大肠杆菌利用不同碳源生产N-乙酰神经氨酸的研究

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作者 伊进行 宗媛 +8 位作者 孙超 张晓雨 耿自豪 孙文超 张春月 刘政凯 熊雯雯 唐宇琳 马倩 《食品与发酵工业》 CAS 北大核心 2025年第1期18-25,共8页

N-乙酰神经氨酸是最常见的一种唾液酸,通常位于细胞膜表面糖蛋白和糖脂的末端,具有多种生物学功能。由于其独特的生理和生化性质,N-乙酰神经氨酸在制药、化妆品和食品行业的应用越来越广泛,需求量不断增加。N-乙酰神经氨酸在大肠杆菌中... N-乙酰神经氨酸是最常见的一种唾液酸,通常位于细胞膜表面糖蛋白和糖脂的末端,具有多种生物学功能。由于其独特的生理和生化性质,N-乙酰神经氨酸在制药、化妆品和食品行业的应用越来越广泛,需求量不断增加。N-乙酰神经氨酸在大肠杆菌中的异源生物合成需要与中心碳代谢过程竞争前体物,因此,碳源利用效率,以及碳代谢流在细胞生长与N-乙酰神经氨酸合成中的分配,直接影响N-乙酰神经氨酸的合成效率。该研究从碳源利用调控角度,比较了葡萄糖、甘油,以及两者混合利用对N-乙酰神经氨酸合成的影响。在单一葡萄糖碳源条件下,菌株NEU5AC-2中pfkA的敲除减弱了中心碳代谢的强度,减少了副产物乙酸的积累,协调了前体物N-乙酰甘露糖胺与磷酸烯醇式丙酮酸的供应,5 L发酵罐分批补料发酵38 h产生23.8 g/L N-乙酰神经氨酸,获得了较高的发酵生产水平,具有较强的工业应用潜力。该研究可以为其他以糖酵解途径的中间代谢物为前体物的异源产物合成提供借鉴。 展开更多

关键词 大肠杆菌 n-乙酰神经氨酸 混合碳源 代谢工程

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N-乙酰神经氨酸中通过抑制Nrf2轴促进缺氧/复氧损伤的H9C2心肌细胞发生铁死亡

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作者 季春斐 左宗超 +1 位作者 王钧 李妙男 《南方医科大学学报》 北大核心 2025年第1期72-79,共8页

目的基于铁死亡探讨N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)加剧H9C2大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤(H/RI)的影响及作用机制。方法以大鼠心肌细胞株H9C2细胞作为研究对象,将细胞分为Control组、H/R 0 h组、H/R 3 h组、H/R 6 h组、H/R 9 h组、H/R 12 h组和H/... 目的基于铁死亡探讨N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)加剧H9C2大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤(H/RI)的影响及作用机制。方法以大鼠心肌细胞株H9C2细胞作为研究对象,将细胞分为Control组、H/R 0 h组、H/R 3 h组、H/R 6 h组、H/R 9 h组、H/R 12 h组和H/R 15 h组,在缺氧缺糖8 h,分别复氧复糖0、3、6、9、12、15 h建立细胞缺氧/复氧损伤模型模拟心肌缺血再灌注损伤,通过实验选择最佳复氧时间进行后续实验。根据最佳复氧时间,复氧时给予不同Neu5Ac浓度的完全培养基作为复氧液,将细胞分为Control、0、5、10、20、30、40、50、60 mmol/L组,通过实验选择最佳药物浓度进行后续实验。根据前述最佳复氧时间和最佳给药浓度探讨Neu5Ac对H9C2心肌细胞加剧损伤的机制,将H9C2心肌细胞分为5组:Control组、H/R组、H/R+Neu5Ac组、H/R+Fer-1(铁死亡抑制剂)组、H/R+Neu5Ac+Fer-1组。通过检测5组细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性,判断各组细胞氧化应激水平;使用FerroOrange荧光探针和C11 BODIPY 581/591荧光探针分别检测细胞内Fe^(2+)和脂质过氧化物(Lipid ROS)水平;此外,通过Western blotting检测Neu5Ac在H9C2心肌细胞H/RI中对核因子E2相关因子2(Nrf2)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、血红素加氧酶-1(HO-1)、铁死亡抑制蛋白1(FSP1)、胱氨酸/谷氨酸反向转运体(xCT)蛋白表达的影响。结果H9C2心肌细胞缺氧缺糖8 h后,H/R 6 h组和除H/R 9 h组之外的其他组相比,Nrf2、GPX4、HO-1、FSP1蛋白表达最少,且差异有统计学意义(P<0.001)。与Control组相比,不同浓度药物的实验组细胞活力均明显降低(P<0.0001),且随药物浓度逐渐增大,细胞活力逐渐减小,并测得该药物的半抑制浓度IC_(50)=30.07 mmol/L。选择心肌细胞未发生明显铁死亡的时间,即缺氧缺糖8 h合并复氧复糖3 h,且复氧复糖时Neu5Ac浓度为30 mmol/L进行后续实验。结果显示,Neu5Ac可以提高SOD活性,增加Fe^(2+)和Lipid ROS水平,降低Nrf2、GPX4、xCT、HO-1、FSP1等5种蛋白的表达(P<0.05)。在Neu5Ac的基础上使用Fer-1后,与H/R+Neu5Ac组相比,SOD活性下降,Fe^(2+)和Lipid ROS水平减少,Nrf2、GPX4、xCT、HO-1、FSP1等5种蛋白的表达升高(P<0.0001)。结论Neu5Ac在H/RI中加剧心肌细胞发生铁死亡可能是通过抑制Nrf2轴进而产生过多的活性氧和脂质活性氧而导致。 展开更多

