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抗病毒蛋白MxA的诱导和检测方法的实验研究 被引量：8
1
作者 杨吉成 盛伟华 +2 位作者 李丽娥 贡海蓉 徐仑 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期77-79,共3页
目的 研究抗病毒蛋白ＭｘＡ的表达及其活性。方法用ＩＦＮα２ｂ或３型腺病毒（Ａ＿３）分别对ＷＩ－３８细胞或人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）作用 １２或２４ ｈ，并用Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ法或ＦＡＣＳ法，分别对Ｍ蛋白的表达进... 目的 研究抗病毒蛋白ＭｘＡ的表达及其活性。方法用ＩＦＮα２ｂ或３型腺病毒（Ａ＿３）分别对ＷＩ－３８细胞或人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）作用 １２或２４ ｈ，并用Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ法或ＦＡＣＳ法，分别对Ｍ蛋白的表达进行定性和定量检测。采用微量细胞病变抑制法，对重组的ＭｘＡ和ＩＦＮα２ｂ进行抗病毒效应实验。结果 （１）低浓度的 ＩＦＮα２ｂ（＞ １×1０～＃ＩＵ／Ｌ）和Ａｄ＿３（＞２００ ＴＣＩＤ＿５０），均可诱导相应细胞表达 ＭｘＡ；（２）１０μｇ／Ｌ ＭｘＡ可抵抗２０个 ＴＣＩＤ＿（５０）的 ＨＳＶ－Ｉ、Ｐｏｌｉｏ． Ｖ感染 Ｖｅｒｏ细胞、Ａｄ＿３感染ＨｅＬａ细胞，抵抗２００个ＴＣＩＤ＿（５０）的ＶＳＶ感染Ｗｉｓｈ细胞。结论ＭｘＡ只能由干扰素（ＩＮＦα2ｂ）或病毒诱导产生，其具有广谱的抗病毒活性。 展开更多
关键词 mxa 基因表达调控 INFα2b 腺病毒 微量细胞病变抑制试验
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鸡MxA基因的克隆、表达及生物学活性检测 被引量：9
2
作者 陈蕾 江国托 常维山 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第11期1018-1020,1024,共4页
目的克隆鸡MxA基因,构建其原核表达质粒,并诱导其在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法采用RT-PCR方法从鸡成纤维细胞(CEF)中扩增MxA,将其克隆至克隆载体pMD18-T中,筛选阳性克隆后回收目的片段,将其克隆入原核表达质粒pGEX-6p-1,构建其重组... 目的克隆鸡MxA基因,构建其原核表达质粒,并诱导其在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法采用RT-PCR方法从鸡成纤维细胞(CEF)中扩增MxA,将其克隆至克隆载体pMD18-T中,筛选阳性克隆后回收目的片段,将其克隆入原核表达质粒pGEX-6p-1,构建其重组表达质粒pGEX-MxA,以IPTG诱导表达,经SDS-PAGE、鸡胚新城疫病毒干扰试验和VSV-CEF微量细胞抑制试验进行分析、鉴定。结果经RT-PCR扩增获得的MxA序列与GeneBank报道的序列一致,SDS-PAGE和干扰试验证实重组质粒可以表达出相应分子量为45000的蛋白,与GST-MxA融合蛋白分子量一致。结论成功完成了鸡MxA基因的克隆及其原核表达质粒的构建,在大肠杆菌DH5α中经IPTG诱导表达了融合蛋白GST-MxA,为进一步探讨MxA的生物学活性,探索抗病毒药物的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 鸡mxa基因 基因克隆 原核表达 生物活性
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抗病毒基因MxA在鸡体内的表达
3
作者 何湃 刘莉 +3 位作者 张焕相 采克俊 张易祥 董顺利 《中国家禽》 北大核心 2008年第12期25-28,共4页
大量提取人抗病毒基因MxA的重组质粒pEGFP-C1-MxA,肌肉多点注射未成年广西土鸡,RT-PCR及免疫组化方法检测MxA基因在鸡体内各组织的分布表达。采用RT-PCR方法于注射后5d、10d在呼吸道上皮、脾脏、肌肉组织中均可检出MxA基因的转录;采用... 大量提取人抗病毒基因MxA的重组质粒pEGFP-C1-MxA,肌肉多点注射未成年广西土鸡,RT-PCR及免疫组化方法检测MxA基因在鸡体内各组织的分布表达。采用RT-PCR方法于注射后5d、10d在呼吸道上皮、脾脏、肌肉组织中均可检出MxA基因的转录;采用免疫组化方法检测到GFP和MxA基因均能在肌肉组织中得到表达,且注射5d后的表达量高于注射10d后。结果表明重组质粒肌肉多点注射可介导MxA在鸡体内多种组织中转录、表达,为进一步探讨MxA的生物学活性以及禽类抗病毒免疫制剂的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 体内表达 mxa基因 肌肉多点注射
