高效表达黑曲霉PhyA基因改善白三叶草对有机态磷的利用 被引量：14

1

作者 韩胜芳 谷俊涛 肖凯 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期250-255,共6页

利用子叶下胚轴为外植体,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒介导遗传转化途径,建立了高效表达黑曲霉PhyA基因的白三叶草转基因系。PCR和Southern印迹结果表明,PhyA基因已整合到转基因植株的基因组中。Northern印迹结果表明,... 利用子叶下胚轴为外植体,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒介导遗传转化途径,建立了高效表达黑曲霉PhyA基因的白三叶草转基因系。PCR和Southern印迹结果表明,PhyA基因已整合到转基因植株的基因组中。Northern印迹结果表明,部分转基因系中的PhyA基因具有高表达水平。此外,PhyA基因表达的植酸酶在Patatin信号肽的引导下具有分泌至细胞间隙和根际的能力。与未转基因对照相比,在以植酸盐为唯一磷素供源的条件下,高表达PhyA的转基因系植株的磷素累积量、鲜重和干重显著增加。证明外源转化黑曲霉PhyA基因能显著增强白三叶草利用有机态磷的能力。 展开更多

关键词 三叶草(Trifolium repens L.) 遗传转化 phya基因 有机态磷利用

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真菌植酸酶phyA基因研究进展 被引量：21

2

作者 王红宁 吴琦 +1 位作者 谢晶 刘世贵 《四川农业大学学报》 CSCD 2000年第1期84-88,共5页

植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇和无机磷酸盐的一类酶。本文综述了真菌植酸酶 (EC 3.1.3 .8)phyA基因的研究进展 ,主要包括 :①phyA基因的分子生物学特点 ;②phyA基因组文库的构建 ;③phyA基因表达载体的构建 ;④phyA基因表达的调... 植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇和无机磷酸盐的一类酶。本文综述了真菌植酸酶 (EC 3.1.3 .8)phyA基因的研究进展 ,主要包括 :①phyA基因的分子生物学特点 ;②phyA基因组文库的构建 ;③phyA基因表达载体的构建 ;④phyA基因表达的调控 ;⑤phyA基因克隆及表达实例。 展开更多

关键词 真菌 植酸酶 phya基因 分子生物学 基因表达

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phyA基因在毕赤酵母中的表达以及表达产物的检测 被引量：1

3

作者 曾青兰 《现代农业科技》 2007年第3期105-106,共2页

对获得的植酸酶基因PhyA进行TA克隆,获质粒pTA-phyA,酶切后,使其在连接体系中连接到酵母表达载体pPIC9K-InS片段上,随后将重组质粒转化给大肠杆菌,验证其成功后,再将重组质粒转化给毕赤酵母,诱导其表达,通过测定植酸酶活性,得出其表达量。

关键词 phya基因 克隆 毕赤酵母 表达 检测

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植酸酶phyA基因的密码子优化及其在大豆中的表达 被引量：7

4

作者 寇莹莹 宋英今 +1 位作者 杨少辉 王洁华 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1798-1804,共7页

植酸是植物源食品中的主要抗营养成分,降低植酸含量可有效提高大豆的营养利用率。本文根据大豆密码子使用偏好性,对无花果曲霉植酸酶phyA基因进行密码子优化,人工合成了适合在大豆中表达的phyA(b)基因。以p CAMBIA3301为骨架,构建由大... 植酸是植物源食品中的主要抗营养成分,降低植酸含量可有效提高大豆的营养利用率。本文根据大豆密码子使用偏好性,对无花果曲霉植酸酶phyA基因进行密码子优化,人工合成了适合在大豆中表达的phyA(b)基因。以p CAMBIA3301为骨架,构建由大豆凝集素基因启动子和信号肽序列调控的植物表达载体pCBPS-phyA(b)。用农杆菌介导法遗传转化吉林35大豆子叶节。PCR检测表明目的基因已初步整合至大豆基因组中;bar试纸条表明所有阳性植株中均能检测到bar基因的蛋白产物;除草剂叶片涂抹显示野生型的叶片出现黄化或枯萎现象,而转基因植株叶片表现正常,具除草剂抗性;以半定量RT-PCR共筛选到13株转phyA和19株转phyA(b)阳性转基因大豆植株。通过对转基因大豆T_3种子中植酸酶活性、无机磷和植酸磷含量等检测,证明人工基因phyA(b)比phyA在大豆种子中所表达的植酸酶具有更高的活性,说明密码子优化有利于提高外源基因的表达。 展开更多

