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不同地区4株H1N1亚型猪流感病毒分子特征和遗传进化分析
1
作者 路伟 闫喜军 +5 位作者 赵刚 杨作丰 张颖雪 张秀华 苏玮玮 陈超阳 《现代畜牧兽医》 2025年第5期27-31,共5页
研究旨在了解不同地区猪流感病毒(SIV)的遗传变异情况,从不同地区采集疑似感染SIV猪的病料后进行病毒分离,对分离获得的4株H_(1)N_(1)亚型SIV进行全基因组测序,并进行分子特征、同源性与遗传进化分析。结果显示,4株病毒的血凝素(HA)、... 研究旨在了解不同地区猪流感病毒(SIV)的遗传变异情况,从不同地区采集疑似感染SIV猪的病料后进行病毒分离,对分离获得的4株H_(1)N_(1)亚型SIV进行全基因组测序,并进行分子特征、同源性与遗传进化分析。结果显示,4株病毒的血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)基因属于欧亚类禽型H_(1)N_(1)(EA H_(1)N_(1))谱系,PB2、PB1、PA、NP、M基因属于2009年大流行H_(1)N_(1)(pdm/09 H_(1)N_(1))谱系,NS基因属于经典H_(1)N_(1)亚型(CS H_(1)N_(1))谱系。4株分离毒株的HA、NA基因同源性分别为92.8%~96.0%、93.0%~96.7%,氨基酸同源性分别为92.9%~95.9%、93.2%~96.8%。4株分离毒株HA蛋白的裂解位点均为PSIQSR↓GL,且具有结合哺乳动物α-2,6半乳糖(SAα-2,6 Gal)受体的氨基酸位点;病毒内部基因出现了与毒力相关的关键氨基酸位点变异,如PB1蛋白的V171M、R198K、N375S、L473V突变,NP蛋白的K319N突变以及NS蛋白的G149A突变,M2蛋白存在对金刚烷胺和金刚乙胺耐药性影响的S31N突变,NS蛋白存在可促进病毒复制能力的A42S突变。研究表明,4株不同地区H_(1)N_(1)亚型SIV基因的同源性差异较大,且各基因的关键氨基酸位点出现突变。 展开更多
关键词 猪流感病毒 h1n1亚型 同源性 遗传进化
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一株H1N1亚型猪流感病毒血凝素HA蛋白中和性单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定 被引量：3
2
作者 石建州 李青梅 +5 位作者 刘肖 王彦红 李鸽 郭军庆 邓瑞广 张改平 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期300-304,共5页
为制备H1N1亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(HA)蛋白中和性单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究以纯化的H1N1 SIV全病毒免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法筛选出一株稳定分泌... 为制备H1N1亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(HA)蛋白中和性单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究以纯化的H1N1 SIV全病毒免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法筛选出一株稳定分泌抗H1N1 SIV HA蛋白的MAb杂交瘤细胞株(10H8)。MAb亚类鉴定结果显示其亚类为IgG2a。MAb 10H8细胞上清和腹水的IPMA效价分别为11024和151200,腹水血凝抑制(HI)效价为13log2。Western blot试验结果显示MAb 10H8能够特异性地结合HA蛋白。病毒中和试验结果显示MAb 10H8杂交瘤细胞培养上清原液和1640稀释的腹水均能够抑制H1N1亚型SIV感染细胞,对SIV具有较强的中和活性。HA蛋白合成多肽的dot-blot鉴定结果显示,MAb 10H8识别的线性抗原表位为295KCQTPHGALKGNLPFQ310。本研究为H1N1亚型SIV诊断试剂和新型疫苗研发奠定了基础。 展开更多
关键词 h1n1亚型猪流感病毒 血凝素 单克隆抗体 中和抗原表位
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H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体IPMA检测方法的建立 被引量：4
