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苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶cDNA的克隆、序列分析及原核表达
被引量：
5
1
作者
周晓群
高艳玲
+1 位作者
赵奎军
樊东
《昆虫学报》
CAS
CSCD
北大核心
2014年第9期1008-1017,共10页
【目的】本研究旨在从苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca中肠克隆出丝氨酸蛋白酶（serine protease,SP）基因的cDNA序列,测定原核表达后的蛋白经纯化及复性后的活性。【方法】运用RT-PCR和cDNA末端快速扩增方法（rapid amplification of cDNA...
【目的】本研究旨在从苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca中肠克隆出丝氨酸蛋白酶（serine protease,SP）基因的cDNA序列,测定原核表达后的蛋白经纯化及复性后的活性。【方法】运用RT-PCR和cDNA末端快速扩增方法（rapid amplification of cDNA ends,RACE）克隆苜蓿夜蛾幼虫中肠丝氨酸蛋白酶cDNA全序列,用大肠杆菌Escherichia coli表达系统进行表达。重组蛋白经纯化后,利用梯度透析法进行复性,以BApNA为底物,进行活性测定。【结果】克隆获得的苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因命名为HvSP（GenBank登录号：JX866720）,该基因全长880 bp,开放阅读框长762 bp,编码254个氨基酸,推测分子量和pI值分别为26.9 kDa和9.49。由HvSP推导的氨基酸与鳞翅目昆虫SP氨基酸序列的一致性在52%~95%之间,其中与棉铃虫Helicoverpa armigera SP（GenBank登录号：CAA72962）的氨基酸序列一致性最高,达95%。成功构建重组载体pET21b-HvSP进行原核表达,Western-blot鉴定确定为目的蛋白。蛋白可溶性分析发现重组蛋白为包涵体。在Glycine-NaOH缓冲液中,当pH为10.0时,复性的重组蛋白活性达到最高,为35.74 U/mL。【结论】本研究在苜蓿夜蛾体内获得了一个新的丝氨酸蛋白酶基因,且原核表达后的重组蛋白经过变性、纯化及复性后具有活性。该结果为进一步研究丝氨酸蛋白酶在鳞翅目昆虫体内的生理功能奠定了基础。
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关键词
苜蓿夜蛾
丝氨酸蛋白酶
cdna
克隆
原核表达
重组蛋白
酶活性
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职称材料
苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的克隆与原核表达
2
作者
周夏
郭博智
+2 位作者
高艳玲
赵奎军
樊东
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2014年第10期144-150,共7页
促前胸腺激素(Prothoracicotropic hormone,PTTH)是一类重要的昆虫激素,它对昆虫生长、蜕皮、变态、滞育具有重要调控作用。以苜蓿夜蛾5龄幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的cDNA序列,该序...
促前胸腺激素(Prothoracicotropic hormone,PTTH)是一类重要的昆虫激素,它对昆虫生长、蜕皮、变态、滞育具有重要调控作用。以苜蓿夜蛾5龄幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的cDNA序列,该序列含有823个碱基,包括1个681个碱基的开放阅读框,编码1个含226个氨基酸的蛋白,分子量约为26.3 kD,等电点为8.51。序列分析表明,苜蓿夜蛾PTTH的氨基酸序列与其他昆虫,尤其是鳞翅目夜蛾科昆虫的PTTH高度同源。获得的基因已登录GenBank,登录号为JF731347。利用原核表达载体pET21b在大肠杆菌中成功表达了苜蓿夜蛾PTTH基因,并用Ni-NTA亲和层析柱将带His-tag的目的蛋白进行纯化。
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关键词
苜蓿夜蛾
促前胸腺激素
基因序列克隆
原核表达
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职称材料
题名
苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶cDNA的克隆、序列分析及原核表达
被引量：
5
1
作者
周晓群
高艳玲
赵奎军
樊东
机构
东北农业大学农学院
出处
《昆虫学报》
CAS
CSCD
北大核心
2014年第9期1008-1017,共10页
基金
黑龙江省自然科学基金(C201415)
文摘
【目的】本研究旨在从苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca中肠克隆出丝氨酸蛋白酶（serine protease,SP）基因的cDNA序列,测定原核表达后的蛋白经纯化及复性后的活性。【方法】运用RT-PCR和cDNA末端快速扩增方法（rapid amplification of cDNA ends,RACE）克隆苜蓿夜蛾幼虫中肠丝氨酸蛋白酶cDNA全序列,用大肠杆菌Escherichia coli表达系统进行表达。重组蛋白经纯化后,利用梯度透析法进行复性,以BApNA为底物,进行活性测定。【结果】克隆获得的苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因命名为HvSP（GenBank登录号：JX866720）,该基因全长880 bp,开放阅读框长762 bp,编码254个氨基酸,推测分子量和pI值分别为26.9 kDa和9.49。由HvSP推导的氨基酸与鳞翅目昆虫SP氨基酸序列的一致性在52%~95%之间,其中与棉铃虫Helicoverpa armigera SP（GenBank登录号：CAA72962）的氨基酸序列一致性最高,达95%。成功构建重组载体pET21b-HvSP进行原核表达,Western-blot鉴定确定为目的蛋白。蛋白可溶性分析发现重组蛋白为包涵体。在Glycine-NaOH缓冲液中,当pH为10.0时,复性的重组蛋白活性达到最高,为35.74 U/mL。【结论】本研究在苜蓿夜蛾体内获得了一个新的丝氨酸蛋白酶基因,且原核表达后的重组蛋白经过变性、纯化及复性后具有活性。该结果为进一步研究丝氨酸蛋白酶在鳞翅目昆虫体内的生理功能奠定了基础。
关键词
苜蓿夜蛾
丝氨酸蛋白酶
cdna
克隆
原核表达
重组蛋白
酶活性
Keywords
heliothis
viriplaca
serine protease
cdna
cloning
prokaryotic
expression
recombinant protein
enzyme activity
分类号
Q966 [生物学—昆虫学]
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职称材料
题名
苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的克隆与原核表达
2
作者
周夏
郭博智
高艳玲
赵奎军
樊东
机构
东北农业大学农学院
出处
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2014年第10期144-150,共7页
基金
国家现代农业产业技术体系建设专项基金项目(CARS-04)
文摘
促前胸腺激素(Prothoracicotropic hormone,PTTH)是一类重要的昆虫激素,它对昆虫生长、蜕皮、变态、滞育具有重要调控作用。以苜蓿夜蛾5龄幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的cDNA序列,该序列含有823个碱基,包括1个681个碱基的开放阅读框,编码1个含226个氨基酸的蛋白,分子量约为26.3 kD,等电点为8.51。序列分析表明,苜蓿夜蛾PTTH的氨基酸序列与其他昆虫,尤其是鳞翅目夜蛾科昆虫的PTTH高度同源。获得的基因已登录GenBank,登录号为JF731347。利用原核表达载体pET21b在大肠杆菌中成功表达了苜蓿夜蛾PTTH基因,并用Ni-NTA亲和层析柱将带His-tag的目的蛋白进行纯化。
关键词
苜蓿夜蛾
促前胸腺激素
基因序列克隆
原核表达
Keywords
heliothis viriplaca prothoracicotropic hormone cdna cloning prokaryotic expression
分类号
S433.4 [农业科学—农业昆虫与害虫防治]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶cDNA的克隆、序列分析及原核表达
周晓群
高艳玲
赵奎军
樊东
《昆虫学报》
CAS
CSCD
北大核心
2014
5
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的克隆与原核表达
周夏
郭博智
高艳玲
赵奎军
樊东
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2014
0
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