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稳定表达流感病毒PR8 HA蛋白MDCK细胞系的建立及鉴定 被引量：3
1
作者 黄海碧 滕巧泱 +5 位作者 王朝霞 戴晓光 张树梅 张旭 申之义 李泽君 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第7期517-520,共4页
为建立稳定表达流感病毒(IV)HA蛋白的MDCK细胞系,本研究利用含有嘌呤霉素抗性基因的pMX载体,在启动子下游的AgeⅠ和NotⅠ两个限制性内切酶位点之间插入PR8株HA基因的开放阅读框,构建重组质粒pMX-PR8HA,将pMX-PR8 HA与3个分别表达VSVG、g... 为建立稳定表达流感病毒(IV)HA蛋白的MDCK细胞系,本研究利用含有嘌呤霉素抗性基因的pMX载体,在启动子下游的AgeⅠ和NotⅠ两个限制性内切酶位点之间插入PR8株HA基因的开放阅读框,构建重组质粒pMX-PR8HA,将pMX-PR8 HA与3个分别表达VSVG、gag/pol和NF-KB的重组质粒共转染293T细胞,获得逆转录病毒样颗粒。用含有逆转录病毒样颗粒的细胞培养上清液感染MDCK细胞,利用嘌呤霉素进行筛选、纯化得到稳定表达PR8株HA蛋白的细胞系。连续传10代后,进行PCR、RT-PCR、IFA和western blot鉴定,结果表明,获得了能够稳定表达IV PR8株HA蛋白的MDCK细胞系。该细胞系的建立有望为IV表达外源基因提供可靠的培养细胞系。 展开更多
关键词 流感病毒 mdck细胞系 HA基因 稳定表达
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稳定表达跨膜丝氨酸蛋白酶2基因的MDCK细胞系的建立 被引量：2
2
作者 吕让 王丹 +2 位作者 宋彩玲 齐宾宾 刘明 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期704-707,共4页
为建立稳定表达跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)基因的MDCK细胞系,本研究采用RT-PCR扩增TMPRSS2基因,克隆于逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒pLXSN-TMPRSS2。采用脂质体转染的方式将重组质粒pLXSN-TMPRSS2、pGP和pE-ampho共转染293T细胞... 为建立稳定表达跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)基因的MDCK细胞系,本研究采用RT-PCR扩增TMPRSS2基因,克隆于逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒pLXSN-TMPRSS2。采用脂质体转染的方式将重组质粒pLXSN-TMPRSS2、pGP和pE-ampho共转染293T细胞,获得逆转录病毒样颗粒。将逆转录病毒样颗粒感染MDCK细胞,经G418加压筛选和有限稀释法克隆及RT-PCR和间接免疫荧光(IFA)等试验的鉴定,建立了稳定表达TMPRSS2基因的MDCK细胞系。此外,红细胞凝集试验和IFA结果还显示,流感病毒可以在无外源胰酶存在的条件下在该细胞系中增殖,从而为流感细胞培养型病毒株的大规模生产奠定了基础。 展开更多
关键词 跨膜丝氨酸蛋白酶2 逆转录病毒 mdck细胞系 TMPRSS2
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敲除RIG-I基因流感病毒高产MDCK细胞系的建立及功能研究 被引量：4
3
作者 曾为俊 许曼 +5 位作者 王辉 鲁国涛 邵玉乐 陈洪岩 刘建华 孟庆文 《中国家禽》 北大核心 2019年第11期12-17,共6页
利用CRISPR/Cas9技术构建RIG-I基因敲除MDCK细胞株,并验证其生物学功能。试验设计并构建了2个靶向RIG-I基因的导向RNA(sgRNA)表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染MDCK细胞,采用PAGE胶基因型检测、定点测序和Western blot筛选细胞株... 利用CRISPR/Cas9技术构建RIG-I基因敲除MDCK细胞株,并验证其生物学功能。试验设计并构建了2个靶向RIG-I基因的导向RNA(sgRNA)表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染MDCK细胞,采用PAGE胶基因型检测、定点测序和Western blot筛选细胞株;通过荧光定量PCR检测H9N2亚型禽流感病毒(AIV)感染后MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平和病毒基因拷贝数,测定TCID50。结果表明:获得两株稳定敲除RIG-I基因的MDCK细胞(MDCK-RIG-I-/-),Western blot检测RIG-I蛋白不表达;荧光定量PCR结果显示病毒感染后MDCK-RIG-I-/-的MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平显著降低,表明RIG-I基因敲除后RIG-I-Ⅰ型干扰素信号通路受阻;病毒基因拷贝数、TCID50测定结果显示,差异最高可分别达到野生型MDCK的2.16倍、3.19倍,表明RIG-I基因敲除后流感病毒复制增加。该研究利用CRISPR/Cas9技术建立了敲除RIG-I基因流感病毒MDCK细胞株,为研究RIG-I天然免疫应答机制奠定基础;该技术方法和策略也为流感疫苗生产及产业更新换代提供候选细胞株。 展开更多
