为建立一种快速、敏感检测牛环形泰勒虫的方法,本研究根据GenBank中登录的牛环形泰勒虫Tams1基因序列,设计合成1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测牛环形泰勒虫SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。研究结果显示,该方法可以特异...为建立一种快速、敏感检测牛环形泰勒虫的方法,本研究根据GenBank中登录的牛环形泰勒虫Tams1基因序列,设计合成1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测牛环形泰勒虫SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。研究结果显示,该方法可以特异地检测牛环形泰勒虫,而对牛巴贝斯虫、反刍动物艾立希体和弓形虫检测均为阴性;该方法的灵敏度可达到180拷贝/μL,比常规PCR敏感10倍;组内和组间变异系数均小于1.0%。对15份临床血液样品和20只璃眼蜱进行检测,SYBR Green I荧光定量PCR和常规PCR的阳性检出率分别为42.86%和28.57%。本研究建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法具有特异性强、敏感性高的特点,可准确、高效检测牛环形泰勒虫,为牛环形泰勒虫病防控提供技术支持。展开更多
为建立鸽I型腺病毒(PIAdV-I)的快速检测方法,本研究根据PIAdV-I Fiber 2基因的保守区域设计特异性引物,通过优化反应条件,建立了快速检测PIAdV-I的SYBR Green I荧光定量PCR(qPCR)方法。建立的SYBR Green I qPCR方法的标准曲线结果显示,...为建立鸽I型腺病毒(PIAdV-I)的快速检测方法,本研究根据PIAdV-I Fiber 2基因的保守区域设计特异性引物,通过优化反应条件,建立了快速检测PIAdV-I的SYBR Green I荧光定量PCR(qPCR)方法。建立的SYBR Green I qPCR方法的标准曲线结果显示,重组质粒标准品pMD19-Fiber在1×10^(3)拷贝/μL^(1)×10^(8)拷贝/μL时和Ct值之间的线性关系良好,相关系数R~2=0.995,扩增效率为90%。利用建立的qPCR方法对鸽II型腺病毒(PIAdV-II)Fiber 2基因保守区质粒标准品、鸽圆环病毒(PICV)、新城疫病毒(NDV)、多杀性巴氏杆菌(PM)和禽致病性大肠杆菌(APEC)的检测结果均为阴性,仅PIAdV-I检测为阳性,特异性强;该方法对浓度为1×10^(0)拷贝/μL^(1)×10^(8)拷贝/μL的重组质粒标准品进行检测,结果显示最低检测限为1×10^(2)拷贝/μL,而普通PCR最低检测限为1×10^(4)拷贝/μL,表明qPCR方法的敏感性更强;该方法批内、批间重复性试验的变异系数分别小于1%和2%,重复性好。利用建立的qPCR方法和普通PCR方法对从呼和浩特市某赛鸽公棚随机采集的30份鸽肝脏样品进行PIAdV-I检测,结果显示前者的阳性检测率为63.3%(19/30),普通PCR方法的阳性率为36.7%(11/30),两种方法的阳性符合率均为100%。本研究首次建立PIAdV-I的q PCR检测方法,为鸽PIAdV-I的感染提供了敏感、快速的检测手段。展开更多
为建立延边白鹅CD4与CD8基因在细胞免疫中的动态变化的检测方法,本研究根据CD4与CD8基因保守区分别设计两对特异性引物,在克隆目的基因的基础上,进行TA克隆和转化,构建的阳性质粒作为标准品,经反应条件优化建立了检测延边白鹅CD4与CD8...为建立延边白鹅CD4与CD8基因在细胞免疫中的动态变化的检测方法,本研究根据CD4与CD8基因保守区分别设计两对特异性引物,在克隆目的基因的基础上,进行TA克隆和转化,构建的阳性质粒作为标准品,经反应条件优化建立了检测延边白鹅CD4与CD8基因的荧光定量PCR方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法在质粒标准品稀释倍数为101~108倍(CD4:1.2×10^8拷贝/μL^1.2×10^1拷贝/μL;CD8:1.8×10^8拷贝/μL^1.8×10^1拷贝/μL)范围内具有良好的线性关系,相关系数均为0.999,与其它相关鹅细胞因子基因不发生交叉反应,敏感性均是普通PCR的100倍,组内和组间变异系数均小于2%。初步应用本研究建立的方法检测鹅脾脏淋巴细胞CD4与CD8基因的转录水平,结果显示ConA可诱导目的基因转录水平升高,且显著高于PBS对照组(p<0.05)。本研究建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法为进一步研究鹅细胞免疫水平和CD4、CD8生物学活性奠定了基础。展开更多