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马MxA基因真核载体表达重组质粒的构建与鉴定
4
作者 菊林花 乌尼尔夫 +1 位作者 金花 萨仁高娃 《湖北农业科学》 北大核心 2009年第1期36-38,共3页
从马外周血单核细胞中提取RNA后,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,获得了MxAcDNA。扩增的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳回收,与pGEM-T Easy载体连接,转入大肠杆菌中筛选鉴定重组子。将质粒经酶切鉴定后,把酶切下的目的基因MxA c... 从马外周血单核细胞中提取RNA后,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,获得了MxAcDNA。扩增的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳回收,与pGEM-T Easy载体连接,转入大肠杆菌中筛选鉴定重组子。将质粒经酶切鉴定后,把酶切下的目的基因MxA cDNA进一步克隆到真核表达载体pCI-neo中,经PCR及序列鉴定,证实插入载体pCI中的片段为含有目的基因的核苷酸序列。真核表达重组质粒pCI-neo MxA cDNA的构建成功,为进一步研究马MxA蛋白的抗病毒作用奠定了基础。 展开更多
关键词 马 mxa基因 真核载体 重组质粒
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马MxA基因第12外显子多态性检测研究
5
作者 菊林花 金花 呼都特 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2009年第8期3463-3464,3467,共3页
[目的]建立检测马MxA基因第12外显子多态性的快速、准确方法。[方法]采用错配聚合酶链反应(mismatch PCR)对马MxA基因第12外显子进行扩增,对PCR产物进行限制性片段长度多态性分析(RFLP),鉴定MxA基因cDNA第1 790位核苷酸点突变,并对PCR... [目的]建立检测马MxA基因第12外显子多态性的快速、准确方法。[方法]采用错配聚合酶链反应(mismatch PCR)对马MxA基因第12外显子进行扩增,对PCR产物进行限制性片段长度多态性分析(RFLP),鉴定MxA基因cDNA第1 790位核苷酸点突变,并对PCR产物进行核苷酸序列分析。[结果]马MxA基因第12外显子区域存在AA、AB、BB3个基因型;位于cDNA序列第1 790位点的碱基发生变异(由G→C),引起了MxA蛋白编码区第562氨基酸由色氨酸变成半胱氨酸的变异;使用mismatchPCR-RFLP法所得PCR产物特异性序列,与RFLP分析结果相符。[结论]采用mismatch PCR-RFLP对马MxA基因12外显子的多态性进行检测操作简单,结果准确。 展开更多
关键词 马 mxa基因 多态性
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人MxA基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 被引量：3
6
作者 毛国强 彭明利 +4 位作者 黄琴 赵瑞秋 朱朝敏 任红 许红梅 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2006年第4期498-501,508,共5页
目的:克隆中国人MxA基因并构建含有MxA基因的重组腺病毒载体,为下一步应用其进行抗乙型肝炎基因治疗研究奠定基础。方法:从健康中国人外周血中分离单个核细胞,用Trizol试剂提取总RNA。应用逆转录PCR(RT-PCR)方法,以自行设计的引物扩增... 目的:克隆中国人MxA基因并构建含有MxA基因的重组腺病毒载体,为下一步应用其进行抗乙型肝炎基因治疗研究奠定基础。方法:从健康中国人外周血中分离单个核细胞,用Trizol试剂提取总RNA。