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tva受体基因起始密码子突变对清远麻鸡感染K亚群禽白血病病毒的影响
1
作者 徐慧娟 邝智祥 +4 位作者 左珂菁 吴承洋 郑泓昊 谢青梅 陈伟国 《华南农业大学学报》 北大核心 2025年第3期351-357,共7页
【目的】探究tva受体基因起始密码子突变tva c.3G>A对清远麻鸡感染K亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup K,ALV-K)的影响。【方法】利用直接测序方法对清远麻鸡不同品系tva c.3G>A突变位点进行基因分型。利用流式细... 【目的】探究tva受体基因起始密码子突变tva c.3G>A对清远麻鸡感染K亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup K,ALV-K)的影响。【方法】利用直接测序方法对清远麻鸡不同品系tva c.3G>A突变位点进行基因分型。利用流式细胞术和RT-qPCR检测RCASBP(K)-EGFP荧光报告病毒和ALV-K GD1601病毒感染清远麻鸡tva c.3G>A突变位点不同基因型鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEFs)的情况。利用RT-qPCR检测ALV-K GD1601病毒感染清远麻鸡tva c.3G>A突变位点不同基因型雏鸡的情况。【结果】tva c.3G>A突变位点的基因分型结果显示,杂合突变基因型tva c.3G/A和纯合突变基因型tva c.3A/A存在于清远麻鸡K、M品系,tva c.3G/A频率分别为0.183、0.133,tva c.3A/A频率分别为0.116、0.033。流式细胞术和RTqPCR检测结果显示,tva c.3G>A突变位点野生型tva c.3G/G CEFs对RCASBP(K)-EGFP和ALV-K GD1601病毒易感,而纯合突变基因型tva c.3A/A CEFs有效抗RCASBP(K)-EGFP和ALV-K GD1601病毒的感染,表明tva c.3G>A突变导致清远麻鸡体外抗ALV-K的感染。ALV-K攻毒试验结果表明,tva c.3G>A突变导致清远麻鸡体内抗ALV-K的感染。【结论】tva c.3G>A突变引起清远麻鸡体外、体内抗ALV-K的感染,该突变位点可作为清远麻鸡ALV-K抗性选育的遗传标记。 展开更多
关键词 清远麻鸡 k亚群禽白血病病毒 tva受体基因 突变 遗传抗性
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K亚群禽白血病病毒的分离鉴定及RPA-LFD快速检测方法的建立与应用
2
作者 喻华英 曾婷婷 +8 位作者 杨宗维 王粲 牙侯勋 万丽君 罗思思 李孟 谢芝勋 于美玲 谢丽基 《中国家禽》 北大核心 2025年第7期47-55,共9页
为满足基层实验室对K亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup K,ALV-K)检测需求,研究建立了一种基于重组酶聚合酶等温扩增-侧流层析试纸条(Recombinase polymerase amplifcation-lateral flow dipstick,RPA-LFD)的ALV-K快速检... 为满足基层实验室对K亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup K,ALV-K)检测需求,研究建立了一种基于重组酶聚合酶等温扩增-侧流层析试纸条(Recombinase polymerase amplifcation-lateral flow dipstick,RPA-LFD)的ALV-K快速检测方法。试验首先通过细胞培养分离鉴定出一株ALV-K,并以此分离株的前病毒DNA作为建立检测方法的模板;其次,针对ALV-K gp85基因保守位置设计引物和探针,优化反应体系的引物浓度、探针浓度和反应温度,在此基础上进行敏感性预试验并以预试验检测限优化反应时间;最后,以优化反应时间进行敏感性试验、稳定性试验及特异性试验。