免疫系统是机体维持正常生理功能的重要系统,多种免疫细胞表面的程序性死亡受体-1(programmed cell death protein 1,PD-1)及其配体程序性死亡配体-1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)是重要的共抑制分子,在病理状态下能够传递免...免疫系统是机体维持正常生理功能的重要系统,多种免疫细胞表面的程序性死亡受体-1(programmed cell death protein 1,PD-1)及其配体程序性死亡配体-1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)是重要的共抑制分子,在病理状态下能够传递免疫抑制信号,导致T细胞失能,从而引发免疫系统的功能障碍。研究表明,PD-1/PD-L1通路通过调控相关细胞因子及多种下游信号等方式,在多种疾病发生发展过程中发挥重要作用。论文对PD-1/PD-L1的结构、表达调控、作用机制及其在微生物、寄生虫等病原感染中作用的研究进展进行总结分析,以期为深入研究和揭示PD-1/PD-L1在疾病发生,特别是在病原微生物感染中的作用及相关疾病的防治提供基础资料。展开更多
程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)和程序性死亡配体1(programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)是一对经典免疫检查点,其相互作用在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。但由于PD-1和PD-L1存在复杂的糖基化修饰,且真核...程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)和程序性死亡配体1(programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)是一对经典免疫检查点,其相互作用在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。但由于PD-1和PD-L1存在复杂的糖基化修饰,且真核细胞中的PD-1和PD-L1在蛋白质水平的表达量低,限制了靶向二者相互作用的药物筛选及抑制剂的开发。本研究针对二者相互作用的关键结构域,利用金门桥组装(golden gate assembly)无缝克隆技术构建了表达功能性截短体蛋白质PD-1^(33-150)和PD-L1^(19-239)的真核载体,并利用HEK-293T细胞系验证了其高效表达。经亲和层析纯化,每升细胞培养基可获得蛋白质纯度>95%的PD-1^(33-150)和PD-L1^(19-239)蛋白分别为5 mg和3 mg。利用生物膜干涉技术(biolayer interferometry,BLI)和流式细胞术(flow cytometry,FCM),我们检测了纯化后PD-1^(33-150)和PD-L1^(19-239)的结合动力学参数、平衡常数以及其细胞结合活性。与昆虫细胞和大肠杆菌在蛋白质水平表达的PD-1胞外域相比,哺乳细胞表达的PD-1^(33-150)对PD-L1的亲和力提高了近24和50倍,同时使结合的解离速率降低至原来的1/400以下,这可能是由于不同的糖基化修饰对PD-1和PD-L1蛋白的相互作用具有重要影响。综上,本研究建立了人源PD-1^(33-150)/PD-L1^(19-239)功能性截短体在蛋白质水平的高效表达与纯化平台,为PD-1/PD-L1抗体药物筛选及小分子免疫检查点抑制剂的开发提供了高质量的分子工具。展开更多
【目的】通过研究猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus type Ⅱ,PCV2)感染过程中程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)及其配体(programmed cell death 1 ligands,PD-Ls)信号通路作用,寻找调节PCV2免疫抑制新途径,减少...【目的】通过研究猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus type Ⅱ,PCV2)感染过程中程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)及其配体(programmed cell death 1 ligands,PD-Ls)信号通路作用,寻找调节PCV2免疫抑制新途径,减少PCV2感染造成的经济损失。