关键词 RIG-I CRISPR/Cas9 mdck细胞系 基因敲除 H9N2亚型流感病毒
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Annexin A2基因敲除MDCK细胞系的构建 被引量：1
4
作者 黄静 高洁 +7 位作者 夏苏苏 金志颖 康琳 高姗 杨浩 辛文文 赵宝华 王景林 《动物医学进展》 北大核心 2019年第5期13-17,共5页
应用Crispr/Cas9基因编辑技术敲除MDCK细胞中的Annexin A2基因,并验证其是否为ε毒素在MDCK细胞表面的受体。根据Crispr/Cas9靶点设计原则设计靶点,构建PALentiCRISPR v2重组质粒。借助Crispr/Cas9技术,将构建好的质粒转染至MDCK细胞中... 应用Crispr/Cas9基因编辑技术敲除MDCK细胞中的Annexin A2基因,并验证其是否为ε毒素在MDCK细胞表面的受体。根据Crispr/Cas9靶点设计原则设计靶点,构建PALentiCRISPR v2重组质粒。借助Crispr/Cas9技术,将构建好的质粒转染至MDCK细胞中,用嘌呤霉素筛选敲除Annexin A2蛋白的MDCK细胞株,并通过测序和Western blot验证敲除效果。通过细胞毒性试验验证MDCK细胞膜表面的Annexin A2蛋白是否为ε毒素的受体蛋白。测序结果和Western blot结果表明,通过Crispr/Cas9技术成功敲除了MDCK细胞的Annexin A2基因,但细胞毒性试验结果表明,敲除Annexin A2基因并不能减弱ε毒素对MDCK细胞的毒性。结果表明,Annexin A2蛋白不是ε毒素在MDCK细胞表面的受体,研究结果为今后MDCK细胞其他蛋白的敲除提供了试验方法,构建的Annexin A2基因敲除的MDCK细胞也为Annexin A2蛋白引起的其他疾病的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 Crispr/Cas9技术 基因敲除 ANNEXIN A2 mdck细胞系
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稳定表达人、马Tetherin蛋白的MDCK细胞系的构建及其限制流感病毒活性的研究 被引量：1
5
作者 王美月 张振宇 王晓钧 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期626-629,共4页
为评估人、马Tetherin(hu Tetherin、eq Tetherin)限制流感病毒的活性,本研究将huTetherin、eqTetherin克隆于慢病毒表达载体pLPCX中,分别构建重组质粒pLPCX-HA-hu Tetherin、pLPCX-HA-eqTetherin,并构建pLPCX-HA作为阴性对照。将上述... 为评估人、马Tetherin(hu Tetherin、eq Tetherin)限制流感病毒的活性,本研究将huTetherin、eqTetherin克隆于慢病毒表达载体pLPCX中,分别构建重组质粒pLPCX-HA-hu Tetherin、pLPCX-HA-eqTetherin,并构建pLPCX-HA作为阴性对照。将上述构建的重组质粒,pVSV-G以及pcGP共转染293T细胞,获得假病毒后感染MDCK细胞,并利用嘌呤霉素筛选、纯化,建立稳定表达huTetherin和eqTetherin的MDCK细胞系。经western blot鉴定显示,该细胞系中huTetherin和eqTetherin可稳定表达。以反向遗传救获的马流感病毒(A/equine/Jilin/1/1989)(JL89)感染这两种细胞系,结果显示eqTetherin和huTetherin均对该流感病毒株具有显著限制作用。该研究为进一步评价和探索huTetherin和eqTetherin限制流感病毒的作用和机制奠定了基础。 展开更多
关键词 人、马Tetherin mdck细胞系 流感病毒
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基于CRISPR/Cas9技术的全基因组基因编辑MDCK细胞文库的构建
6
作者 朱媛媛 许榜丰 +5 位作者 闫鸣昊 刘芹防 滕巧泱 苑纯秀 李雪松 李泽君 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第4期17-24,共8页
本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,首先靶向犬全基因组设计合成转录sgRNA的DNA文库,并将DNA文库全部克隆于lentiCRISPR v2慢病毒转移载体上,高通量测序结果显示文库覆盖度高、均一性良好。将质粒文库和慢病毒包装系统质粒共转染293T细... 本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,首先靶向犬全基因组设计合成转录sgRNA的DNA文库,并将DNA文库全部克隆于lentiCRISPR v2慢病毒转移载体上,高通量测序结果显示文库覆盖度高、均一性良好。将质粒文库和慢病毒包装系统质粒共转染293T细胞,收取含慢病毒样病毒的上清液感染MDCK细胞,在最适浓度嘌呤霉素筛选下,收集嘌呤霉素抗性细胞,冻存于-80℃,提取一部分细胞的基因组,通过PCR扩增转录sgRNA的DNA,将PCR产物插入到T载体后,挑取单克隆菌落,测序表明细胞文库中转录的sgRNA具有较好的覆盖度。本实验成功构建了犬全基因组范围转录sgRNA的质粒文库,并成功构建了MDCK细胞全基因组范围的基因编辑细胞库,该文库可作为后续筛选病毒复制关键宿主因子的细胞平台。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 mdck细胞系 全基因组 基因编辑