结果显示:建立的ALV-K RPA-LFD反应体系在引物浓度为0.45 mmol/L,探针浓度为0.14 mmol/L,39℃条件下反应21 min,其检测限为4.86×10^(2) copies/反应的ALV-K DNA,并且不与其他常见禽类病原体核酸发生非特异扩增反应;30份临床病料中有14份ALV-K阳性,与单重PCR方法结果一致。研究表明,建立的ALV-K RPA-LFD检测方法具有快速、特异、操作简单,不需要复杂仪器,能够直观地观察结果的优点,适用于临床快速检测ALV-K,特别是实验室条件有限的检测场景。 展开更多
关键词 家禽 k亚群禽白血病病毒 重组酶聚合酶等温扩增-侧流层析试纸条 快速检测
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K亚群禽白血病病毒gp85单因子血清的制备及其特异性鉴定 被引量：3
3
作者 孙鹏 陈孜孟 +4 位作者 赵国梁 崔宁 祖铭 崔治中 苏帅 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第2期371-376,共6页
为了制备一种快速特异性识别K亚群禽白血病病毒(ALV-K)的单因子血清,本试验将ALV-K接种DF1细胞,提取感染细胞DNA作为模板,PCR扩增1 005bp ALV-K-gp85和510bp ALV-K-gp85(fragment)基因。将其正确的阅读框插入表达载体pET-28a(+)中,转化... 为了制备一种快速特异性识别K亚群禽白血病病毒(ALV-K)的单因子血清,本试验将ALV-K接种DF1细胞,提取感染细胞DNA作为模板,PCR扩增1 005bp ALV-K-gp85和510bp ALV-K-gp85(fragment)基因。将其正确的阅读框插入表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(Rosetta)菌株中表达。将表达蛋白常规免疫昆明白小鼠制备抗血清。结果表明成功获得39.85和22.01ku的重组融合蛋白,且具有良好的免疫原性。间接免疫荧光试验(IFA)结果表明两血清均可与ALV-K反应,而不与ALV-A、ALV-B和ALV-J反应。本试验首次研制获得能特异性识别ALV-K的单因子血清,为K亚群禽白血病的快速检测奠定了基础。 展开更多
关键词 k亚群禽白血病病毒 GP85基因 表达 间接免疫荧光试验(IFA) 单因子血清
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K亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆表达及多克隆抗体的制备 被引量：1
4
作者 吕璐 胡明月 +7 位作者 邓菁菁 刘勇 李拓凡 谢菁 谢泉 邵红霞 秦爱建 叶建强 《中国家禽》 北大核心 2019年第19期55-58,共4页
研究分别将K亚群禽白血病病毒(ALV-K)的gp85基因以及env基因分别克隆到原核表达载体pColdⅠ以及真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证后分别命名为pCold-K-gp85以及pcDNA3.1-K-env。pCold-K-gp85转化BL21大肠杆菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE... 研究分别将K亚群禽白血病病毒(ALV-K)的gp85基因以及env基因分别克隆到原核表达载体pColdⅠ以及真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证后分别命名为pCold-K-gp85以及pcDNA3.1-K-env。pCold-K-gp85转化BL21大肠杆菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现,该Gp85重组蛋白主要表达在包涵体中。利用纯化后Gp85重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备了抗ALV-KGp85蛋白的多克隆抗体。间接免疫荧光以及Westernblot试验进一步证明,所获得的抗Gp85蛋白的多克隆抗体能特异性的识别转染pcDNA3.1-K-env质粒以及感染ALV-K的DF-1细胞内表达的Env蛋白。以上研究结果为进一步探究ALV-K宿主范围,细胞受体鉴定及亚群特异性诊断技术研究奠定了基础。 展开更多