根据Gen Bank中猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计特异性引物,PCR扩增获得猪圆环病毒2型ORF2基因片段,并克隆到p MD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化,建立了猪圆环病毒2型的SYBR Green I荧光定量PC...根据Gen Bank中猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计特异性引物,PCR扩增获得猪圆环病毒2型ORF2基因片段,并克隆到p MD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化,建立了猪圆环病毒2型的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法。扩增产物的溶解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对PRV、PPV、E.coli、CSFV、PRRSV均无阳性信号,可重复性好,测灵敏度可达4.0×101拷贝/μL。结果表明,建立的猪圆环病毒2型SYBR Green I实时荧光定量PCR具有特异、灵敏、快速、重复性好,适合于猪圆环病毒2型临床样品的检测。展开更多
文摘为建立一种快速、敏感检测牛环形泰勒虫的方法,本研究根据GenBank中登录的牛环形泰勒虫Tams1基因序列,设计合成1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测牛环形泰勒虫SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。研究结果显示,该方法可以特异地检测牛环形泰勒虫,而对牛巴贝斯虫、反刍动物艾立希体和弓形虫检测均为阴性;该方法的灵敏度可达到180拷贝/μL,比常规PCR敏感10倍;组内和组间变异系数均小于1.0%。对15份临床血液样品和20只璃眼蜱进行检测,SYBR Green I荧光定量PCR和常规PCR的阳性检出率分别为42.86%和28.57%。本研究建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法具有特异性强、敏感性高的特点,可准确、高效检测牛环形泰勒虫,为牛环形泰勒虫病防控提供技术支持。
文摘为建立鸽I型腺病毒(PIAdV-I)的快速检测方法,本研究根据PIAdV-I Fiber 2基因的保守区域设计特异性引物,通过优化反应条件,建立了快速检测PIAdV-I的SYBR Green I荧光定量PCR(qPCR)方法。建立的SYBR Green I qPCR方法的标准曲线结果显示,重组质粒标准品pMD19-Fiber在1×10^(3)拷贝/μL^(1)×10^(8)拷贝/μL时和Ct值之间的线性关系良好,相关系数R~2=0.995,扩增效率为90%。利用建立的qPCR方法对鸽II型腺病毒(PIAdV-II)Fiber 2基因保守区质粒标准品、鸽圆环病毒(PICV)、新城疫病毒(NDV)、多杀性巴氏杆菌(PM)和禽致病性大肠杆菌(APEC)的检测结果均为阴性,仅PIAdV-I检测为阳性,特异性强;该方法对浓度为1×10^(0)拷贝/μL^(1)×10^(8)拷贝/μL的重组质粒标准品进行检测,结果显示最低检测限为1×10^(2)拷贝/μL,而普通PCR最低检测限为1×10^(4)拷贝/μL,表明qPCR方法的敏感性更强;该方法批内、批间重复性试验的变异系数分别小于1%和2%,重复性好。利用建立的qPCR方法和普通PCR方法对从呼和浩特市某赛鸽公棚随机采集的30份鸽肝脏样品进行PIAdV-I检测,结果显示前者的阳性检测率为63.3%(19/30),普通PCR方法的阳性率为36.7%(11/30),两种方法的阳性符合率均为100%。本研究首次建立PIAdV-I的q PCR检测方法,为鸽PIAdV-I的感染提供了敏感、快速的检测手段。
文摘为建立延边白鹅CD4与CD8基因在细胞免疫中的动态变化的检测方法,本研究根据CD4与CD8基因保守区分别设计两对特异性引物,在克隆目的基因的基础上,进行TA克隆和转化,构建的阳性质粒作为标准品,经反应条件优化建立了检测延边白鹅CD4与CD8基因的荧光定量PCR方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法在质粒标准品稀释倍数为101~108倍(CD4:1.2×10^8拷贝/μL^1.2×10^1拷贝/μL;CD8:1.8×10^8拷贝/μL^1.8×10^1拷贝/μL)范围内具有良好的线性关系,相关系数均为0.999,与其它相关鹅细胞因子基因不发生交叉反应,敏感性均是普通PCR的100倍,组内和组间变异系数均小于2%。初步应用本研究建立的方法检测鹅脾脏淋巴细胞CD4与CD8基因的转录水平,结果显示ConA可诱导目的基因转录水平升高,且显著高于PBS对照组(p<0.05)。本研究建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法为进一步研究鹅细胞免疫水平和CD4、CD8生物学活性奠定了基础。
文摘根据Gen Bank中猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计特异性引物,PCR扩增获得猪圆环病毒2型ORF2基因片段,并克隆到p MD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化,建立了猪圆环病毒2型的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法。扩增产物的溶解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对PRV、PPV、E.coli、CSFV、PRRSV均无阳性信号,可重复性好,测灵敏度可达4.0×101拷贝/μL。结果表明,建立的猪圆环病毒2型SYBR Green I实时荧光定量PCR具有特异、灵敏、快速、重复性好,适合于猪圆环病毒2型临床样品的检测。