【方法】利用实验室构建的重组表达宿主菌pET32a-PD1/Rosetta(DE)进行诱导表达、纯化,获得猪可溶性PD-1蛋白(soluble PD-1,sPD-1)的诱导表达条件;制备大量具有活性的猪sPD-1蛋白,体外作用于PCV2感染的猪外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMCs),分别通过CCK-8和流式细胞术检测PBMCs的增殖情况,间接免疫荧光法和RT-qPCR检测猪sPD-1蛋白对PCV2病毒载量的影响,RT-qPCR和ELISA检测猪sPD-1蛋白对免疫相关细胞因子IL-2、IL-12、IL-21、IL-17A和IFN-γ等的转录水平和分泌水平的影响。【结果】通过诱导表达、纯化获得了高纯度、高活性的重组猪sPD-1蛋白。与未使用猪sPD-1蛋白处理的PCV2感染PBMCs组相比,10μg·mL−1猪sPD-1蛋白处理的猪PCV2病毒载量下降至1000 copies·μL−1以下;CCK-8检测结果显示猪sPD-1蛋白处理组细胞增殖指数显著提高(P<0.05);流式细胞术检测发现猪sPD-1蛋白组的平均荧光强度为(68.60±10.14)%,相对于PCV2病毒组(28.70±3.18)%显著增强(P<0.05);反转录荧光定量PCR和ELISA检测,发现猪sPD-1蛋白处理组的细胞因子IL-2、IL-12和IFN-γ的转录水平和分泌水平显著升高(P<0.05)。【结论】猪sPD-1蛋白可以通过阻断PD-1/PD-Ls通路降低PCV2的病毒载量,促进PBMCs的增殖,增强PBMCs细胞因子的转录水平和分泌水平免疫反应。因此,猪sPD-1蛋白在体外可以增强PCV2感染PBMCs的免疫反应,进一步为病毒性疾病的防控提供理论依据。展开更多
文摘免疫系统是机体维持正常生理功能的重要系统,多种免疫细胞表面的程序性死亡受体-1(programmed cell death protein 1,PD-1)及其配体程序性死亡配体-1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)是重要的共抑制分子,在病理状态下能够传递免疫抑制信号,导致T细胞失能,从而引发免疫系统的功能障碍。研究表明,PD-1/PD-L1通路通过调控相关细胞因子及多种下游信号等方式,在多种疾病发生发展过程中发挥重要作用。论文对PD-1/PD-L1的结构、表达调控、作用机制及其在微生物、寄生虫等病原感染中作用的研究进展进行总结分析,以期为深入研究和揭示PD-1/PD-L1在疾病发生,特别是在病原微生物感染中的作用及相关疾病的防治提供基础资料。
文摘【目的】通过研究猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus type Ⅱ,PCV2)感染过程中程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)及其配体(programmed cell death 1 ligands,PD-Ls)信号通路作用,寻找调节PCV2免疫抑制新途径,减少PCV2感染造成的经济损失。【方法】利用实验室构建的重组表达宿主菌pET32a-PD1/Rosetta(DE)进行诱导表达、纯化,获得猪可溶性PD-1蛋白(soluble PD-1,sPD-1)的诱导表达条件;制备大量具有活性的猪sPD-1蛋白,体外作用于PCV2感染的猪外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMCs),分别通过CCK-8和流式细胞术检测PBMCs的增殖情况,间接免疫荧光法和RT-qPCR检测猪sPD-1蛋白对PCV2病毒载量的影响,RT-qPCR和ELISA检测猪sPD-1蛋白对免疫相关细胞因子IL-2、IL-12、IL-21、IL-17A和IFN-γ等的转录水平和分泌水平的影响。【结果】通过诱导表达、纯化获得了高纯度、高活性的重组猪sPD-1蛋白。与未使用猪sPD-1蛋白处理的PCV2感染PBMCs组相比,10μg·mL−1猪sPD-1蛋白处理的猪PCV2病毒载量下降至1000 copies·μL−1以下;CCK-8检测结果显示猪sPD-1蛋白处理组细胞增殖指数显著提高(P<0.05);流式细胞术检测发现猪sPD-1蛋白组的平均荧光强度为(68.60±10.14)%,相对于PCV2病毒组(28.70±3.18)%显著增强(P<0.05);反转录荧光定量PCR和ELISA检测,发现猪sPD-1蛋白处理组的细胞因子IL-2、IL-12和IFN-γ的转录水平和分泌水平显著升高(P<0.05)。【结论】猪sPD-1蛋白可以通过阻断PD-1/PD-Ls通路降低PCV2的病毒载量,促进PBMCs的增殖,增强PBMCs细胞因子的转录水平和分泌水平免疫反应。因此,猪sPD-1蛋白在体外可以增强PCV2感染PBMCs的免疫反应,进一步为病毒性疾病的防控提供理论依据。
