PEG介导的广东虫草原生质体遗传转化体系建立及其应用 被引量：2

1

作者 张成花 黄虹 +5 位作者 程慧娇 王刚正 陈香女 钟国瑞 李泰辉 邓旺秋 《广东农业科学》 CAS 2024年第2期16-28,共13页

【目的】广东虫草是我国特有珍稀食药用菌,其营养成分丰富、活性功效显著,已获批新资源食品,产业化应用前景广阔。建立广东虫草原生质体制备及遗传转化方法,可为广东虫草新品种选育及基因功能研究提供参考依据。【方法】以广东虫草菌丝... 【目的】广东虫草是我国特有珍稀食药用菌,其营养成分丰富、活性功效显著,已获批新资源食品,产业化应用前景广阔。建立广东虫草原生质体制备及遗传转化方法,可为广东虫草新品种选育及基因功能研究提供参考依据。【方法】以广东虫草菌丝体为材料,采用单因素分析方法对原生质体制备过程中酶解组合、酶解时间、酶解温度、复苏培养基及抗性标记进行筛选。同时以潮霉素抗性标记质粒pCAMBIA1300为转化片段,采用单因素分析方法对PEG介导的原生质体转化过程中亚精胺浓度、PEG加入间隔时间、抗生素添加时间进行筛选。并以广东虫草中的锌指半胱氨酸转录因子CgPro1敲除片段为目的转化片段,对转化系统进行验证。【结果】广东虫草原生质体制备的最佳组合条件为:采用含有裂解酶+崩溃酶的混合酶体系(1∶1)对广东虫草的菌丝体进行酶解,且酶解温度28℃、酶解时间为5.5 h时原生质体得率最高;原生质体复苏过程中,TB3复苏培养基对广东虫草原生质体的复苏效果最好、其次为0.6mol/L KCl-PDA;PEG介导原生质体转化过程中,加入5 mmol/L亚精胺、PEG加入间隔时间10 min、原生质体复苏3 d后添加250μg/mL潮霉素抗性标记进行筛选,转化效率最高。此外,通过建立的转化系统获得3个CgPro1敲除突变株及3个杂合子,表型分析结果显示,该基因参与广东虫草子实体发育过程。【结论】建立了成熟的广东虫草原生质体制备及PEG介导的遗传转化体系,可为今后广东虫草基因功能、蛋白定位等遗传操作研究奠定良好基础,同时为广东虫草遗传育种提供重要应用参考。 展开更多

关键词 广东虫草 原生质体 peg介导 遗传转化 基因敲除

在线阅读 下载PDF 职称材料

原生质体法介导真菌遗传转化的研究进展 被引量：28

2

作者 沈慧敏 李超 +3 位作者 高利 刘太国 刘博 陈万权 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期25-28,42,共5页

原生质体法介导真菌遗传转化体系是实现大规模随机、定点突变和菌种改良的方法之一,为研究真菌致病性和侵染机制奠定了基础。原生质体法构建转化体系的步骤包括原生质体的制备、转化与再生,其中关键是原生质体的制备,通常采用酶解法破... 原生质体法介导真菌遗传转化体系是实现大规模随机、定点突变和菌种改良的方法之一,为研究真菌致病性和侵染机制奠定了基础。原生质体法构建转化体系的步骤包括原生质体的制备、转化与再生,其中关键是原生质体的制备,通常采用酶解法破除细胞壁获得原生质体,其获得率直接影响转化效率。转化通常借助于聚乙二醇(PEG)介导、电击或限制性内切酶法完成,其中PEG介导的原生质体转化法较传统,技术较成熟;电击法操作较简单;限制性内切酶(REMI)介导的整合转化,因其转化效率较高,可产生大量稳定的转化子,正被越来越多地应用于丝状真菌的遗传转化。 展开更多

关键词 原生质体 制备与再生 peg介导 电击 REMI 转化子

在线阅读 下载PDF 职称材料

影响球毛壳菌原生质体转化的因素 被引量：3

3

作者 李梅 杨谦 李常银 《哈尔滨工业大学学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2003年第7期787-789,共3页

采用PEG介导的原生质体转化法研究了含有多菌灵抗性基因的质粒pRB129转化球毛壳菌的影响因素。结果表明,最佳转化条件为:以1.0mol/L山梨醇作为渗透压稳定剂,20mol/L Ca^(2+)和终质量分数为50％的PEG4000作为转化介质,于25℃转化10min,... 采用PEG介导的原生质体转化法研究了含有多菌灵抗性基因的质粒pRB129转化球毛壳菌的影响因素。结果表明,最佳转化条件为:以1.0mol/L山梨醇作为渗透压稳定剂,20mol/L Ca^(2+)和终质量分数为50％的PEG4000作为转化介质,于25℃转化10min,采用缓慢逐步稀释的方法,转化后1.5d筛选转化子,此时,转化率最高,且有较高的重复性,DNA平均转化率为5.6个/μg。该结果对球毛壳菌其他性状的改进及其他丝状真菌的遗传转化具有重要参考价值。 展开更多