关键词 n-乙酰神经氨酸 心肌细胞 缺氧/复氧损伤 铁死亡

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重组大肠杆菌全细胞催化法生产N-乙酰神经氨酸

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作者 郑蝶 杨海泉 +2 位作者 夏媛媛 沈微 陈献忠 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期38-46,共9页

N-乙酰神经氨酸具有多种生物学功能,在食品添加剂和药物合成等方面有着重要的应用。为了降低成本,作者利用重组大肠杆菌,并以含有N-乙酰葡萄糖胺的发酵液为底物进行全细胞催化生产N-乙酰神经氨酸。结果表明,在温度为30℃、转化液初始pH... N-乙酰神经氨酸具有多种生物学功能,在食品添加剂和药物合成等方面有着重要的应用。为了降低成本,作者利用重组大肠杆菌,并以含有N-乙酰葡萄糖胺的发酵液为底物进行全细胞催化生产N-乙酰神经氨酸。结果表明,在温度为30℃、转化液初始pH为6.5、底物丙酮酸浓度为1.38 mol/L、Triton X-100添加质量分数为0.4%、菌体OD_(600)为30的条件下在5 L发酵罐等条件下进行全细胞转化,可以得到N-乙酰神经氨酸180 mmol/L,摩尔转化率为65.45%。用阴离子树脂对产物进行初步分离纯化,经高效液相色谱分析证实纯化后产品为高纯度N-乙酰神经氨酸,其纯度为98.3%,结晶回收率为42.5%。作者建立并优化了一种以含有N-乙酰葡萄糖胺的发酵液为底物直接进行全细胞催化生产N-乙酰神经氨酸的工艺流程,既节约了成本,又具有可持续发展的优势。 展开更多

关键词 n-乙酰神经氨酸 发酵液 全细胞催化

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N-乙酰神经氨酸醛缩酶的固定化及固定化酶性质研究 被引量：1

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作者 王惠兰 吴金勇 +3 位作者 陈祥松 袁丽霞 朱薇薇 姚建铭 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期165-173,共9页

使用LX-1000HFA氨基树脂对N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NAL)进行固定化,并对游离酶与固定化酶的酶学性质及稳定性进行了对比研究。结果显示,最佳固定化条件为载体投放量5.0 g,固定化时间12 h,缓冲液浓度1.0 mol/L,pH7.5,温度25℃。在此条件下... 使用LX-1000HFA氨基树脂对N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NAL)进行固定化,并对游离酶与固定化酶的酶学性质及稳定性进行了对比研究。结果显示,最佳固定化条件为载体投放量5.0 g,固定化时间12 h,缓冲液浓度1.0 mol/L,pH7.5,温度25℃。在此条件下制备的固定化NAL活力最高,比酶活可达200 U/g湿载体。与游离酶相比,最适反应温度提高了5℃,最适反应pH没有变化,温度和pH耐受性明显提升。同时固定化酶储存稳定性和操作稳定性也显著增强,在4℃条件下储存10 d后其酶活仅损失6%,重复使用10次后仍保持初始酶活的80%。因此,该固定化酶具有良好的温度稳定性、pH稳定性、储存稳定性和操作稳定性,为酶法工业化生产N-乙酰神经氨酸研究提供了理论依据。 展开更多