应用逆转录PCR(RT-PCR)方法,以自行设计的引物扩增全序列MxA基因,应用基因克隆技术将MxA基因克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack(携带有绿色荧光蛋白基因)中,将线性化的pAdTrack-MxA和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同电转化入新鲜感受态大肠杆菌BJ5183中,两者在其中完成同源重组,MxA重组腺病毒质粒经卡那霉素抗性鉴别和PacI酶切确证,验证正确的MxA重组腺病毒线性化转染入293细胞中包装成完整病毒颗粒,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达并检测重组腺病毒的病毒滴度。结果:重组腺病毒穿梭质粒pAd-Track-MxA连接成功,测序结果表明克隆的MxA基因序列与GenBank中人MxA基因序列仅有5个核苷酸不同但所编码氨基酸仅1个发生改变,且此氨基酸位于非功能区。MxA重组腺病毒经PacI酶切后产生30kb和4.5kb大小2个片段表明同源重组成功。重组腺病毒经293细胞包装后可观察到绿色荧光,收获病毒并测感染滴度为1.59×108(pfu/ml),具有较高感染效率。结论:我们已成功克隆了中国人的MxA基因,并成功构建重组腺病毒质粒,为进一步应用此基因进行抗乙型肝炎基因治疗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 mxa基因 逆转录 基因克隆 腺病毒
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人MxA基因的原核表达及其抗血清的制备 被引量：1
7
作者 辛婷婷 王洪梅 +3 位作者 刘文浩 孙涛 王立群 何洪彬 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第4期18-22,共5页
本试验旨在利用大肠杆菌BL21(DE3)表达MxA融合蛋白pET32a(+)-MxA,制备兔抗人MxA抗血清。采用PCR技术获得MxA基因,然后将MxA基因重组到pET32a(+)载体中,筛选阳性克隆,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,用超声波裂解重组菌BL21(DE3)培养物,纯化... 本试验旨在利用大肠杆菌BL21(DE3)表达MxA融合蛋白pET32a(+)-MxA,制备兔抗人MxA抗血清。采用PCR技术获得MxA基因,然后将MxA基因重组到pET32a(+)载体中,筛选阳性克隆,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,用超声波裂解重组菌BL21(DE3)培养物,纯化蛋白质后免疫新西兰兔制备抗血清。SDS-PAGE分析结果显示,pET32a(+)-MxA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以包涵体形式高效表达;获得的抗血清经间接ELISA法检测效价为1∶6400;West-ern blotting检测结果显示,抗血清可与真核表达的MxA蛋白进行特异性结合。试验结果表明,在大肠杆菌中成功表达了pET32a(+)-MxA融合蛋白,制备了具有高度特异性的兔抗人MxA抗血清,这样为采用酶标法测定病毒患者全血细胞或由干扰素诱导的细胞产生的MxA蛋白质含量及临床诊断试剂盒的开发和应用打下了基础。 展开更多
关键词 mxa 原核表达 抗血清
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马MxA基因第13外显子的多态性研究
8
作者 萨仁高娃 菊林花 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2009年第6期2411-2412,共2页
[目的]研究4个品种马MxA基因第13外显子的多态性。[方法]根据GenBank中已公布的MxA基因序列设计引物,利用PCR技术从三河马、锡尼河马、乌审马和巴尔虎马血液基因组DNA中扩增MxA第13外显子基因片段,利用PCR-SSCP方法检测该基因片段多态... [目的]研究4个品种马MxA基因第13外显子的多态性。[方法]根据GenBank中已公布的MxA基因序列设计引物,利用PCR技术从三河马、锡尼河马、乌审马和巴尔虎马血液基因组DNA中扩增MxA第13外显子基因片段,利用PCR-SSCP方法检测该基因片段多态性并进行测序。[结果]只有乌审马MxA基因第13外显子存在多态性,第2 018位点发生了突变,鸟嘌呤(G)→腺嘌呤(A),由此导致氨基酸发生改变,由谷氨酸(G lu)→丙氨酸(A la)。[结论]该研究为探讨马MxA蛋白基因抗病毒作用奠定了基础。 展开更多
关键词 马 mxa基因 多态性 PCR-SSCP
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