关键词 球毛壳菌 原生质体 peg介导 多菌灵抗性基因 转化条件 转化介质 转化率 丝状真菌 杀菌剂 山梨醇

在线阅读 下载PDF 职称材料

植物体细胞原生质体遗传转化研究 被引量：11

4

作者 赵宏波 陈发棣 《西北植物学报》 CAS CSCD 2004年第7期1329-1341,共13页

重点介绍了植物体细胞原生质体遗传转化的方法和当前已经取得的成果,同时提出了目前原生质体遗传转化中存在的问题,展望了今后的工作重点。植物原生质体遗传转化的方法主要有:PEG介导转化法、电击穿孔转化法、脂质体介导转化法、农杆菌... 重点介绍了植物体细胞原生质体遗传转化的方法和当前已经取得的成果,同时提出了目前原生质体遗传转化中存在的问题,展望了今后的工作重点。植物原生质体遗传转化的方法主要有:PEG介导转化法、电击穿孔转化法、脂质体介导转化法、农杆菌共培养转化法等。 展开更多

关键词 体细胞 原生质体 遗传转化peg法 电击法 脂质体法 农杆菌法

在线阅读 下载PDF 职称材料

黑曲霉糖化酶工业菌株CBS 513.88原生质体制备条件的优化 被引量：2

5

作者 赵君 张震 +2 位作者 董飞宇 徐轶凡 陈红歌 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期592-600,共9页

【目的】优化黑曲霉糖化酶工业菌株CBS 513.88原生质体制备条件,促进其基础研究和分子改造。【方法】通过考察酶解液成分与比例、酶解条件、渗透压稳定剂和菌体生长条件对黑曲霉CBS 513.88原生质体制备的影响,优化其制备条件,并通过聚... 【目的】优化黑曲霉糖化酶工业菌株CBS 513.88原生质体制备条件,促进其基础研究和分子改造。【方法】通过考察酶解液成分与比例、酶解条件、渗透压稳定剂和菌体生长条件对黑曲霉CBS 513.88原生质体制备的影响,优化其制备条件,并通过聚乙二醇介导的原生质体转化方法测试原生质体的转化效率。【结果】适合黑曲霉CBS 513.88原生质体制备的材料为改良ME培养基培养10 h的菌丝,酶解条件为在10 g·L^(-1)溶壁酶Glucanex和10 g·L^(-1)蛋清溶菌酶的破壁酶溶液(pH值5.8)33℃、110 r·min^(-1)酶解1.5 h,渗透压稳定剂为0.7 mol·L^(-1)KCl+0.27 mol·L^(-1)CaCl_(2)。在此制备条件下,原生质体悬液含量最高可达2×10^(7)个·mL^(-1);原生质体再生培养基为添加0.7 mol·L^(-1)KCl的ME培养基,其最大再生率为52%;转化率最高为206个·μg-1 DNA(质粒),阳性率为94.4%。【结论】通过对黑曲霉CBS 513.88原生质体制备条件的优化,建立短时高效的原生质体介导遗传转化体系。 展开更多

关键词 黑曲霉CBS 513.88 原生质体制备 原生质体再生 原生质体介导转化 遗传转化体系

在线阅读 下载PDF 职称材料

棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立 被引量：31

6

作者 李妮娜 丁林云 +1 位作者 张志远 郭旺珍 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期231-239,共9页

以棉花幼嫩子叶为材料,分析影响棉花叶肉原生质体分离及目标基因转化的主要因素,以棉花叶肉原生质体为受体,建立了稳定、高效的目标基因瞬时表达与鉴定体系。技术体系包括,选择自然生长12 d的棉花幼嫩子叶为材料,混合1.5%纤维素酶、0.4... 以棉花幼嫩子叶为材料,分析影响棉花叶肉原生质体分离及目标基因转化的主要因素,以棉花叶肉原生质体为受体,建立了稳定、高效的目标基因瞬时表达与鉴定体系。技术体系包括,选择自然生长12 d的棉花幼嫩子叶为材料,混合1.5%纤维素酶、0.4%离析酶、0.5 mol L–1甘露醇、20 mmol L–1 KCl、20 mmol L–1 MES、0.1 mol L–1 CaCl2和1.0 g L–1 BSA,在28℃黑暗条件下振荡酶解8 h,可游离出浓度达1.0×106 mL–1以上的纯净棉花叶肉原生质体。利用该方法将棉花锌指蛋白基因GhZFP2整合到pJIT166-GFP质粒载体,构建了GhZFP2:GFP融合载体,采用40%PEG-4000介导转化,获得高转化率的棉花叶肉原生质体。对目标基因瞬时表达产物检测表明,GhZFP2蛋白清晰定位在细胞核上。 展开更多