关键词 n-乙酰神经氨酸醛缩酶 LX-1000HFA氨基树脂 固定化 酶学性质 n-乙酰神经氨酸

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不同来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶的特性及在大肠埃希菌中的表达

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作者 管艳 陈代杰 倪兵 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第7期445-448,共4页

综述了N-乙酰神经氨酸裂合酶的特性、应用及反应机理,对不同来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶进行了比较。简要阐述N-乙酰神经氨酸裂合酶在大肠埃希菌中的克隆表达及其纯化。

关键词 n-乙酰神经氨酸裂合酶 n-乙酰甘露糖胺 n-乙酰神经氨酸

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适应性进化和改造质粒稳定性促进枯草芽孢杆菌合成N-乙酰神经氨酸 被引量：4

6

作者 钱蕾 刘延峰 +2 位作者 李江华 刘龙 堵国成 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期1-6,共6页

N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,NeuAc)作为营养化学品和药物中间体在保健品和医药领域具有广泛的应用。为了提升重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)合成NeuAc的产量,首先利用NeuAc生物传感器(NeuAc-Biosensor)调控抗生素抗... N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,NeuAc)作为营养化学品和药物中间体在保健品和医药领域具有广泛的应用。为了提升重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)合成NeuAc的产量,首先利用NeuAc生物传感器(NeuAc-Biosensor)调控抗生素抗性基因表达,在抗生素存在条件下将细胞生长与NeuAc合成相关联。进而通过增加抗生素浓度进行适应性进化,促进NeuAc合成效率提升。研究结果显示,当利用NeuAc-Biosensor分别调控壮观霉素抗性基因(spc)和红霉素抗性基因(erm)时,高产菌株能够在较高抗生素浓度条件下生长。通过在培养过程中逐步增加抗生素浓度开展适应性进化,结果表明采用壮观霉素和红霉素进行双抗性适应性进化时,进化获得的菌株中假阳性率(产量未提高的菌株比例)为46.7%,显著低于采用壮观霉素或红霉素单一抗生素进化获得的菌株中假阳性率(73.3%和66.7%)。通过适应性进化与发酵验证得到1株NeuAc产量为(3.16±0.19)g/L的菌株,产量比出发菌株提高了31.7%。为进一步解决发酵过程中重组B.subtilis质粒丢失的问题,通过将必需基因folB(编码二氢喋呤醛缩酶,dihydroneopterin aldolase)插入携带NeuAc合成途径关键酶编码基因重组质粒并且敲除基因组中的folB基因,质粒的丢失率由34.1%下降至11.8%。该研究提升了重组B.subtilis合成NeuAc的产量和稳定性,为重组B.subtilis发酵法生产NeuAc奠定了基础。 展开更多

关键词 生物传感器 适应性进化 质粒稳定性 n-乙酰神经氨酸 枯草芽孢杆菌

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N-乙酰神经氨酸合成途径在枯草芽孢杆菌的构建 被引量：2

7

作者 李思杰 纪明华 +2 位作者 赵利超 史吉平 孙俊松 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2017年第16期131-135,共5页

对食品安全认可的枯草芽孢杆菌进行菌株改造,利用生物发酵法制备N-乙酰神经氨酸。首先通过基因合成获取来自枯草芽孢杆菌溶源体的P_(holin)启动子并构建了p MK4-P_(holin)-GFP质粒,转入枯草芽孢杆菌,以GFP为报告基因,对P_(holin)及其它... 对食品安全认可的枯草芽孢杆菌进行菌株改造,利用生物发酵法制备N-乙酰神经氨酸。首先通过基因合成获取来自枯草芽孢杆菌溶源体的P_(holin)启动子并构建了p MK4-P_(holin)-GFP质粒,转入枯草芽孢杆菌,以GFP为报告基因,对P_(holin)及其它常见的强启动子进行了转录效率的比较,然后将优化后的P_(holin)用于构建N-乙酰神经氨酸表达质粒p MK4-P_(holin)-neu BC。研究结果显示:P_(holin)启动子是一种优异的枯草芽孢杆菌组成型强启动子,在利用LB进行发酵培养的实验中,P_(holin)的转录效率为同样方式构建下的P43启动子的2.62倍。通过N-乙酰神经氨酸表达质粒,可以成功地在枯草芽孢杆菌168菌株中实现N-乙酰神经氨酸的重组生产,摇瓶培养中N-乙酰神经氨酸的产量为0.226 g/L。本文为枯草芽孢杆菌进行N-乙酰神经氨酸的工业化发酵生产奠定了研究基础。 展开更多

