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食品中五种致病性弧菌MPCR-DHPLc检测方法的建立 被引量：5
1
作者 邵碧英 王传得 +4 位作者 郑晶 黄晓蓉 曹际娟 陈彬 吴谦 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第10期500-504,共5页
采用试剂盒法提取5种致病性弧菌(霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和拟态弧菌)的基因组DNA。分别合成5对特异性引物,对PCR反应体系进行优化后,建立了5种致病性弧菌间的MPCR-DHPLC检测方法。二重PCR-DHPLC检测灵敏度可达到100... 采用试剂盒法提取5种致病性弧菌(霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和拟态弧菌)的基因组DNA。分别合成5对特异性引物,对PCR反应体系进行优化后,建立了5种致病性弧菌间的MPCR-DHPLC检测方法。二重PCR-DHPLC检测灵敏度可达到100CFU/ml。建立的MPCR-DHPLC方法在食品中弧菌的检测上具有很好的应用价值。 展开更多
关键词 弧菌 基因组DNA 多重pcr 变性高效液相色谱
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Ⅰ型鸭肝炎病毒PCR-DHPLC检测方法的建立 被引量：6
2
作者 孙涛 肖西志 +4 位作者 徐彪 梁成珠 凌宗帅 张太翔 岳志芹 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第7期13-18,共6页
用RT-PCR结合变性高效液相色谱技术(DHPLC),建立Ⅰ型鸭肝炎病毒的快速检测方法。根据获得的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV I)RNA聚合酶基因序列,应用Primer Premier5.0软件设计了1对引物,RT-PCR扩增产物经变性高效液相色谱进行快速检测。以正常鸭... 用RT-PCR结合变性高效液相色谱技术(DHPLC),建立Ⅰ型鸭肝炎病毒的快速检测方法。根据获得的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV I)RNA聚合酶基因序列,应用Primer Premier5.0软件设计了1对引物,RT-PCR扩增产物经变性高效液相色谱进行快速检测。以正常鸭胚尿囊液、正常鸭肝组织、鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒、H5N1亚型禽流感病毒、鸭源新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒作对照进行特异性检测;将强毒株核酸稀释成不同梯度,做灵敏度检测;同时将该方法与病毒分离和荧光定量RT-PCR方法做人工感染样品的平行检测。结果表明,该方法有很好的特异性,且灵敏度高,检测限可达到4 pg的DHV I核酸模板,与荧光定量PCR检测结果一致。PCR-DHPLC对DHVⅠ强毒株人工感染鸭组织脏器的检测结果与荧光定量PCR检测结果的阳性检出率均为100%,对脑、脾、肺病料的检出率显著(P≤0.01)高于病毒分离,PCR-DHPLC与荧光RT-PCR检测方法相比较,两种方法检测DHVⅠ的符合率为100%。研究表明该方法可用于诊断Ⅰ型鸭肝炎病毒,是一种有效的新方法。 展开更多
关键词 Ⅰ型鸭肝炎病毒 RT-pcr 变性高效液相色谱
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禽肉产品中禽流感与新城疫多重PCR-DHPLC检测方法的建立 被引量：5
3
作者 孙涛 徐彪 +4 位作者 朱来华 张太翔 梁成珠 凌宗帅 岳志芹 《中国动物检疫》 CAS 2011年第3期41-45,51,共6页
