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基于副结核分枝杆菌重组MAP0827c蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立与初步应用
被引量：
1
1
作者
俞杰
许淑芸
+3 位作者
魏京京
魏增科
赵昌乐
周霞
《中国预防兽医学报》
北大核心
2025年第3期271-277,共7页
为建立快速准确检测副结核分枝杆菌(MAP)抗体的间接ELISA方法,本研究通过SignalP-5.0等相关网站分析MAP0827c蛋白的生物信息学特点,设计扩增MAP MAP0827c基因的引物,将扩增的MAP0827c基因克隆于pET-32a(+)中构建重组质粒pET32a-MAP0827c...
为建立快速准确检测副结核分枝杆菌(MAP)抗体的间接ELISA方法,本研究通过SignalP-5.0等相关网站分析MAP0827c蛋白的生物信息学特点,设计扩增MAP MAP0827c基因的引物,将扩增的MAP0827c基因克隆于pET-32a(+)中构建重组质粒pET32a-MAP0827c,并经酶切和测序鉴定正确后利用原核表达系统表达重组MAP0827c蛋白,以该蛋白作为包被抗原,采用棋盘滴定法筛选间接ELISA反应条件,确定临界值,以异源阳性血清验证该方法的特异性;通过稀释阳性血清评估所建方法的灵敏性;以5份牛MAP阳性血清进行该方法的批内和批间试验评估该方法的重复性。结果显示,MAP0827c蛋白由374个氨基酸构成,含15个抗原决定簇,不存在跨膜区和信号肽,二级结构以α螺旋为主。经原核系统表达了分子量为42 ku的目的蛋白。建立的ELISA方法蛋白最佳包被量为0.05μg/mL,一抗血清最佳稀释倍数为1:100,二抗兔抗牛IgG-HRP的最佳稀释倍数为1:5000,封闭液选择1%明胶封闭1 h,一抗血清作用时为1 h,酶标二抗孵育时间为1 h,显色时间为25 min;特异性试验结果显示,建立的间接ELISA方法仅对MAP阳性血清检测为阳性,而不与布鲁氏菌、结核分枝杆菌及金黄色葡萄球菌的牛阳性血清发生反应,特异性强;敏感性试验结果显示,可检测的阳性血清最大稀释度为1:800,敏感性高;批内和批间重复试验结果显示,变异系数均小于10%,重复性较好。采用建立的ELISA方法和商品化ELISA试剂盒对70份临床牛血清样品进行检测,结果显示,二者的阳性检出率分别为30%(21/70)和34.29%(24/70),二者的总符合率为95.71%。本研究首次建立了基于MAP0827c蛋白的检测MAP抗体的间接ELISA方法,为MAP流行病学调查和检测提供了可行技术手段。
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关键词
副结核分枝杆菌
map0827c
蛋白
原核表达
抗体
间接ELISA
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职称材料
题名
基于副结核分枝杆菌重组MAP0827c蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立与初步应用
被引量：
1
1
作者
俞杰
许淑芸
魏京京
魏增科
赵昌乐
周霞
机构
石河子大学动物科技学院
新疆昌吉回族自治州动物疾病预防控制中心
出处
《中国预防兽医学报》
北大核心
2025年第3期271-277,共7页
基金
新疆生产建设兵团第八师重点领域科技攻关项目(2023NY03-1)
新疆兵团重点领域科技攻关计划项目(2021AB012)。
文摘
为建立快速准确检测副结核分枝杆菌(MAP)抗体的间接ELISA方法,本研究通过SignalP-5.0等相关网站分析MAP0827c蛋白的生物信息学特点,设计扩增MAP MAP0827c基因的引物,将扩增的MAP0827c基因克隆于pET-32a(+)中构建重组质粒pET32a-MAP0827c,并经酶切和测序鉴定正确后利用原核表达系统表达重组MAP0827c蛋白,以该蛋白作为包被抗原,采用棋盘滴定法筛选间接ELISA反应条件,确定临界值,以异源阳性血清验证该方法的特异性;通过稀释阳性血清评估所建方法的灵敏性;以5份牛MAP阳性血清进行该方法的批内和批间试验评估该方法的重复性。结果显示,MAP0827c蛋白由374个氨基酸构成,含15个抗原决定簇,不存在跨膜区和信号肽,二级结构以α螺旋为主。经原核系统表达了分子量为42 ku的目的蛋白。建立的ELISA方法蛋白最佳包被量为0.05μg/mL,一抗血清最佳稀释倍数为1:100,二抗兔抗牛IgG-HRP的最佳稀释倍数为1:5000,封闭液选择1%明胶封闭1 h,一抗血清作用时为1 h,酶标二抗孵育时间为1 h,显色时间为25 min;特异性试验结果显示,建立的间接ELISA方法仅对MAP阳性血清检测为阳性,而不与布鲁氏菌、结核分枝杆菌及金黄色葡萄球菌的牛阳性血清发生反应,特异性强;敏感性试验结果显示,可检测的阳性血清最大稀释度为1:800,敏感性高;批内和批间重复试验结果显示,变异系数均小于10%,重复性较好。采用建立的ELISA方法和商品化ELISA试剂盒对70份临床牛血清样品进行检测,结果显示,二者的阳性检出率分别为30%(21/70)和34.29%(24/70),二者的总符合率为95.71%。本研究首次建立了基于MAP0827c蛋白的检测MAP抗体的间接ELISA方法,为MAP流行病学调查和检测提供了可行技术手段。
关键词
副结核分枝杆菌
map0827c
蛋白
原核表达
抗体
间接ELISA
Keywords
Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis in cattle
map0827c protein
prokaryotic expression
antibody
indirect ELISA
分类号
S852.61 [农业科学—基础兽医学]
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题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
基于副结核分枝杆菌重组MAP0827c蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立与初步应用
俞杰
许淑芸
魏京京
魏增科
赵昌乐
周霞
《中国预防兽医学报》
北大核心
2025
1
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