关键词 大豆 phya基因 密码子优化 遗传转化

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转phyA基因棉花纯合株系筛选及其对土壤有机磷的利用能力 被引量：4

5

作者 黄惠 王省芬 +6 位作者 郭彩菊 刘建凤 王敬敬 李志坤 吴立强 张桂寅 马峙英 《棉花学报》 CSCD 北大核心 2011年第3期219-223,共5页

为了获得转植酸酶基因(phyA)棉花高代纯合株系并验证其利用土壤中有机态磷的能力,对实验室获得的转phyA基因T4代材料进行了PCR筛选,在水培条件下研究了纯合株系植株根际分泌的植酸酶活性,并在田间进行了植株磷含量和棉花产量性状分析。... 为了获得转植酸酶基因(phyA)棉花高代纯合株系并验证其利用土壤中有机态磷的能力,对实验室获得的转phyA基因T4代材料进行了PCR筛选,在水培条件下研究了纯合株系植株根际分泌的植酸酶活性,并在田间进行了植株磷含量和棉花产量性状分析。结果表明,在PCR筛选的4个株系中,有2个株系为纯合株系,其后代均为PCR阳性植株。在以植酸盐为唯一磷源条件下,高表达phyA的转基因株系的植酸酶活性较野生型增加了1.5倍,不同生育时期转基因株系植株叶片磷含量中L6株系增加最多,苗期、现蕾期、花铃期和吐絮期分别增加了4.5%,5.95%,5.45%和8.73%。 展开更多

关键词 棉花(Gossypium hirsutum L.) 植酸酶基因(phya) 转基因植株 有机态磷

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拟南芥光敏色素基因PHYA转化菊花的研究 被引量：6

6

作者 惠婕 黄丛林 +1 位作者 吴忠义 张秀海 《江苏农业科学》 CSCD 北大核心 2011年第2期51-54,共4页

光敏色素(phytochrome,简称PHY)是植物的重要光受体,拟南芥包含PHYA、PHYB、PHYC、PHYD、PHYE等5个光敏色素基因,它们在植物的生长发育中起着重要作用,光敏色素基因的过量表达通常造成转基因植株株型及光合效率的改变。从拟南芥基因组... 光敏色素(phytochrome,简称PHY)是植物的重要光受体,拟南芥包含PHYA、PHYB、PHYC、PHYD、PHYE等5个光敏色素基因,它们在植物的生长发育中起着重要作用,光敏色素基因的过量表达通常造成转基因植株株型及光合效率的改变。从拟南芥基因组中克隆了全长PHYA基因,构建了植物表达载体,通过根癌农杆菌LBA4404转化地被匍匐小菊"粉地毯",得到4株PCR反应呈阳性的转基因株系。结果发现,与对照相比,在弱光环境下转基因植株节间变长,叶片瘦长,叶柄变长;在露天栽培条件下,转基因株系的叶片变大,叶片着生密,节间变小,株型明显矮化。转基因株系的另一明显表现型是花期显著提前,转基因植株的花色也由粉色变为黄色,拟南芥PHYA基因的过量表达同时也影响了地被小菊生长发育的诸多方面,为PHYA基因在植物基因工程中的应用提供了借鉴。 展开更多

关键词 拟南芥 phya基因 转基因 菊花

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黑曲霉植酸酶基因phyA的克隆及在大肠杆菌中的表达 被引量：2

7

作者 闻雅男 王学英 +1 位作者 夏润玺 王媛媛 《沈阳农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期335-338,共4页

为获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生物生物制剂,从自行筛选的黑曲霉中提取RNA,通过反转录合成模板cDNA,根据phyA成熟肽编码序列设计出一对引物,PCR扩增phyA,对扩增片段进行了克隆,通过限制性内切酶酶切分析、DNA测序证明p... 为获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生物生物制剂,从自行筛选的黑曲霉中提取RNA,通过反转录合成模板cDNA,根据phyA成熟肽编码序列设计出一对引物,PCR扩增phyA,对扩增片段进行了克隆,通过限制性内切酶酶切分析、DNA测序证明phyA基因克隆成功。从pBS-T-phyA克隆中获取phyA编码序列,将其与pET28a+质粒连接,构建pET28a+-phyA重组质粒,并在大肠杆菌中获得高效表达。本研究成功克隆phyA,该基因全长1404bp,以ATG为起始密码子,TGA为终止密码子,编码467个氨基酸组成的多肽。SDS-PAGE电泳结果表明,phyA在大肠杆菌中成功表达,成熟植酸酶的分子量约为51kDa。在0.4g·L-1的IPTG的诱导下,植酸酶活性最大(1174U)。 展开更多