应用多重RT-PCR反应(mRT-PCR)结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立禽产品中禽流感病毒和新城疫病毒的快速检测方法。以禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单相RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立多重RT-PCR(mRT-PCR)同... 应用多重RT-PCR反应(mRT-PCR)结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立禽产品中禽流感病毒和新城疫病毒的快速检测方法。以禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单相RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立多重RT-PCR(mRT-PCR)同时检测禽流感和新城疫,其PCR扩增产物经DHPLC技术进行快速检测分析后,检测极限分别达10-0.5ELD50/0.1mL和10-1.5ELD50/0.1mL。与普通凝胶电泳比较,敏感性高2个数量级。特异性试验表明,mRT-PCR-DHPLC仅检测到禽流感病毒与新城疫病毒,而对其他5种禽类病原体和SPF鸡胚尿囊液均未检测到阳性吸收峰。所建立的方法检测不同亚型禽流感病毒29株、不同来源及不同毒力的新城疫病毒16株,结果与实时荧光定量PCR检测结果完全一致;与病原分离法同时检测人工感染鸡的组织脏器,两种方法检测禽流感的符合率为94.4%(34/36),检测新城疫的符合率为95.4%(21/22)。病原分离法的检出率虽高于DHPLC方法,但经统计学分析两者差异不显著,两种方法同时对27份进口鸡胗样品与90份棉拭子样品进行检测,阴性符合率为100%,可适用于进出口禽肉产品的检测。 展开更多
关键词 禽流感病毒 新城疫病毒 多重RT-pcr 变性高效液相色谱
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应用MPCR-DHPLC技术检测转基因大豆及其食品 被引量：3
4
作者 陶然 郭顺堂 《大豆科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期976-979,共4页
利用多重PCR结合DHPLC技术,建立了高通量快速筛选检测转基因大豆及其食品的方法,确立了转基因大豆品系鉴定方法。该筛选方法的检测灵敏度为0.078 ng.μL-1,质粒检测灵敏度为1×103拷贝.μL-1。利用该方法对转基因大豆GT-40-3-2、Mon... 利用多重PCR结合DHPLC技术,建立了高通量快速筛选检测转基因大豆及其食品的方法,确立了转基因大豆品系鉴定方法。该筛选方法的检测灵敏度为0.078 ng.μL-1,质粒检测灵敏度为1×103拷贝.μL-1。利用该方法对转基因大豆GT-40-3-2、Mon89788、A5704-12和大豆食品曲奇饼干、含大豆的调味粉、干豆腐及非转基因黑大豆进行验证,效果良好。所建立的PCR-DHPLC检测方法能同时快速准确的检测大豆及加工食品中转基因成分。 展开更多
关键词 多重pcr DHPLC 转基因大豆
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PCR结合变性高效液相色谱法与荧光定量PCR法在检测禽白血病中的比较与应用
5
作者 孙涛 张太翔 +3 位作者 徐彪 梁成珠 朱来华 岳志芹 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第11期157-162,共6页
本研究旨在比较PCR结合变性高效液相色谱技术(PCR-DHPLC)与荧光定量PCR(Real-time PCR)两种方法在检测禽白血病中的应用。根据禽白血病pol基因序列,设计1对引物和1条探针,利用引物进行禽白血病模板的RT-PCR扩增,产物经变性高效液相色谱... 本研究旨在比较PCR结合变性高效液相色谱技术(PCR-DHPLC)与荧光定量PCR(Real-time PCR)两种方法在检测禽白血病中的应用。根据禽白血病pol基因序列,设计1对引物和1条探针,利用引物进行禽白血病模板的RT-PCR扩增,产物经变性高效液相色谱上样处理;利用引物及探针进行荧光定量PCR扩增,结果与PCR-DHPLC进行比对。两种方法同时用正常鸡胚尿囊液、鸭瘟病毒、传染性支气管炎病毒、鹅细小病毒、H5N1亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、减蛋综合症病毒做特异性检测;以稀释成不同梯度的AV228毒株核酸做敏感性检测。试验结果表明PCR-DHPLC方法只对禽白血病病原有阳性扩增的吸收峰,Real-time PCR也只对禽白血病病原有阳性扩增,两法均对其他禽源病毒核酸无特异性扩增;PCR-DHPLC与Real-time PCR法相比,灵敏度虽低于Real-time PCR 1个数量级,但检测限仍可达到3pg核酸模板。两种方法均能检测到感染鸡的泄殖腔拭子所采集的病毒量。采集120份蛋鸡棉拭子同时进行临床检测,两种方法检测ALV的符合率为100%(15/120)。研究表明两种方法均可用于诊断禽白血病病毒。 展开更多
关键词 禽白血病病毒 RT-pcr 变性高效液相色谱