关键词 启动子 n-乙酰神经氨酸 枯草芽孢杆菌

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全细胞催化法生产N-乙酰神经氨酸的研究进展 被引量：1

8

作者 张丛丛 陈彩霞 +3 位作者 陈笑 温雅 晏礼明 陶勇 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期175-183,共9页

N-乙酰神经氨酸(N-acetyl-D-neuraminic acid,Neu5Ac)及其衍生物不仅在人体内发挥重要的生理生化功能,且已经应用到流感的预防和治疗。但已有的N-乙酰神经氨酸生产方法产量低、成本高,限制了其大规模生产和广泛应用。随着分子生物学技... N-乙酰神经氨酸(N-acetyl-D-neuraminic acid,Neu5Ac)及其衍生物不仅在人体内发挥重要的生理生化功能,且已经应用到流感的预防和治疗。但已有的N-乙酰神经氨酸生产方法产量低、成本高,限制了其大规模生产和广泛应用。随着分子生物学技术及糖组学研究的发展与成熟,一种新型的生物技术即全细胞催化法生产N-乙酰神经氨酸正成为研究的热点。旨在介绍全细胞催化技术合成N-乙酰神经氨酸的研究进展。 展开更多

关键词 n-乙酰神经氨酸 唾液酸 全细胞催化法 生物转化

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奶粉中N-乙酰神经氨酸的检测 被引量：6

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作者 李金慧 赵非 +3 位作者 刘璇 卢昊 李克峰 王旭 《中国乳品工业》 CAS 北大核心 2020年第1期47-50,共4页

建立一种高效液相色谱荧光测定奶粉中N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)含量的分析方法。该方法利用酸水解释放出奶粉中的Neu5Ac,用邻苯二胺盐(OPD)作为衍生化试剂,80℃避光衍生100 min,采用高效液相色谱荧光检测。色谱... 建立一种高效液相色谱荧光测定奶粉中N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)含量的分析方法。该方法利用酸水解释放出奶粉中的Neu5Ac,用邻苯二胺盐(OPD)作为衍生化试剂,80℃避光衍生100 min,采用高效液相色谱荧光检测。色谱条件为:用Thermo Hypersil GOLD柱(250mm×4.6mm, 5μm)分离;流动相选择超纯水-乙腈作为梯度洗脱,柱温为30℃,流速为1.0mL/min;进样体积为10μL;荧光检测器激发波长为337 nm,发射波长为448 nm。结果表明:N-乙酰神经氨酸在0.5~200μg/g范围内线性关系良好(R^2=0.9994),回收率为98%~119%,检出限为0.5μg/g。该方法具有灵敏度高,重复性好等特点,可准确测定市售奶粉中N-乙酰神经氨酸的含量。 展开更多

关键词 奶粉 n-乙酰神经氨酸 高效液相色谱荧光(HPLC-FLD)

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不同色谱技术测定乳制品中N-乙酰神经氨酸的比较研究 被引量：2

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作者 宋戈 刘九阳 +1 位作者 苗晶 李博群 《中国乳品工业》 CAS 北大核心 2022年第12期49-54,共6页

通过稀酸水解法释放N-乙酰神经氨酸,调节pH值沉淀蛋白并提取,采用CarboPacTM PA10阴离子交换柱(4.6 mm×250 mm),以醋酸钠和氢氧化钠为淋洗液进行二元梯度洗脱,脉冲安培法进行检测。比较离子交换色谱法、超高效液相色谱串联质谱法... 通过稀酸水解法释放N-乙酰神经氨酸,调节pH值沉淀蛋白并提取,采用CarboPacTM PA10阴离子交换柱(4.6 mm×250 mm),以醋酸钠和氢氧化钠为淋洗液进行二元梯度洗脱,脉冲安培法进行检测。比较离子交换色谱法、超高效液相色谱串联质谱法和液相色谱法测定乳制品中N-乙酰神经氨酸,离子交换色谱法的重复性和线性关系较好,回收率在88.9%~102.4%,精密度(RSD)为3.45%~6.75%,检出限在5 mg/kg,可准确测定乳制品中N-乙酰神经氨酸的含量。 展开更多