关键词 棉花 原生质体 peg介导 转化 目标基因 瞬时表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

GFP基因在软枣猕猴桃愈伤组织原生质体中瞬间表达的初步研究 被引量：16

7

作者 朱道圩 米银法 +2 位作者 陈延惠 王静毅 刘中杰 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 2003年第2期145-148,共4页

用PEG介导法对游离出来的软枣猕猴桃原生质体进行遗传转化,成功地将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入了原生质体,并获得了瞬间表达.结果表明,影响GFP基因转化的因素主要是材料的生理状态,PEG的种类和浓度;适宜的转化条件和方法为,将从白色、... 用PEG介导法对游离出来的软枣猕猴桃原生质体进行遗传转化,成功地将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入了原生质体,并获得了瞬间表达.结果表明,影响GFP基因转化的因素主要是材料的生理状态,PEG的种类和浓度;适宜的转化条件和方法为,将从白色、较为疏松愈伤组织中游离的原生质体,悬浮到质量分数为13%甘露醇的洗液(CPW13)中,置于45℃水浴中热激5min,再放在冰浴中迅速冷却;加入质粒,轻轻混匀后静止10min;逐滴加入质量分数40%PEG6000介导转化,终浓度为100g·L-1,在室温下放置20min;逐滴加入CPW13稀释转化后的原生质体,以避免PEG浓度剧烈变化造成细胞膜破裂. 展开更多

关键词 软枣猕猴桃 愈伤组织 原生质体 瞬间表达 GFP基因 peg介导法 遗传转化 绿色荧光蛋白 报告基因

在线阅读 下载PDF 职称材料

华南象草原生质体分离及基因瞬时表达研究 被引量：6

8

作者 唐然 彭小群 解新明 《草地学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期571-579,共9页

以华南象草(Pennisetum purpureum)幼叶鞘为材料,采用L_(16)(4~5)正交试验设计,对分离原生质体过程中的纤维素酶浓度、离析酶浓度、酶解液pH、甘露醇浓度、酶解时间5个因素进行筛选,建立了高效的象草叶鞘原生质体分离体系,并进行目标基... 以华南象草(Pennisetum purpureum)幼叶鞘为材料,采用L_(16)(4~5)正交试验设计,对分离原生质体过程中的纤维素酶浓度、离析酶浓度、酶解液pH、甘露醇浓度、酶解时间5个因素进行筛选,建立了高效的象草叶鞘原生质体分离体系,并进行目标基因的瞬时转化,以期为象草基因功能研究奠定基础。结果表明:叶鞘在含有1.5%纤维素酶R-10,0.75%离析酶R-10,0.5 mol·L^(-1)甘露醇,pH为5.8的酶解液中酶解4 h,原生质体产量达5.11×10~6个·g FW^(-1),活力达91.08%,酶解时间对象草原生质体产量和活力的影响最大。用PEG介导法将2个分别带有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的载体转入原生质体中,转化效率最高可达77.47%,共转化效率为8.79%。所分离的原生质体可用于基因的瞬时表达研究。 展开更多