3
作者 石建州 李青梅 +5 位作者 王彦红 刘肖 李鸽 郭军庆 邓瑞广 张改平 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第9期2691-2698,共8页
本试验旨在建立一种针对检测抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)筛选方法。通过优化MDCK细胞接毒量、细胞接毒后培养时间、封闭液的种类和工作浓度、工作时间等各个... 本试验旨在建立一种针对检测抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)筛选方法。通过优化MDCK细胞接毒量、细胞接毒后培养时间、封闭液的种类和工作浓度、工作时间等各个反应条件,并对建立的IPMA筛选方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果显示,建立的IPMA检测方法的最优反应条件为MDCK细胞接毒10 2.63 TCID 50/100μL H1N1亚型猪流感病毒,37℃培养24 h,含3‰H 2O 2的甲醇室温固定15 min,5%脱脂乳37℃封闭2 h,50μL杂交瘤细胞上清作为一抗,37℃孵育2 h,羊抗鼠HRP-IgG二抗37℃孵育1 h。所建立的IPMA方法能特异性地检测H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪瘟病毒(CSFV)阳性血清不发生交叉反应;其敏感性检测结果显示,可检测1∶3 200的HI=2-9标准H1N1猪阳性血清;批间和批内重复性试验结果较好。综上所述,本试验成功建立了抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的IPMA检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为生产鉴定H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体提供了一种简便、实用、有效的检测手段。 展开更多
关键词 h1n1亚型猪流感病毒 免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA) 单克隆抗体
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古典H1N1亚型猪流感病毒PB2 K627E突变对病毒复制能力的影响 被引量：1
4
作者 汪秀会 宫晓倩 +9 位作者 阮宝阳 刘晓敏 汪琪 张鹏 李泽君 周艳君 童武 郑浩 童光志 于海 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期543-548,共6页
旨在探索古典H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2011(H1N1)PB2K627E突变对病毒复制能力的影响。利用反向遗传操作技术和点突变技术成功获得古典H1N1亚型猪流感病毒的拯救株(627K)和突变株(627E)后,分别在MDCK细胞和小鼠体内对拯... 旨在探索古典H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2011(H1N1)PB2K627E突变对病毒复制能力的影响。利用反向遗传操作技术和点突变技术成功获得古典H1N1亚型猪流感病毒的拯救株(627K)和突变株(627E)后,分别在MDCK细胞和小鼠体内对拯救株和突变株的复制能力进行比较。体外MDCK细胞试验结果显示,突变株与拯救株相比,细胞病变(CPE)减小、空斑形态减小、生长曲线差异极其显著,表明突变株在MDCK细胞上的复制能力减弱。小鼠攻毒试验结果表明,突变株对小鼠体重变化的影响不明显,在小鼠肺中的病毒滴度明显下降,引起病理损伤较轻。体外MDCK细胞及小鼠攻毒试验结果均表明,突变株与拯救株相比复制能力降低。该结果不仅证实了猪流感病毒PB2 627位氨基酸是一种重要的毒力分子标记,同时还为进一步阐明其致病机制提供了条件。 展开更多
关键词 古典h1n1亚型猪流感病毒 PB2K627E突变 体外MDCK细胞试验 小鼠攻毒试验 复制能力
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H1N1亚型猪流感病毒HA1基因原核表达及鉴定 被引量：1
5
作者 阮宝阳 王林 +10 位作者 宫晓倩 汪秀会 刘晓敏 汪琪 单同领 李泽君 刘芹防 陈鸿军 滕巧泱 童光志 于海 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2015年第4期14-18,共5页