关键词 黑曲霉 phya基因 大肠杆菌 克隆载体 高效表达

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植酸酶基因PhyA对陆地棉产量性状的影响 被引量：3

8

作者 柯会锋 王省芬 +4 位作者 吴立强 李志坤 张艳 张桂寅 马峙英 《棉花学报》 CSCD 北大核心 2016年第3期208-214,共7页

在人工控制(培养基、水培、沙培)条件下,植酸酶基因PhyA具有分解利用培养基质植酸磷、提高磷素利用效率的功能,但在田间的表现目前尚未明确。在前期完成的PhyA转基因陆地棉新材料盆栽试验基础上,将其种植在田间条件下,研究PhyA基因对棉... 在人工控制(培养基、水培、沙培)条件下,植酸酶基因PhyA具有分解利用培养基质植酸磷、提高磷素利用效率的功能,但在田间的表现目前尚未明确。在前期完成的PhyA转基因陆地棉新材料盆栽试验基础上,将其种植在田间条件下,研究PhyA基因对棉花产量性状的影响。结果表明,部分转基因棉花新材料的单株结铃数、铃重、衣分、籽棉产量、皮棉产量与野生型对照存在显著差异,PhyA在田间条件下具有改良转基因棉花部分产量性状的能力。在此基础上,遴选出2个转PhyA棉花优良新品系G3、G2,可用作今后转植酸酶基因棉花新品种培育的基础材料。 展开更多

关键词 植酸酶基因phya 田间条件 陆地棉 产量性状 植酸磷

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植酸酶基因中稀有密码子的改造提高其在毕赤酵母中的表达量 被引量：22

9

作者 陈惠 赵海霞 +3 位作者 王红宁 杨婉身 吴琦 倪燕 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期171-175,共5页

对来源于黑曲霉N2 5(AspergillusnigerChinaStrain)的植酸酶基因phyA进行PCR介导的定点突变 ,不改变其所编码氨基酸 ,选用毕赤酵母偏爱的密码子对该基因保守序列中第 81位和第 85位的Arg密码子进行同义突变 .构建了含正确突变的克隆载体... 对来源于黑曲霉N2 5(AspergillusnigerChinaStrain)的植酸酶基因phyA进行PCR介导的定点突变 ,不改变其所编码氨基酸 ,选用毕赤酵母偏爱的密码子对该基因保守序列中第 81位和第 85位的Arg密码子进行同义突变 .构建了含正确突变的克隆载体pUC18 phyAm 和酵母表达载体pPIC9k phyAm,电击转化毕赤酵母 ,经MM、MD平板筛选和产物的酶活性测定 ,筛选出突变与未突变高酶活酵母转化子各 2株 .这 4株转化子的Southern印迹结果表明 ,phyA基因以单交换方式单拷贝整合到酵母染色体DNA中 .表达产物的SDS PAGE分析表明 ,重组酵母中的植酸酶能有效分泌和表达 ,蛋白质分子大小为 70 15kD .转化子酶活测定结果表明 ,经密码子优化的突变重组酵母酶活力明显高于未进行优化的重组酵母转化子 .经密码子优化的突变重组酵母株PP NPm 8于麦芽汁培养基中诱导 36h后酶活力可达 4 76 0 0U/ml,其活力比未优化重组酵母株PP NP 2 (2 36 6 7U/ml)提高了约 1倍 ,且重组转化子遗传稳定性良好 . 展开更多

关键词 黑曲霉 植酸酶phya基因 定点突变 毕赤酵母 表达

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土曲霉植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达 被引量：2