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多重PCR-变性高效液相色谱检测食品中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌 被引量：6
6
作者 徐君怡 曹际娟 +2 位作者 郑秋月 裴轶君 于珂 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期207-212,共6页
本研究应用多重PCR反应(mPCR)结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立食品中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的快速检测方法。以编码嗜热弯曲菌属的16S rRNA基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因和编码结肠弯曲菌的cdt基因为靶基因,选择3对引物,建立并... 本研究应用多重PCR反应(mPCR)结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立食品中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的快速检测方法。以编码嗜热弯曲菌属的16S rRNA基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因和编码结肠弯曲菌的cdt基因为靶基因,选择3对引物,建立并优化了鉴别空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的mPCR体系,扩增产物分别为287bp、159bp和173bp。采用22株细菌验证了该mPCR具有特异性。mPCR检测的灵敏度在DNA水平上达到空肠弯曲菌10pg/μL、结肠弯曲菌1pg/μL;在人工模拟污染样品起始污染浓度为1.5个/mL时,42℃微需氧条件下培养24h即可被检出。在随机采集的172份冷冻鸡肉类样品中,检出了18份样品为空肠弯曲菌阳性,7份样品为结肠弯曲菌阳性。本研究建立的mPCR-DHPLC方法可特异、灵敏地实现对空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的快速检测。 展开更多
关键词 空肠弯曲菌 结肠弯曲菌 多重pcr 变性高效液相色谱
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四种重要致病性分枝杆菌DHPLC检测鉴别方法的建立 被引量：8
7
作者 陈茹 毕英佐 +6 位作者 刘志玲 刘志辉 马静云 曾碧健 吴晓薇 周科 林志雄 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期41-45,52,共6页
目的运用多重核酸扩增（PCR）联合变性高效液相色谱（denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC）分析技术原理,针对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、禽分枝杆菌以及副结核分枝杆菌建立多重PCR-DHPLC快速检测方法,实现同时... 目的运用多重核酸扩增（PCR）联合变性高效液相色谱（denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC）分析技术原理,针对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、禽分枝杆菌以及副结核分枝杆菌建立多重PCR-DHPLC快速检测方法,实现同时检测鉴别四种重要致病性分枝杆菌。方法根据四种分枝杆菌特异基因序列分别设计菌种特异核酸扩增引物,通过筛选优化试验建立四重核酸扩增体系,对核酸扩增产物采用DHPLC设备进行检测分析,每一菌种的核酸扩增产物分别形成DHPLC特征峰图。对结核分枝杆菌等51株分枝杆菌标准株和分离株样品以及沙门氏菌等22株常见微生物样品进行特异性检测试验 对四种分枝杆菌特异的核酸扩增产物分别制备克隆质粒,通过对梯度稀释的阳性质粒的检测试验,进行多重PCR-DHPLC灵敏度测试 对疑似病人痰液样品和疑似发病牛的组织样品进行检测,并与细菌分离培养法进行比较以验证临床检测效果。结果该方法能快速检测鉴别上述四种分枝杆菌,检测灵敏度达到102~103基因拷贝,从131份疑似病人临床样品中检出91份结核分枝杆菌阳性,从40份来自疑似发病牛群的临床样品中检出31份牛分枝杆菌阳性,检出率均高于细菌分离培养法。结论研究表明所建立的多重PCR-DHPLC方法能快速检测鉴别四种重要致病性分枝杆菌,为人畜结核、副结核病诊断提供一种新型分子生物学技术手段。 展开更多