本研究利用RT-PCR技术扩增禽源H1N1亚型猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)的HA1基因片段,将其连接至p Cold-TF载体上,菌液鉴定为阳性的克隆经测序验证正确后,提取质粒转化至高表达的表达宿主菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导并大量表达目... 本研究利用RT-PCR技术扩增禽源H1N1亚型猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)的HA1基因片段,将其连接至p Cold-TF载体上,菌液鉴定为阳性的克隆经测序验证正确后,提取质粒转化至高表达的表达宿主菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导并大量表达目的蛋白。表达产物经过纯化及SDS-PAGE电泳分析,表明重组蛋白以可溶性形式在上清中大量表达,大小约90 k Da,且在15℃、0.8 mmol/L IPTG条件下诱导24 h表达效果最好。通过Ni柱纯化后,经Western blot分析表明重组表达的蛋白能与禽源H1N1亚型SIV阳性血清发生特异性反应,具有较好的反应原性。 展开更多
关键词 hA1基因 禽源h1n1亚型猪流感病毒 原核表达 可溶性 抗原性
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H1N1亚型猪流感病毒中国分离株血凝素基因分子演化的研究 被引量：20
6
作者 陈君彦 李海燕 +3 位作者 申之义 陈化兰 于康震 毕英佐 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期13-17,共5页
对 2 0 0 1年中国华南及东北地区的 15株H1N1亚型猪流感病毒 (SIV)分离株的血凝素 (HA)基因进行了序列测定和分析 ,并绘制了进化树。研究结果表明 ,15株H1N1SIV和HA基因核苷酸全长为 1778bp ,共编码 5 6 6个氨基酸 ;而且 ,15株H1N1亚型... 对 2 0 0 1年中国华南及东北地区的 15株H1N1亚型猪流感病毒 (SIV)分离株的血凝素 (HA)基因进行了序列测定和分析 ,并绘制了进化树。研究结果表明 ,15株H1N1SIV和HA基因核苷酸全长为 1778bp ,共编码 5 6 6个氨基酸 ;而且 ,15株H1N1亚型SIV的HAI蛋白在 10、11、2 3、87、2 87位都存在高度保守的糖基化位点 ,此外 ,在 2 76位多了一个“_NTT_”糖基化位点 ,与参考毒株SW /IW / 93/ 0 1一致 ,这可能是近期H1N1亚型SIV的一个分子特征。本研究进一步发现 ,15株H1N1亚型SIV的HA基因切割位点氨基酸组成为IPSIQSR↓G ,具有非高致病力毒株分子特征 ;而其受体结合位点在HA蛋白上第 2 2 6位是Q ,第 2 2 8位是G ,可能具有感染禽的潜力。经同源性比较 ,15株H1N1亚型SIV的HA基因与古典型H1N1猪谱系中的WIS/ 4 75 4 / 94的同源性相对最高 ,核苷酸和氨基酸序列同源性分别达到 95 7%～ 96 1%和96 5 %～ 97 2 %。由同源性比较结果和进化树分析可见 。 展开更多
关键词 h1n1亚型 猪流感病毒 中国分离株 血凝素基因 分子演化 序列分析
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实时荧光定量PCR检测H1N1亚型猪流感病毒 被引量：21
7
作者 段廷云 陈红英 +3 位作者 崔保安 魏战勇 李新生 王学斌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期752-756,共5页
根据GenBank中H1N1亚型猪流感病毒NP基因的序列(DQ889686),利用Premier express设计并合成1对引物和相应的TaqMan探针,从猪流感病毒HN407株接种的鸡胚尿囊液中提取总RNA,经RT-PCR扩增NP基因。将鉴定正确的NP基因片段克隆入pGEM-T Easy... 根据GenBank中H1N1亚型猪流感病毒NP基因的序列(DQ889686),利用Premier express设计并合成1对引物和相应的TaqMan探针,从猪流感病毒HN407株接种的鸡胚尿囊液中提取总RNA,经RT-PCR扩增NP基因。将鉴定正确的NP基因片段克隆入pGEM-T Easy载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒。以该阳性重组质粒为荧光定量PCR标准品模板建立标准曲线。对探针浓度、引物浓度、镁离子浓度和退火温度进行优化,建立了最佳的荧光定量PCR反应体系和扩增程序。经临床应用表明荧光定量PCR的建立为早期诊断猪流感病毒、定量分析猪流感病毒感染程度奠定了基础。 展开更多