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MDCK细胞库的建立及其生物学特性研究 被引量：7
7
作者 王家敏 平玲 +4 位作者 沈武玲 徐水林 魏园园 马忠仁 乔自林 《山西农业科学》 2012年第12期1231-1234,1261,共5页
分别从美国典型培养物保藏中心(ATCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)、北京协和细胞资源中心及某企业引进4株MDCK细胞系,扩大培养后液氮冻存,分别建立种子细胞库和工作细胞库。细胞复苏后分别对每株细胞进行了活力、形态、生长曲线、... 分别从美国典型培养物保藏中心(ATCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)、北京协和细胞资源中心及某企业引进4株MDCK细胞系,扩大培养后液氮冻存,分别建立种子细胞库和工作细胞库。细胞复苏后分别对每株细胞进行了活力、形态、生长曲线、微生物污染、核型及荧光蛋白质粒转染表达等特性研究。结果表明,4个来源的MDCK细胞均呈上皮型,生长状态良好;生长曲线呈S型;细菌、真菌、支原体检测都为阴性;染色体2n=78;外源质粒在该细胞中能进行复制和表达。建立的细胞库为开展MDCK细胞及流感细胞基质疫苗的研究提供了基础理论依据和细胞资源。 展开更多
关键词 mdck细胞系 细胞库 生物学特性
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MDCK细胞ISG15基因的克隆表达及抗病毒活性分析 被引量：1
8
作者 刘爱玲 潘杰 +3 位作者 庞运倩 于可响 马秀丽 宋敏训 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第2期154-159,共6页
为了解ISG15基因体外抗病毒机制,应用RT-PCR方法扩增了MDCK细胞的ISG15基因,经测序分析,该基因序列与Gen Bank中登录的犬属ISG15基因序列相似性为99%。将该基因亚克隆至p ET-28a载体构建出重组原核表达质粒p28a-M15;工程菌p28a-M15/BL21... 为了解ISG15基因体外抗病毒机制,应用RT-PCR方法扩增了MDCK细胞的ISG15基因,经测序分析,该基因序列与Gen Bank中登录的犬属ISG15基因序列相似性为99%。将该基因亚克隆至p ET-28a载体构建出重组原核表达质粒p28a-M15;工程菌p28a-M15/BL21经IPTG诱导表达,获得了约22 k D的重组目的蛋白,重组蛋白经Ni2+柱层析纯化。于H9N2亚型禽流感病毒S2株感染前后在MDCK细胞中定量加入纯化的ISG15蛋白,结果显示,病毒感染MDCK细胞前加入ISG15蛋白可以抑制病毒的复制,但病毒感染后添加该蛋白则促进了病毒的复制。 展开更多
关键词 ISG15 mdck细胞系 抗病毒活性 H9N2
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脂质体介导转染犬肾上皮细胞的方法改进与优化 被引量：2
9
作者 柴百惠 绳秀珍 +2 位作者 唐小千 邢婧 战文斌 《中国海洋大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2018年第A02期9-16,共8页
本文使用带绿色荧光蛋白报告基因的真核质粒pCI-neo-EGFP作为外源DNA,将脂质体介导转染犬肾上皮细胞(MDCK)的常规转染法改进为悬浮法,并比较了二者在转染36h后的转染效果,结果显示悬浮法的转染效率显著优于常规法。研究了悬浮转染法不同... 本文使用带绿色荧光蛋白报告基因的真核质粒pCI-neo-EGFP作为外源DNA,将脂质体介导转染犬肾上皮细胞(MDCK)的常规转染法改进为悬浮法,并比较了二者在转染36h后的转染效果,结果显示悬浮法的转染效率显著优于常规法。研究了悬浮转染法不同DNA用量、脂质体/DNA比例和悬浮孵育时间对转染效率和细胞活力的影响。流式细胞术检测结果显示,转染效率与DNA用量呈正相关依赖关系;在DNA用量相同时,转染效率随着脂质体/DNA比例升高呈先上升后下降的趋势;DNA用量为1μg、脂质体/DNA比例为4∶1、悬浮孵育时间为20 min时转染效率最高(21.07%±0.76%)。利用CCK-8细胞毒性试剂盒测定不同条件下的细胞活力,结果表明细胞活力随DNA用量和脂质体/DNA比例的升高及悬浮孵育时间的延长而降低,当DNA用量(0.25μg)和脂质体/DNA比例(2∶1)最低、悬浮孵育20min时,细胞活力最高(95.67%±3.72%),而转染效率最高时细胞活力为69.95%±3.01%。研究结果为进一步建立稳定转染细胞研究模型提供了基础资料。 展开更多
关键词 脂质体 瞬时转染 犬肾上皮连续细胞系(mdck) 悬浮法 转染效率 细胞活力
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