关键词 k亚群禽白血病病毒 GP85基因 多克隆抗体
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K亚群禽白血病病毒细胞受体的鉴定 被引量：5
5
作者 邢立晓 俞燕 +7 位作者 于蒙蒙 常方方 包媛玲 王素艳 高立 祁小乐 王笑梅 高玉龙 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期802-808,共7页
禽白血病病毒(ALV)进入细胞启动感染依赖于其囊膜表面蛋白gp85与细胞受体的结合。K亚群ALV(ALV-K)是2012年从我国本地芦花鸡中分离到的一个ALV新亚群。为了鉴定ALV-K的细胞受体,本研究利用真核细胞表达了A和K亚群ALV gp85蛋白,并利用实... 禽白血病病毒(ALV)进入细胞启动感染依赖于其囊膜表面蛋白gp85与细胞受体的结合。K亚群ALV(ALV-K)是2012年从我国本地芦花鸡中分离到的一个ALV新亚群。为了鉴定ALV-K的细胞受体,本研究利用真核细胞表达了A和K亚群ALV gp85蛋白,并利用实验室前期拯救的重组病毒RCAS-A-GFP和RCAS-K-GFP进行病毒受体的交叉干扰试验,结果显示A亚群ALV(ALV-A)gp85蛋白能够抑制ALV-K的感染,同样ALV-Kgp85蛋白也能够抑制ALV-A的感染,存在受体交叉干扰现象,因而推测二者可能共用细胞受体。已有研究表明Tva是ALV-A的细胞受体,本研究利用Co-IP和Pull-down试验检测了ALV-Kgp85与Tva的互作,结果显示ALV-Kgp85蛋白能与可溶性的Tva(sTva)相互作用。进一步的流式细胞术结果显示ALV-Kgp85能够高效结合Tva,结合率在90%以上。为进一步验证Tva是否能介导ALV-K进入细胞,利用ALV的非易感细胞HEK293T进行了Tva受体重建试验,结果显示RCAS-K-GFP能够进入表达Tva的293T细胞并复制产生较强的绿色荧光。以上结果充分表明Tva也是ALV-K的细胞受体,能够介导ALV-K进入宿主细胞,启动其感染。该研究为阐明ALV-K侵入宿主细胞机制及抗病毒靶点筛选奠定了基础。 展开更多
关键词 k亚群禽白血病病毒 细胞受体 Tva蛋白 结合 进入
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K亚群禽白血病病毒CRISPR/Cas13a检测方法的建立及初步应用 被引量：1
6
作者 徐晴晴 王峰 +2 位作者 王文秀 莫玲 沈志强 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第3期113-119,共7页
为了快速、准确和简便地检测K亚群禽白血病病毒(ALV-K),本研究参照GenBank中ALV-K的gp85基因设计了特异的RPA引物和用于LwCas13a反应系统的crRNA,通过优化反应条件建立了检测ALV-K的CRISPR/Cas13a方法,并验证了该方法的特异性、敏感性... 为了快速、准确和简便地检测K亚群禽白血病病毒(ALV-K),本研究参照GenBank中ALV-K的gp85基因设计了特异的RPA引物和用于LwCas13a反应系统的crRNA,通过优化反应条件建立了检测ALV-K的CRISPR/Cas13a方法,并验证了该方法的特异性、敏感性和符合性。结果显示,该法对感染鸡的其他常见病毒的检测均为阴性,特异性良好无交叉反应;灵敏度为50 copies/μL;与PCR的检测结果有很好的符合性。本研究建立的CRISPR/Cas13a检测方法配合试纸条显色在1.5 h左右可对ALV-K进行快速的鉴别诊断,为该病的诊断及防控净化提供了强有力的技术支撑。 展开更多