关键词 猪流感病毒 h1n1亚型 荧光定量PCR
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一株人源H1N1亚型猪流感病毒的进化分析与生物学特性研究 被引量：16
8
作者 唐续 杨焕良 +8 位作者 鄢明华 李秀丽 陈艳 孟沙沙 尹航 辛晓光 步志高 乔传玲 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期270-273,336,共5页
为了解猪流感病毒(SIV)的变异情况,我们2009年11月从河北某养殖场采集呈流感症状的猪鼻拭子40份,接种10日龄SPF鸡胚,分离到一株猪流感病毒,通过RT-PCR和血凝抑制试验鉴定为H1N1亚型,命名为A/swine/Hebei/15/2009(H1N1),其全基因序列测... 为了解猪流感病毒(SIV)的变异情况,我们2009年11月从河北某养殖场采集呈流感症状的猪鼻拭子40份,接种10日龄SPF鸡胚,分离到一株猪流感病毒,通过RT-PCR和血凝抑制试验鉴定为H1N1亚型,命名为A/swine/Hebei/15/2009(H1N1),其全基因序列测定及同源性分析发现,8个基因片段均与2000年左右H1N1人流感病毒有较高的同源性。系统遗传演化显示,该病毒分离株是由2000年人源H1N1流感病毒A/Dunedin/2/2000(H1N1)进化而来。抗原性分析显示该株与甲型H1N1流感病毒和经典H1N1病毒株抗原性差异较大。对小鼠致病性试验表明该病毒株可以直接感染小鼠并导致小鼠轻微临床症状和组织病理学变化,但不致死小鼠,表现为低致病性。 展开更多
关键词 猪流感病毒 人源h1n1亚型 遗传演化分析 抗原性分析 致病性
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一株类禽型H1N1亚型猪流感病毒的反向遗传系统的建立 被引量：9
9
作者 孟沙沙 乔传玲 +5 位作者 陈艳 杨焕良 刘丽萍 尹航 辛晓光 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期91-94,共4页
为建立H1N1亚型猪流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(JS40)的反向遗传系统,本研究分别构建了JS40株8个基因节段的重组质粒,经转染293T和MDCK混合细胞,拯救出病毒R-JS40。序列测定结果表明,救获病毒与亲本病毒的核苷酸序列一致,无氨基酸变... 为建立H1N1亚型猪流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(JS40)的反向遗传系统,本研究分别构建了JS40株8个基因节段的重组质粒,经转染293T和MDCK混合细胞,拯救出病毒R-JS40。序列测定结果表明,救获病毒与亲本病毒的核苷酸序列一致,无氨基酸变异,可以稳定传代;抗原性未发生变化;对小鼠的致病性结果显示R-JS40与JS40对小鼠的组织嗜性以及在肺脏中复制的病毒滴度基本一致。以上结果表明R-JS40保持了亲本病毒JS40的生物学特性,该病毒反向遗传操作系统的建立,为进一步开展病毒的致病分子基础以及新型疫苗的研制提供有效的技术平台。 展开更多
关键词 猪流感病毒 类禽型 h1n1 反向遗传系统
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一株H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定及其遗传进化分析 被引量：3
10
作者 付新亮 方博 +8 位作者 王丽芳 何淑仪 郑运 纪方晓 曹振鹏 周沛 陈济铛 粟硕 张桂红 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期348-352,共5页
为了解广东地区猪流感的流行和变异情况,本研究于2013年11月~12月从广东省5个猪场中采集疑似流感症状的猪鼻拭子115份,接种10日龄SPF鸡胚,分离得到一株猪流感病毒（SIV）,对其进行血凝和血凝抑制试验、RT-PCR检测及全基因测序分析,结果... 为了解广东地区猪流感的流行和变异情况,本研究于2013年11月~12月从广东省5个猪场中采集疑似流感症状的猪鼻拭子115份,接种10日龄SPF鸡胚,分离得到一株猪流感病毒（SIV）,对其进行血凝和血凝抑制试验、RT-PCR检测及全基因测序分析,结果表明该分离株为H1N1亚型,将其命名为A/Swine/Guangdong/L2/2013（H1N1）。HA蛋白裂解位点序列为PSIQSR↓GL,具有典型的低致病性流感病毒特征。系统遗传进化分析显示,该病毒与A/swine/Shanghai/2/2005（H1N1）亲缘关系密切。小鼠的致病性试验表明该病毒株可以直接感染小鼠,导致小鼠轻微临床症状和肺脏组织病理学变化,但未在其他组织器官中分离到病毒,并且对小鼠无致死性,为低致病性SIV。该病毒的分离鉴定为广东地区SIV的流行特点和变异情况提供实验依据。 展开更多