关键词 象草 原生质体 peg介导 瞬时表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

限制性内切酶介导的粉红粘帚霉67-1转化体系构建 被引量：2

9

作者 许梦秋 姜杰 +2 位作者 孙漫红 谢响明 李世东 《中国生物防治学报》 CSCD 北大核心 2013年第2期263-269,共7页

本文将含有潮霉素抗性基因(hph)的质粒pAN7-1通过限制性内切酶介导法转入植病生防真菌粉红粘帚霉Clonostachys rosea 67-1中,并由此建立该生防真菌的遗传转化体系。研究结果表明,PEG介质含量、限制性内切酶种类和浓度、质粒形态和反应... 本文将含有潮霉素抗性基因(hph)的质粒pAN7-1通过限制性内切酶介导法转入植病生防真菌粉红粘帚霉Clonostachys rosea 67-1中,并由此建立该生防真菌的遗传转化体系。研究结果表明,PEG介质含量、限制性内切酶种类和浓度、质粒形态和反应时间对转化效率具有显著的影响。当质粒经线性化后加入40%PEG3350和20 U HindⅢ,室温下转化10 min时,转化效率可达到30～40 CFU.μg 1质粒DNA。PDA平板上连续培养3代,再转接到潮霉素抗性平板中,获得遗传稳定的转化子。PCR检测、Southern杂交和Real-time PCR检测等证明hph基因已整合到基因组中,且多为单拷贝插入。对随机挑取的50个转化子生长性状的测定结果表明,20%的转化子在PDA培养基中生长较快,12%的转化子产孢水平较高;另有16%～20%的转化子生长缓慢、产孢量减少;还有4%的转化子生长微弱,且无明显产孢现象。上述方法可以成功用于在粉红粘帚霉中引入外源基因,为今后生防粘帚霉高效工程菌株的构建提供了依据。 展开更多

关键词 粉红粘帚霉 原生质体转化 限制性内切酶介导整合 潮霉素抗性

在线阅读 下载PDF 职称材料

柱花草叶肉原生质体提取与瞬时表达体系构建 被引量：2

10

作者 高静 杨丽云 +1 位作者 张世子 蒋凌雁 《草地学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期893-902,共10页

柱花草(Stylosanthes guianensis)是一种重要的热区豆科牧草,为利用原生质体瞬时表达体系开展柱花草基因功能研究,以20 d龄期‘热研5号’柱花草子叶为试验材料,通过正交试验考察不同因素对原生质体分离及转化效率的影响。结果表明:采用1... 柱花草(Stylosanthes guianensis)是一种重要的热区豆科牧草,为利用原生质体瞬时表达体系开展柱花草基因功能研究,以20 d龄期‘热研5号’柱花草子叶为试验材料,通过正交试验考察不同因素对原生质体分离及转化效率的影响。结果表明:采用1.5%纤维素酶、1.25%离析酶、0.5 mol·L^(-1)甘露醇和4 mmol·L^(-1)MES酶解液组合,酶解时间为16 h时,原生质体的产量和活性均达到最佳,分别为(4.567×10^(6))个·g^(-1)和92.271%;原生质体浓度为(6×10^(5))个·mL^(-1)、质粒浓度为0.6μg·μL^(-1),PEG-4000浓度为50%、转化时间为5 min时,转化效率最高,可达52.524%。构建了目标蛋白SgRKL1表达载体pA7-BIUTNT::SgRKL1-GFP,利用PEG介导法将其转入柱花草原生质体,激光扫描共聚焦显微镜检测结果显示SgRKL1蛋白定位于细胞膜上,说明所建立的柱花草叶肉原生质体瞬时表达体系可应用于目标基因的瞬时表达和亚细胞定位研究。 展开更多

关键词 柱花草 叶肉原生质体 酶解 peg介导 瞬时表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

农杆菌介导玉米遗传转化的研究进展 被引量：3

11

作者 关红颖 《现代化农业》 2011年第7期15-17,共3页

植物遗传转化是指以植物器官、组织、细胞或原生质体作为受体,通过某种技术或途径转入外源基因,获得使外源基因稳定表达的可育植株。玉米作为最重要的粮食作物之一,也是现代食品工业。

关键词 植物遗传转化 农杆菌介导 玉米 现代食品工业 外源基因 植物器官 原生质体 可育植株

在线阅读 下载PDF 职称材料

枸杞内生真菌NQ8GⅡ4菌株GFP标签蛋白表达载体的筛选

12

作者 闫思远 任苗苗 +4 位作者 杜娟 李金 杨富龙 李嘉泓 顾沛雯 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2021年第4期123-132,共10页

[目的]筛选适合枸杞内生真菌(Fusarium nematophilum)NQ8GⅡ4菌株GFP标签蛋白的表达载体,为后期研究该菌株在宿主植物中的侵染行为和定殖规律奠定基础。[方法]采用PEG介导原生质体转化法,分别将GFP标签蛋白表达载体pFL2、pDL2、r-KNT和K... [目的]筛选适合枸杞内生真菌(Fusarium nematophilum)NQ8GⅡ4菌株GFP标签蛋白的表达载体,为后期研究该菌株在宿主植物中的侵染行为和定殖规律奠定基础。[方法]采用PEG介导原生质体转化法,分别将GFP标签蛋白表达载体pFL2、pDL2、r-KNT和KNTG转入NQ8GⅡ4菌株,对比4种NQ8GⅡ4转化子的荧光强度、遗传稳定性、拮抗活性和致病性,筛选GFP标签蛋白的最佳表达载体。[结果]枸杞内生真菌NQ8GⅡ4菌株对潮霉素B(HmB)的耐受质量浓度为20 mg/L,对遗传霉素(G418)的耐受质量浓度为80 mg/L。通过PEG介导原生质体转化,获得pFL2转化子272株、pDL2转化子57株、r-KNT转化子73株和KNTG转化子226株,其转化效率分别为13.60,2.85,3.65和11.30株/μg。荧光显微观察发现,表达载体pDL2和KNTG的转化子所产生的荧光强度明显强于表达载体r-KNT和pFL2的转化子。连续培养5代后,pDL2转化子的遗传稳定率高达89.47%,pFL2、r-KNT和KNTG转化子的遗传稳定率分别仅为67.28%,68.49%和58.85%。4种转化子对枸杞胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)的拮抗活性以及对枸杞离体叶片的致病性均与野生型菌株无明显差异。[结论]pDL2更适合用作NQ8GⅡ4菌株GFP标签蛋白的表达载体。 展开更多