关键词 n-乙酰神经氨酸 乳制品 离子交换 超高效液相色谱串联质谱

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草酸水解聚唾液酸分离提纯制备N-乙酰神经氨酸

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作者 吴志波 陈祥松 +3 位作者 吴金勇 孙立洁 袁丽霞 姚建铭 《中国科学技术大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期605-611,共7页

为了探究草酸水解聚唾液酸分离提纯制备高纯度N-乙酰神经氨酸的工艺条件,以期简化工艺步骤和降低生产成本;作者重点考察了草酸对聚唾液酸的水解,首先对比了草酸和其他常规水解酸的水解效果,确定了草酸为聚唾液酸的水解酸.然后通过正交... 为了探究草酸水解聚唾液酸分离提纯制备高纯度N-乙酰神经氨酸的工艺条件,以期简化工艺步骤和降低生产成本;作者重点考察了草酸对聚唾液酸的水解,首先对比了草酸和其他常规水解酸的水解效果,确定了草酸为聚唾液酸的水解酸.然后通过正交实验确定最佳草酸水解操作参数:水解温度为90℃、水解时间为3.5 h、水解酸浓度为0.1 mol/L和聚唾液酸稀释倍数为5倍,在此条件下,聚唾液酸的水解率平均可达94%以上,水解收率可达97%以上.通过实验条件及步骤优化,得到分离提纯制备高纯度N-乙酰神经氨酸的最佳工艺.在该工艺下,红外光谱及HPLC分析证实所得产品中主要成分是N-乙酰神经氨酸,其纯度为98.5%,收率为58.4%. 展开更多

关键词 聚唾液酸 n-乙酰神经氨酸 草酸 陶瓷膜 结晶

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生物转化合成N-乙酰神经氨酸的关键因素 被引量：1

12

作者 朱德强 詹晓北 +3 位作者 吴剑荣 郑志永 赵忠胜 王永远 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期64-70,共7页

在前期工作中已构建了一株能以外源N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和胞内磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)为底物,生物转化合成N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的重组大肠杆菌,但其合成Neu5Ac的效率有待进一步提高。通过调整生物转化阶段培养基中氮源和碳源的组... 在前期工作中已构建了一株能以外源N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和胞内磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)为底物,生物转化合成N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的重组大肠杆菌,但其合成Neu5Ac的效率有待进一步提高。通过调整生物转化阶段培养基中氮源和碳源的组成,探寻Neu5Ac合成过程中的关键限制性因素。结果表明,增加唾液酸合成酶NeuB活性的措施没有提高Neu5Ac的产率,而底物之一胞内PEP的供给不足是限制Neu5Ac合成的关键性因素。通过限制转化培养基中的氮源,抑制重组大肠杆菌的生长,避免了PEP被用于细胞自身生长而更多地流向Neu5Ac合成方向;通过改用不依赖PTS跨膜转运系统的甘油作为碳源,在甘油/无氮转化培养基中Neu5Ac合成量最终达到(4.42±0.08) g/L,比初始合成条件高出10.3倍。 展开更多

关键词 唾液酸 n-乙酰神经氨酸 磷酸烯醇式丙酮酸 n-乙酰氨基葡萄糖 全细胞生物转化

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青霉素钠与氯化钠对N-乙酰神经氨酸发酵的影响

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作者 高兰兰 吴金勇 +4 位作者 袁丽霞 陈祥松 朱微微 孙立洁 姚建铭 《河南师范大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2018年第3期74-79,124,共7页

重组枯草芽孢杆菌生产N-乙酰神经氨酸的过程中,通过加入表面活性剂和抗生素等方法来改善细胞通透性,以减少产物和副产物所带来的反馈抑制,从而促进细胞生长和产物的合成.对比研究了吐温20、吐温60、吐温80及青霉素钠对重组枯草芽孢杆菌... 重组枯草芽孢杆菌生产N-乙酰神经氨酸的过程中,通过加入表面活性剂和抗生素等方法来改善细胞通透性,以减少产物和副产物所带来的反馈抑制,从而促进细胞生长和产物的合成.对比研究了吐温20、吐温60、吐温80及青霉素钠对重组枯草芽孢杆菌摇瓶和5L发酵罐发酵的影响,确定青霉素钠具有明显增强该菌种发酵产N-乙酰神经氨酸的效果.通过对青霉素钠的添加时间和添加量进行了优化,确定在10h和34h均添加200mg·L-1青霉素钠最优,使N-乙酰神经氨酸的产量达到7.17g·L-1,相比对照提高了38.42%.在利用青霉素钠提高目标产物的基础上,又通过在发酵培养基成分中添加0.75%氯化钠来改变细胞渗透压,从而增强细胞通透性.实验证明,N-乙酰神经氨酸的产量进一步增加,最终达到7.96g·L-1. 展开更多