关键词 猪流感病毒 h1n1亚型 遗传进化分析 致病性
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三源重组H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的建立 被引量：4
11
作者 汪琪 刘晓敏 +6 位作者 杨海明 王帅勇 单同领 童武 李国新 童光志 于海 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2017年第3期28-33,共6页
利用RT-PCR技术扩增三源重组H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Tianjin/10/2013(H1N1)的8个基因片段,分别克隆至双向转录/表达载体p BD上。将8个重组质粒纯化后共转染293T细胞,收取转染48 h后的细胞上清并接种MDCK细胞,成功拯救出有血凝活性... 利用RT-PCR技术扩增三源重组H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Tianjin/10/2013(H1N1)的8个基因片段,分别克隆至双向转录/表达载体p BD上。将8个重组质粒纯化后共转染293T细胞,收取转染48 h后的细胞上清并接种MDCK细胞,成功拯救出有血凝活性的病毒。全基因序列测定结果表明,拯救病毒与野生病毒的核苷酸序列完全一致。生长曲线的测定结果表明,不同时间点野生毒株与拯救毒株在MDCK细胞上的病毒滴度没有明显差异。三源重组H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的成功建立为进一步开展猪流感病毒的生物学特性研究奠定了基础,同时也为H1N1亚型猪流感疫苗的研制开辟了新的途径。 展开更多
关键词 猪流感病毒 h1n1 反向遗传操作技术 病毒拯救
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一株H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定及生物学特性分析 被引量：2
12
作者 白昀 冯志新 +5 位作者 甘源 刘占军 张旭 韦艳娜 马庆红 邵国青 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期521-525,共5页
为调查南京地区猪流感流行情况,本研究于2011年2月～5月期间从南京某屠宰场采集健康猪的鼻拭子和肺脏组织样品共690份,常规无菌处理后进行RT-PCR检测,将检测为阳性的样品接种9日龄～11日龄SPF鸡胚分离猪流感病毒(SIV)。对分离株进行血... 为调查南京地区猪流感流行情况,本研究于2011年2月～5月期间从南京某屠宰场采集健康猪的鼻拭子和肺脏组织样品共690份,常规无菌处理后进行RT-PCR检测,将检测为阳性的样品接种9日龄～11日龄SPF鸡胚分离猪流感病毒(SIV)。对分离株进行血凝试验、EID50测定、HA及NA基因测序分析和感染小鼠及猪体试验。结果有18份样品RT-PCR显示为SIV阳性,但只有一株可在SPF鸡胚中稳定增殖。该病毒分离株具有凝集0.5%鸡红细胞的活性,EID50为10-6.32/0.1 mL,基因测序显示其HA、NA基因片段均与09年H1N1型流感流行株A/California/04/2009(H1N1)高度同源,将其命名为A/Swine/Nanjing/50/2011(H1N1)。小鼠人工感染试验表明该分离株可引起小鼠死亡(3/10),猪体人工感染实验显示该分离株还能够引发猪体明显的流感症状及肺部病变。该病毒的分离鉴定及HA、NA基因序列分析为进一步调查SIV的流行规律提供了基础数据。 展开更多
关键词 猪流感病毒 h1n1亚型 分离鉴定 hA基因 nA基因
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表达H1N1亚型猪流感病毒三聚体HA重组慢病毒的免疫原性研究 被引量：2
13
作者 邓颖琦 李俊峰 +6 位作者 曲辉 唐雨博 孙艺学 李鑫 王伟利 丁壮 丛彦龙 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期983-987,共5页