关键词 k亚群禽白血病病毒 RPA crRNA CRISPR/Cas13a
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K亚群禽白血病病毒多克隆检测抗体的制备和特性分析
7
作者 王呈呈 冉英 +5 位作者 肖雅之 李涵 胡卫国 邱建华 李宏梅 郭慧君 《山东畜牧兽医》 2019年第12期1-4,共4页
为制备识别K亚群禽白血病病毒(ALV-K)兔源多克隆抗体,将含ALV-K gp85基因的表达质粒在大肠杆菌体内进行诱导表达,获得含his标签的大小为55KD的重组蛋白;将纯化后的表达蛋白免疫接种5只青年兔,三次加强免疫后检测收获血清抗体,ELISA检测... 为制备识别K亚群禽白血病病毒(ALV-K)兔源多克隆抗体,将含ALV-K gp85基因的表达质粒在大肠杆菌体内进行诱导表达,获得含his标签的大小为55KD的重组蛋白;将纯化后的表达蛋白免疫接种5只青年兔,三次加强免疫后检测收获血清抗体,ELISA检测血清抗体效价;对血清抗体进行纯化并检测抗体亚型,Western-blot和IFA检测抗体对ALV-Kgp85蛋白和病毒识别特性。结果表明,获得的抗体效价达到8×107,抗体亚型为IgG2b,该抗体能够特异性识别ALV-K gp85蛋白和DF1细胞中的ALVK病毒,可以用于IFA临床检测,为K亚群禽白血病的快速检测奠定了基础。 展开更多
关键词 k亚群禽白血病病毒 GP85基因 间接免疫荧光试验(IFA) 多克隆抗体
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与鸡内皮血管瘤病例相关的禽白血病病毒K亚群分离及其gp85基因演化分析
8
作者 梁灿新 郑小雪 +3 位作者 舒雪利 周婉怡 廖明 曹伟胜 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期1127-1136,共10页
本研究在华南地区某规模化种禽场调查中发现其部分花鸡品系头部鸡冠下缘及眼睑上缘部位出现白色、质地坚硬且形状不规则的肿块,为了解患病鸡的发病特征及致病因子而开展了实验室诊断及相关病原研究。结果表明该规模化养殖场主要发病鸡... 本研究在华南地区某规模化种禽场调查中发现其部分花鸡品系头部鸡冠下缘及眼睑上缘部位出现白色、质地坚硬且形状不规则的肿块,为了解患病鸡的发病特征及致病因子而开展了实验室诊断及相关病原研究。结果表明该规模化养殖场主要发病鸡群为父母代花鸡,发病率约为2%,剖检无其他肉眼表观病变,病理组织学诊断为内皮血管瘤。RT-PCR检测肿瘤组织表明为K亚群禽白血病病毒(ALV-K)感染,无其他禽肿瘤性病毒感染。对患病鸡的血浆样品(32份)、肿瘤组织匀浆(6份)及脑组织匀浆(6份)进行病毒的分离鉴定,成功从脑组织样品中分离到4个ALV-K毒株(GXJL01~GXJL04)。使用特异性引物扩增GXJL01~GXJL04的env基因并测序,在与华南地区其他5个规模化种禽场中分离获得的7个ALV-K流行株的gp85基因的遗传演化分析中表明,GXJL01~GXJL04与日本的Km5844、Sp53等神经胶质瘤毒株(fowl glioma-inducing virus, FGV)及具有神经组织嗜性的ALV-K毒株JS15SG01同一进化分支上,与本研究其他7个ALV-K分离株的遗传进化关系较远。同时在针对ALV-K的gp85蛋白氨基酸位点突变分析中发现,GXJL01~GXJL04存在多个与FGV和JS15SG01参考株相似的氨基酸位点突变。本研究首次把地方黄羽鸡品种花鸡头部的肿块诊断为内皮血管瘤,且ALV-K为内皮血管瘤的主要相关病原,分离株GXJL01~GXJL04区别于现行华南地区ALV-K流行株且与FGV、JS15SG01等神经组织嗜性的毒株高度同源。 展开更多
关键词 黄羽肉鸡 鸡内皮血管瘤 k亚群禽白血病病毒 遗传进化分析
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禽白血病受体基因Tva在四个地方鸡种分布研究 被引量：2
9
作者 沈晓鹏 李春平 +1 位作者 叶建强 李拓凡 《中国家禽》 北大核心 2021年第11期112-116,共5页