关键词 内生真菌 NQ8GⅡ4菌株 peg介导原生质体转化 表达载体 枸杞

在线阅读 下载PDF 职称材料

黑曲霉转化系统的优化及重组菌株高效筛选 被引量：3

13

作者 李岑 刘松 堵国成 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期1-8,共8页

黑曲霉(Aspergillus niger)是食品工业中重要的生产菌株,广泛应用于酶和有机酸生产。为提高黑曲霉遗传操作效率,对黑曲霉转化及重组菌株筛选策略进行优化。基于已报道的最佳转化条件对黑曲霉AG11进行电转化、农杆菌介导和聚乙二醇(polye... 黑曲霉(Aspergillus niger)是食品工业中重要的生产菌株,广泛应用于酶和有机酸生产。为提高黑曲霉遗传操作效率,对黑曲霉转化及重组菌株筛选策略进行优化。基于已报道的最佳转化条件对黑曲霉AG11进行电转化、农杆菌介导和聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导转化(Agrobacterium-mediated and PEG-mediated transformation,PMT),单个潮霉素转化板分别得到0、30和6个转化子。其中,PMT的转化子阳性率最高。基于优化后的原生质体制备条件:0.8~1 g松散的菌丝球于10 mL Yatalase溶液(0.8 mg/mL,pH 5.5)反应2.5 h,获得原生质体并进行PMT,转化效率较优化前提高14倍。为提高转化子筛选效率,将融合绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的天冬酰胺酶(asparaginase,ASN)基因整合至黑曲霉AG11糖化酶位点,并通过流式细胞仪分选表达ASN的孢子。分选结果显示,0.3%的孢子能表达GFP(共筛选30万个孢子)。酶活力分析表明,65%表达GFP的孢子能表达ASN。研究结果将为黑曲霉基因编辑提供重要方法学基础。 展开更多

关键词 黑曲霉 peg介导转化 原生质体 流式细胞仪 绿色荧光蛋白 天冬酰胺酶

在线阅读 下载PDF 职称材料

大丽轮枝菌(Verticillim dahliae)突变体库的构建与分析

14

作者 潘国强 吴思源 +3 位作者 刘璐 郭惠明 程红梅 苏晓峰 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期112-119,共8页

为了更加快捷地筛选大丽轮枝菌致病关键基因,利用聚乙二醇介导的原生质体转化法构建病原菌随机插入突变体库,对部分阳性转化子的生长表型指标和致病力进行分析,筛选生长发育与致病缺陷突变体并进行靶标基因定位。结果表明,本研究共获得1... 为了更加快捷地筛选大丽轮枝菌致病关键基因,利用聚乙二醇介导的原生质体转化法构建病原菌随机插入突变体库,对部分阳性转化子的生长表型指标和致病力进行分析,筛选生长发育与致病缺陷突变体并进行靶标基因定位。结果表明,本研究共获得13030多个阳性转化子,随机挑选5个转化子与V991野生型菌株进行比较分析,发现其中一个突变体在PDA和不同碳源培养基上的菌落直径、产孢量以及致病力均显著降低。侧翼序列测序结果结合Blast比对分析表明,该缺陷突变体中的潮霉素抗性基因表达盒定位于大丽轮枝菌3号染色体1528782 bp处,属于内切葡聚糖酶1基因(VDAG_04017)。综上所述,本研究通过大丽轮枝菌插入突变体库构建、突变体生长表型指标和致病力鉴定及靶标基因定位等一系列分子生物学手段,可初步鉴定病原菌致病相关基因,为从全基因组层面深入研究大丽轮枝菌致病机制奠定了一定基础。 展开更多

关键词 大丽轮枝菌 聚乙二醇介导的原生质体转化法 致病相关基因 致病力 侧翼序列分析

在线阅读 下载PDF 职称材料