关键词 变性高效液相色谱 结核分枝杆菌 牛分枝杆菌 禽分枝杆菌 副结核分枝杆菌 多重pcr
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变性高效液相色谱检测空肠弯曲菌 被引量：1
8
作者 徐君怡 曹际娟 +3 位作者 刘淑艳 蒋丹 徐杨 王刚 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期854-858,共5页
目的应用多重PCR反应(multiplex PCR,mPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中空肠弯曲菌的快速检测方法。方法以编码嗜热弯曲菌属的16S rRNA基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基... 目的应用多重PCR反应(multiplex PCR,mPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中空肠弯曲菌的快速检测方法。方法以编码嗜热弯曲菌属的16S rRNA基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因为靶基因,选择2对引物,建立并优化了鉴别空肠弯曲菌的多重PCR体系,扩增产物分别为287bp、159 bp。采用22株细菌验证了该多重PCR具有特异性。PCR检测的灵敏度在DNA水平上达到10 pg/μL;在人工模拟污染样品起始污染浓度为1.5个/mL时,42℃微需氧条件下培养24 h可被检出。结果在随机采集的172份冷冻鸡肉类样品中,检出了18份样品为空肠弯曲菌阳性。结论本研究建立的多重PCR-DHPLC方法可特异、灵敏地实现对空肠弯曲菌的快速检测。 展开更多
关键词 空肠弯曲菌 多重pcr 变性高效液相色谱 DHPLC
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6616例脊髓性肌萎缩症携带者筛查及高风险胎儿产前诊断分析 被引量：21
9
作者 徐盈 黎昱 +4 位作者 宋婷婷 詹瑛 郭芬芬 陈必良 张建芳 《实用妇产科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期42-47,共6页
目的:探讨脊髓性肌萎缩症(SMA)携带者筛查及产前诊断分析的临床价值。方法:应用多重PCR联合变性高效液相色谱法(PCR-DHPLC)技术和Sanger测序法对6616例孕妇(早孕产检孕妇6609例和具有SMA阳性家族史孕妇7例)进行SMN1、SMN2基因筛查与诊断... 目的:探讨脊髓性肌萎缩症(SMA)携带者筛查及产前诊断分析的临床价值。方法:应用多重PCR联合变性高效液相色谱法(PCR-DHPLC)技术和Sanger测序法对6616例孕妇(早孕产检孕妇6609例和具有SMA阳性家族史孕妇7例)进行SMN1、SMN2基因筛查与诊断,并对高风险胎儿进行产前基因分析。结果:①在6609例早孕产检孕妇中发现123例孕妇(检出率1.86%)可能是SMA的携带者,其中由于SMN1缺失形成的携带者84例(1.27%),SMN1转换成SMN2基因形成的携带者35例(0.53%),SMA携带者为SMN1∶SMN2=1∶0的样本4例(0.06%)。另外,丈夫同为SMA携带者21例(SMN1缺失形成的携带者14例,SMN1转换成SMN2基因形成的携带者7例)。②7例SMA阳性家族史孕妇中发现:2例先证者明确为SMN1基因exon7纯合缺失;4例先证者通过父母基因型推测可能为SMN1基因exon7纯合缺失;另1例SMA先证者通过PCR-DHPLC技术检测出SMN1基因exon7拷贝数为1,同时通过Sanger测序法发现该SMA先证者样本在SMN1基因上也存在c.570 G>A(p.Trp190*)杂合突变,为复合杂合突变。③对28例高风险胎儿进行产前基因诊断分析,其中SMN1基因型异常胎儿6例,胎儿可能为SAM携带者13例,胎儿基因型正常者9例。SMN1基因型异常胎儿6例均引产,16例出生后随访生长发育未见异常,4例继续妊娠,2例失访。结论:PCR-DHPLC技术可以对大部分人群和SMA患者进行筛查与诊断,且能对SMN1和SMN2拷贝数进行鉴定,少数复合杂合突变病例需要结合Sanger测序方法。对高风险家系孕妇行介入性产前基因诊断,对于优生优育、有效预防SMA胎儿的出生具有重要的临床意义。 展开更多
关键词 脊髓性肌萎缩症 携带者筛查 多重pcr联合变性高效液相色谱法 产前基因诊断
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