关键词 枯草芽孢杆菌 n-乙酰神经氨酸 青霉素钠 氯化钠

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枯草芽孢杆菌发酵产N-乙酰神经氨酸的分离提纯

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作者 高兰兰 袁丽霞 +4 位作者 吴金勇 陈祥松 孙立洁 朱微微 姚建铭 《安徽农业科学》 CAS 2017年第28期1-2,35,共3页

[目的]对GRAS认证的枯草芽孢杆菌发酵所得N-乙酰神经氨酸进行分离纯化,获得安全性高的目的产物。[方法]通过沸水浴破壁、菌液分离、活性炭脱色、乙醇分步沉淀除杂、乙酸结晶以及重结晶等工艺对枯草芽孢杆菌基因工程菌株经培养所得的N-... [目的]对GRAS认证的枯草芽孢杆菌发酵所得N-乙酰神经氨酸进行分离纯化,获得安全性高的目的产物。[方法]通过沸水浴破壁、菌液分离、活性炭脱色、乙醇分步沉淀除杂、乙酸结晶以及重结晶等工艺对枯草芽孢杆菌基因工程菌株经培养所得的N-乙酰神经氨酸发酵液进行分离纯化。[结果]分离纯化后,N-乙酰神经氨酸纯度在96.0%以上。[结论]研究结果为N-乙酰神经氨酸应用于食品、保健品等领域提供了质量保障。 展开更多

关键词 枯草芽孢杆菌 n-乙酰神经氨酸 纯化

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不同处理方式对红肉中N-羟乙酰神经氨酸解离的影响 被引量：10

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作者 蒋芸 付浩 +1 位作者 冯昌雨 吴剑荣 《肉类研究》 北大核心 2015年第12期52-57,共6页

应用不同方法处理红肉(猪肉与牛肉),研究能够有效解离红肉中N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)的预处理方式。将红肉通过水煮、微波加热和有机酸腌制等不同方式进行处理,利用酸水解法释放红肉中的两种唾液酸成分Neu5G... 应用不同方法处理红肉(猪肉与牛肉),研究能够有效解离红肉中N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)的预处理方式。将红肉通过水煮、微波加热和有机酸腌制等不同方式进行处理,利用酸水解法释放红肉中的两种唾液酸成分Neu5Gc和N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac),经1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧苯(1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene,DMB)衍生化后用高效液相色谱检测其含量;另外还采用β-半乳糖苷酶水解红肉,再测定水解液中的Neu5Gc和Neu5Ac。结果表明:沸水浴处理红肉后其Neu5Gc和Neu5Ac都有一定程度的解离,水煮时间越长,红肉中Neu5Gc和Neu5Ac解离效果越好,且猪肉中的Neu5Gc相比牛肉的更容易水煮解离。采用微波炉高温处理红肉也能够解离Neu5Gc,但是解离率不超过70.0%,且处理时间影响较小;而Neu5Ac的解离率都低于Neu5Gc。红肉通过不同的弱有机酸腌制处理后Neu5Gc和Neu5Ac解离率差别不大,且醋酸腌制处理后Neu5Gc解离效果较好。另外,β-半乳糖苷酶能有效解离猪肉中Neu5Gc,水解时间越长,解离率越高。对于牛肉,Neu5Gc解离率最高为84.0%,解离效果不如猪肉。 展开更多

关键词 红肉 n-羟乙酰神经氨酸 n-乙酰神经氨酸 唾液酸

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N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因的克隆与表达

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作者 杨蕴刘 饶娆 +1 位作者 沈健 冯磊 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期57-63,共7页