为研究抗A/K亚群禽白血病病毒受体基因Tva易感基因与抗性等位基因在四个地方鸡种中的分布,研究采集斗鸡、仙居鸡、鹿苑鸡、藏鸡血样各25份进行Tva基因扩增后测序,并对测序结果进行基因分型统计。结果显示,所测鸡群体中全部存在抗性等位... 为研究抗A/K亚群禽白血病病毒受体基因Tva易感基因与抗性等位基因在四个地方鸡种中的分布,研究采集斗鸡、仙居鸡、鹿苑鸡、藏鸡血样各25份进行Tva基因扩增后测序,并对测序结果进行基因分型统计。结果显示,所测鸡群体中全部存在抗性等位基因Tvar,且抗性等位基因在四个品种鸡群中呈现出不同程度的差异。等位基因Tva^(s)/Tva^(r4)在所测斗鸡群的频率为0.76/0.24,等位基因Tva^(s)/Tva^(r3)在所测藏鸡群中的频率为0.2/0.8,等位基因Tva^(s)/Tva^(r5)在所测鹿苑鸡群中的频率为0.48/0.52,等位基因Tva^(s)/Tva^(r4)/Tva^(r5)在所测仙居鸡群的频率为0.48/0.28/0.24。研究结果为进一步筛选与培育抗A/K亚群禽白血病病毒的鸡品系奠定基础。 展开更多
关键词 A/k亚群禽白血病病毒受体基因 斗鸡 仙居鸡 鹿苑鸡 藏鸡 抗性等位基因
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广东地方品种鸡ALV-K分子流行病学及gag基因12 bp缺失对病毒体外复制能力影响的研究 被引量：5
10
作者 郭妍妍 梁灿新 +3 位作者 李锦群 董欣怡 廖明 曹伟胜 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第11期3956-3966,共11页
为了解目前广东地方品种鸡K亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV-K)的分子特征,于2020-2021年,从广东7家(A~G)正在进行外源性ALV净化的、外观健康的规模化种禽场核心群采集抗凝血样品共8042份。通过血浆接种DF-1细胞、ELISA检测... 为了解目前广东地方品种鸡K亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV-K)的分子特征,于2020-2021年,从广东7家(A~G)正在进行外源性ALV净化的、外观健康的规模化种禽场核心群采集抗凝血样品共8042份。通过血浆接种DF-1细胞、ELISA检测p27抗原,共检出357份阳性,并对ELISA结果S/P值0.2~0.6的150份阳性样品进行PCR鉴定和env基因测序,共分离到32株ALV-K,进一步选取16株进行全基因组扩增及测序分析。结果显示,这16株ALV-K全长为7481~7496 bp,基因组符合5′-LTR-UTR-gag-pol-env-UTR-LTR-3′典型的反转录病毒结构,不含已知致癌基因;其gp85基因与ALV-K参考株位于同一进化分支上且相似性最高(>94.0%);其pol、gp37基因均比较保守,与ALV各亚群相似性均较高(>94.0%);其LTR与内源性ALV及大多数ALV-K参考株相似性最高(91.4%~99.5%),且LTR U3区与内源性ALV LTR有相同的转录调控元件;此外,观察到31.3%(5/16)的分离株在gag基因373-384位核苷酸存在12 bp的缺失,进一步以缺失株GD20 JM10为亲本,通过PCR分段扩增和同源重组的方法分别构建了缺失株(rGD20 JM10)和回补株(rGD20 JM10 A12)的cDNA克隆,将其转染DF-1细胞,ELISA和IFA结果表明,病毒拯救成功;体外复制动力学结果显示,两者差异不显著(P>0.05)。本研究所调查的广东7个种禽场的ALV-K流行株均携带内源性LTR,且分子特征较为稳定,故采用更敏感的检测技术在开展ALV净化时尤为重要,此外,gag基因373—384位核苷酸的规律性缺失对病毒的体外复制能力无显著影响。 展开更多
关键词 k亚群禽白血病病毒 地方品种鸡 分子流行病学 GAG基因 感染性克隆
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