/P值为20时,PAEF即可实现DNA的完全包裹;在还原剂二硫苏糖醇(dithiothreotol,DTT)存在下,PAEF对DNA有良好的释放能力;N/P值为80时,PAEF/DNA复合物转染组的NK-92细胞存活率显著高于脂质体转染组[(72.50±3.9)%vs(64.03±1.8)%,P<0.05];荧光显微镜下观察发现,PAEF/DNA组荧光多、荧光强度大;流式细胞术显示最高转染效率为83.4%。结论:纳米载体PAEF通过静电吸附作用能够很好地包裹DNA,且生物相容性好,基因转导效率较高,成功制备的CAR-NK细胞为过继免疫治疗提供良好的实验基础。 展开更多
关键词 纳米载体 piggybac转座子 嵌合抗原受体 NK细胞 肿瘤免疫治疗
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piggyBac转座子在哺乳动物中的应用 被引量：1
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作者 杨冠恒 曾凡一 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第2期31-35,共5页
转座子(transposon)是存在于生物体基因组中的可移动的DNA片段,能够影响基因的结构和功能,广泛存在于生物演化过程中。转座子通过切离和粘贴机制介导外源基因的插入,是研究基因功能,制备转基因动物及基因治疗的优良载体。目前在哺乳动... 转座子(transposon)是存在于生物体基因组中的可移动的DNA片段,能够影响基因的结构和功能,广泛存在于生物演化过程中。转座子通过切离和粘贴机制介导外源基因的插入,是研究基因功能,制备转基因动物及基因治疗的优良载体。目前在哺乳动物中转座活性较高且研究最多的是"睡美人"转座子和piggyBac(PB)转座子。前者是目前临床前基因治疗研究中使用最为广泛的转座子,但存在剂量抑制效应和转座效率低等缺陷。而PB转座子可克服剂量抑制效应,且转座高效,转基因载量大,因此在哺乳动物中的应用越来越广泛。作者就PB转座子的作用机制、影响因素及在哺乳动物中的应用现状等进行报道。 展开更多
关键词 piggybac 转座子 转基因
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利用PiggyBac转座子系统快速控制GPI锚定蛋白的表达
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作者 Matabaro Emmanuel 柳艺石 +2 位作者 张慧杰 高晓冬 藤田盛久 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第9期927-932,共6页
GPI锚定蛋白的合成是一个发生在内质网中多步骤、多基因参与的过程。PIGK是GPI锚定蛋白转酰胺酶复合物的一个催化亚基,负责把GPI前体转移到蛋白质上。作者在人体胚胎肾细胞(HEK 293)中获得了PIGK敲除的细胞株,敲除PIGK的细胞不能表达GP... GPI锚定蛋白的合成是一个发生在内质网中多步骤、多基因参与的过程。PIGK是GPI锚定蛋白转酰胺酶复合物的一个催化亚基,负责把GPI前体转移到蛋白质上。作者在人体胚胎肾细胞(HEK 293)中获得了PIGK敲除的细胞株,敲除PIGK的细胞不能表达GPI锚定蛋白。利用piggyBac(PB)转座子系统,在细胞中重新插入PIGK基因,细胞膜表面的GPI锚定蛋白恢复表达。实验成功构建了HEK293pB-PIGK细胞株并命名为G36,通过引入PB转座酶或FLP重组酶,可以控制GPI锚定蛋白的表达。本系统可以快速调控细胞表面蛋白质的表达并能够用于基础研究和工业应用。 展开更多
关键词 GPI锚定蛋白 piggybac转座子 PIGK
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piggyBac转座子及其转基因昆虫的应用 被引量：5
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作者 唐丽莉 陈斌 +1 位作者 何正波 李廷景 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2010年第6期2809-2811,2814,共4页
综述了piggyBac转座子的结构、转座机制及其在获得转基因动物方面的应用成果,介绍了利用该转座子获得的转基因昆虫在功能基因研究、生物反应器、昆虫改良和害虫防治等方面的应用。
关键词 piggybac 转座子 转基因昆虫
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