目的:为了获得N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因表达的两重组菌。方法:以大肠杆菌C600染色体DNA为模板,通过引物设计和PCR扩增,克隆获得编码Neu5Ac醛缩酶基因(nanA)的片段;以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化E.coliBL21(DE3),然后将nan... 目的:为了获得N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因表达的两重组菌。方法:以大肠杆菌C600染色体DNA为模板,通过引物设计和PCR扩增,克隆获得编码Neu5Ac醛缩酶基因(nanA)的片段;以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化E.coliBL21(DE3),然后将nanA基因片段组入到pDR540载体的Ptac启动子下游,所得重组菌E.coliDH5α/pRY3的nanA基因在tac启动子控制下呈组成型表达。结果:DNA序列测定证明,该基因的开放阅读框(open read ing frame,ORF)大小为894 bp,编码298个氨基酸组成的酶蛋白;SDS-PAGE显示,纯化的目的蛋白为33 kD的单一条带。以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化E.coliBL21(DE3),在得到的转化子E.coliBL21(DE3)/pRY1中,nanA基因受lac启动子控制,无需IPTG或乳糖所诱导。在N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶的催化下合成N-乙酰-D-神经氨酸的合成效率为78.3%,结晶回收率为90.2%,总回收率为70.6%。全波长扫描分析表明:本实验室结晶品与Sigma公司商品的全波长扫描图谱有相同的特征。结论:所构建的诱导型产酶菌株E.coliBL21(DE3)/pRY1和组成型表达菌株E.coliDH5α/pRY3都可较多量的产酶。合成的结晶品具有N-乙酰-D-神经氨酸的特征。 展开更多

关键词 n-乙酰神经氨酸/遗传学 果糖-二磷酸醛缩酶 大肠杆菌/遗传学 聚合酶链反应 克隆 分子 重组 遗传 转染 遗传载体 基因表达 重组蛋白质类

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急性冠脉综合征患者血浆N-乙酰-神经氨酸水平和TIMI危险分层及临床预后之间的相关性 被引量：4

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作者 李妙男 钱少环 +9 位作者 姚卓亚 闵生萍 史晓俊 康品方 张宁汝 王效静 高大胜 高琴 张恒 王洪巨 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期1253-1258,共6页

目的探讨急性冠脉综合征(ACS)患者血浆N-乙酰-神经氨酸水平与心肌梗死溶栓治疗临床试验危险评分(TIMI危险评分)和临床预后之间的相关性。方法该研究为前瞻性单中心观察性研究,连续纳入2018年10月~2019年7月在我院拟行冠状动脉造影检查... 目的探讨急性冠脉综合征(ACS)患者血浆N-乙酰-神经氨酸水平与心肌梗死溶栓治疗临床试验危险评分(TIMI危险评分)和临床预后之间的相关性。方法该研究为前瞻性单中心观察性研究,连续纳入2018年10月~2019年7月在我院拟行冠状动脉造影检查的患者708例。收集所有患者的一般临床资料、实验室检查结果、影像学资料和介入治疗资料。根据病史和检查结果分为:ACS组(597例)和对照组(111例)。根据TIMI危险评分对ACS组患者进一步分为高危组(104例)、中危组(425例)和低危组(68例)。采用液相色谱串联质谱法检测患者的血浆Neu5Ac水平;所有患者均行冠状动脉造影检查,计算血管病变支数和Gensini评分。设计调查表,出院后对ACS组患者通过电话或门诊随访平均15个月,统计Mace事件的发生,根据Mace事件将ACS组患者分为Mace组(80例)和非Mace组(517例)。结果ACS组患者血浆Neu5Ac水平明显高于对照组(P<0.05),ROC曲线显示血浆Neu5Ac水平可以辅助ACS诊断[0.648(0.597~0.699)],敏感性为39.2%,特异性为86.5%,其临界值为288.50 ng/mL。TIMI危险分层显示,高危组患者血浆Neu5Ac水平明显高于中危组和低危组患者(P<0.05),ROC曲线显示血浆Neu5Ac水平可以协助高危组患者诊断[0.645(0.588~0.703)],敏感性为42.3%,特异性为80.1%,其临界值为327.50 ng/mL。相关性分析显示:血浆Neu5Ac与年龄、血尿酸、肌酐、脂蛋白a、D-二聚体、C反应蛋白、肌酸激酶同工酶和Gensin评分成正相关性报告P值,与高密度脂蛋白水平成负相关性报告P值。对ACS组患者随访平均15个月后,发现Mace事件组的患者血浆Neu5Ac水平明显高于非Mace事件组的患者。二元Logistic回归显示,血浆Neu5Ac水平、既往脑卒中病史是Mace事件发生的独立危险因素。结论血浆Neu5Ac水平对ACS的诊断和危险分层具有参考价值,是ACS患者临床预后的独立危险因素。 展开更多

关键词 急性冠脉综合征 血浆n-乙酰-神经氨酸 TIMI危险评分 临床预后

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N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的克隆、表达和活性测定 被引量：1