10

作者 伍洛夫 周俊初 赵述淼 《湖北农业科学》 北大核心 2005年第3期21-24,共4页

参考已报道的植酸酶基因phyA全序列设计一对引物,用PCR方法从土曲霉穴Aspergillusterreus雪总DNA中扩增到去除信号肽和内含子后约1.4kb的phyA基因编码区片段,对该片段进行了克隆与序列测定。进一步用该片段构建了pPIC9K-phyA分泌型表达... 参考已报道的植酸酶基因phyA全序列设计一对引物,用PCR方法从土曲霉穴Aspergillusterreus雪总DNA中扩增到去除信号肽和内含子后约1.4kb的phyA基因编码区片段,对该片段进行了克隆与序列测定。进一步用该片段构建了pPIC9K-phyA分泌型表达载体,并转化毕赤酵母穴Pichiapastoris雪GS115。通过表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE电泳分析,植酸酶在重组转化子中得到了有效分泌和高效表达。摇瓶诱导发酵132h后发酵液中植酸酶的活性可达167u·mL-1;表达产物在pH2.0～8.0均有活性,最适pH为5.5,最适温度为55℃。 展开更多

关键词 土曲霉 植酸酶 phya基因 毕赤酵母 表达

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F43Y及I354M,L358F定点突变对植酸酶热稳定性及酶活性的改善 被引量：8

11

作者 陈惠 王红宁 +3 位作者 杨婉身 赵海霞 吴琦 单志 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期516-520,共5页

对重组酵母PPNPm8的植酸酶phyAm基因进行PCR介导的定点突变,即将植酸酶43位的苯丙氨酸替换为酪氨酸(F43Y),将其354、358位的异亮氨酸、亮氨酸分别替换为甲硫氨酸和苯丙氨酸(I354M,L358F),得到了2个突变体PPNPm-1(F43Y)及PPNPm-2(I354M,L... 对重组酵母PPNPm8的植酸酶phyAm基因进行PCR介导的定点突变,即将植酸酶43位的苯丙氨酸替换为酪氨酸(F43Y),将其354、358位的异亮氨酸、亮氨酸分别替换为甲硫氨酸和苯丙氨酸(I354M,L358F),得到了2个突变体PPNPm-1(F43Y)及PPNPm-2(I354M,L358F).含突变基因的重组表达载体pPIC9kphyAm-1,pPIC9kphyAm-2在毕赤酵母GS115中表达,对表达产物进行酶活性测定及热稳定性检测.结果表明:突变体PPNPm-1最适反应温度比未突变体PPNPm8上升了3℃,75℃处理10min,热稳定性提高15%,比活力提高11%;PPNPm-2最适反应温度未改变,热稳定性比PPNPm8仅提高3%,比活力降低6.5%.对突变前后的植酸酶空间结构进行比较预测,发现突变氨基酸Tyr43与空间位置相邻的Asn416之间形成氢键,增强了酶的热稳定性. 展开更多

关键词 植酸酶 phya基因 定点突变 毕赤酵母 热稳定性

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植酸酶根特异表达载体的构建及大豆转化 被引量：3

12

作者 李桂兰 乔亚科 +3 位作者 李明刚 崔姗姗 乔潇 乔坤艳 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期892-897,共6页

应用PCR方法分别从胡萝卜基因组中扩增出96bp的外展蛋白信号肽编码序列片段,从拟南芥基因组中扩增出1454bp的pyk10启动子片段,用RT-PCR方法从无花果曲霉(Aspergillus ficuum3.4322)中扩增出phyA基因,长1347bp。然后,分别克隆到pMD18-T... 应用PCR方法分别从胡萝卜基因组中扩增出96bp的外展蛋白信号肽编码序列片段,从拟南芥基因组中扩增出1454bp的pyk10启动子片段,用RT-PCR方法从无花果曲霉(Aspergillus ficuum3.4322)中扩增出phyA基因,长1347bp。然后,分别克隆到pMD18-T载体。应用已设计的限制酶切位点,通过5个中间载体将3段DNA片段连接构成2.9kb的表达单元Ppyk10-S-phJA(KSA),将KSA片段插入初始载体pC-GENERAL,构建成植酸酶根特异表达载体pPC-KSA。利用农杆菌介导法将无花果曲霉植酸酶基因phyA转入到栽培大豆品种吉林35中,在大豆转基因植株中正确表达,产生有活性的植酸酶,且能分泌到根外。T3代植株根系分泌植酸酶活性比未转化植株提高了2～4倍。 展开更多

关键词 外展蛋白信号肽 pyk10启动子 phya基因 大豆 转基因 植酸酶 根特异表达

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