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作者 尚广东 李卓荣 王以光 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第7期391-393,432,共4页

N-乙酰 - D-神经氨酸是一类特殊的氨基糖的重要代表 ,有重要的医药应用价值。本文从大肠埃希氏菌中克隆 N-乙酰 - D-神经氨酸醛缩酶基因 ,并得到高效表达的醛缩酶。经纯化后催化活性实验结果表明 ,醛缩酶可将 N-乙酰 - D-甘露糖胺高效... N-乙酰 - D-神经氨酸是一类特殊的氨基糖的重要代表 ,有重要的医药应用价值。本文从大肠埃希氏菌中克隆 N-乙酰 - D-神经氨酸醛缩酶基因 ,并得到高效表达的醛缩酶。经纯化后催化活性实验结果表明 ,醛缩酶可将 N-乙酰 - D-甘露糖胺高效率地转化为 N-乙酰 - D-神经氨酸 ,表现出较高的催化活性。本工作为 N-乙酰 - D-神经氨酸酶的大规模催化合成奠定了基础。 展开更多

关键词 n-乙酰-D-神经氨酸 醛缩酶 基因克隆 活性测定

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N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因的克隆及表达

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作者 卢利平 陈献忠 +3 位作者 周俊波 沈微 杨海泉 樊游 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第9期1000-1007,共8页

N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(AGE)是合成N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)的关键酶。该酶的高效表达是提高全细胞细胞催化法合成Neu5Ac的有效途径。根据集胞藻(Synechocystis sp. PCC 6803)AGE编码基因slr1975序列信息和大肠杆菌密码子偏... N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(AGE)是合成N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)的关键酶。该酶的高效表达是提高全细胞细胞催化法合成Neu5Ac的有效途径。根据集胞藻(Synechocystis sp. PCC 6803)AGE编码基因slr1975序列信息和大肠杆菌密码子偏好性,优化密码子并人工合成目的基因序列slr975-co。将该基因克隆到表达载体pET28a中,构建了重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-slr并实现了目的基因的诱导表达。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白质的相对分子质量在43 000左右,与预期大小一致,纯化产物蛋白质质量浓度约为1.7 g/L。重组AGE的最适反应温度为42℃,最适反应pH为6.0。AGE对GlcNAc、ManNAc的Km值分别为39.0、46.5 mmol/L。以分别表达AGE和N-乙酰神经氨酸裂合酶(NanA)的重组大肠杆菌作为催化剂,以N-乙酰-D-葡萄糖胺为底物,实现了N-乙酰-D-神经氨酸的全细胞催化合成。结果表明,对AGE密码子进行优化实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达,为全细胞催化法高效合成N-乙酰-D-神经氨酸奠定了坚实的基础。 展开更多

关键词 n-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶 大肠杆菌 基因克隆 酶学性质 n-乙酰-D-神经氨酸

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AAPBA@KCC-1的合成及其对血清中唾液酸和神经节苷脂的分析应用 被引量：6

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作者 田华君 薛芸 +2 位作者 陈巧梅 王彦 阎超 《色谱》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期473-481,共9页

将3-丙烯酰胺基苯硼酸(AAPBA)修饰在介孔二氧化硅KCC-1的表面,合成AAPBA@KCC-1材料,并通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜、N_2吸附解吸附测试和X射线光电子能谱对其进行表征;将AAPBA@KCC-1材料作为分散固相萃取(dSPE)的吸附剂,对血清... 将3-丙烯酰胺基苯硼酸(AAPBA)修饰在介孔二氧化硅KCC-1的表面,合成AAPBA@KCC-1材料,并通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜、N_2吸附解吸附测试和X射线光电子能谱对其进行表征;将AAPBA@KCC-1材料作为分散固相萃取(dSPE)的吸附剂,对血清样品中的唾液酸和神经节苷脂(GLS)进行提取和富集;采用傅里叶变换离子回旋共振质谱法和超高效液相色谱-离子淌度-四极杆飞行时间质谱法分别对AAPBA@KCC-1材料吸附得到的唾液酸和神经节苷脂进行分析。结果表明,AAPBA@KCC-1材料能够有效吸附唾液酸和神经节苷脂,简化了样品前处理的操作,可以进一步应用于生物样品中唾液酸和神经节苷脂的研究。 展开更多

关键词 分散固相萃取 介孔二氧化硅KCC-1 3-丙烯酰胺基苯硼酸 n-乙酰神经氨酸 唾液酸 神经节苷脂

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