目的:探讨表达猪H1N1亚型流感病毒三聚体HA的重组慢病毒(r LV-HA-GCN4)对BALB/c小鼠的免疫保护效果。方法:将雌性BALB/c小鼠随机分为重组慢病毒r LV-HA-GCN4组、重组慢病毒r LV-HA组、慢病毒LV空载体对照组及PBS对照组,先后进行质粒和... 目的:探讨表达猪H1N1亚型流感病毒三聚体HA的重组慢病毒(r LV-HA-GCN4)对BALB/c小鼠的免疫保护效果。方法:将雌性BALB/c小鼠随机分为重组慢病毒r LV-HA-GCN4组、重组慢病毒r LV-HA组、慢病毒LV空载体对照组及PBS对照组,先后进行质粒和慢病毒2次免疫,间隔为2周,注射部位均为小鼠大腿内侧肌肉;于初次免疫后的第28天,各组小鼠鼻腔滴注50μl 100TCID50的H1N1病毒,采用淋巴细胞转化实验、流式细胞术、间接ELISA和脾肺指数检测各免疫指标。结果:加强免疫后第14天,r LV-HA-GCN4组脾淋巴细胞转化率为0.3±0.11,与PBS组相比,差异有统计学意义(P<0.01),产生以Th1型CD4+T细胞为主的细胞免疫反应;r LV-HA-GCN4组小鼠Ig G抗体效价可达1∶8 000,攻毒后第14天约为1∶7 000;攻毒后,r LV-HA-GCN4组脾肺指数小于PBS组,小鼠体重在前3 d略有下降,随后逐渐上升,两个指标与PBS组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:r LV-HA-GCN4能够诱导小鼠良好的细胞与体液免疫应答,从而有效地保护小鼠抵御猪H1N1流感病毒的感染。 展开更多
关键词 猪流感 h1n1亚型 三聚体hA 慢病毒载体 免疫原性
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欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的建立 被引量：2
14
作者 汪琪 杨海明 +13 位作者 汪秀会 刘晓敏 王帅勇 姚云 朱世强 单同领 童武 周艳君 李国新 郑浩 高飞 姜一峰 童光志 于海 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2018年第3期23-27,共5页
为了构建猪流感病毒A/swine/Tian Jin/6/2013(H1N1)的反向遗传操作技术平台,通过RT-PCR技术分别扩增了欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的8个基因片段,并分别连接至双向转录表达载体p BD上。纯化8个重组质粒,共转染到293T细胞。54 h后收集上... 为了构建猪流感病毒A/swine/Tian Jin/6/2013(H1N1)的反向遗传操作技术平台,通过RT-PCR技术分别扩增了欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的8个基因片段,并分别连接至双向转录表达载体p BD上。纯化8个重组质粒,共转染到293T细胞。54 h后收集上清,并接种到MDCK细胞。待细胞病变明显时,进行血凝试验检测收集到的上清,测得血凝效价为1∶32。测定拯救病毒的全基因组序列,结果显示,在核苷酸序列上,拯救病毒与野生病毒完全一致。细胞病变情况显示,拯救毒株与野生毒株无明显差别。本研究成功拯救了欧洲类禽H1 N1亚型猪流感病毒,为猪流感病毒的致病机理、基因功能研究以及H1N1亚型猪流感病毒新型疫苗的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 猪流感病毒 病毒拯救 生长曲线 h1n1亚型
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H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因双重RT-PCR定型检测方法的建立与应用 被引量：1
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作者 温肖会 蔡春梅 +6 位作者 魏文康 翟少伦 吕殿红 贾春玲 袁洁 黄忠 周秀蓉 《中国动物传染病学报》 CAS 2014年第4期29-34,共6页
为了建立适用于临床诊断的H1N1亚型猪流感病毒快速检测方法,本研究根据GenBank已登录的H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因序列设计RT-PCR扩增引物,以H1N1亚型猪流感病毒、H3N2亚型猪流感病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒为试验对照,... 为了建立适用于临床诊断的H1N1亚型猪流感病毒快速检测方法,本研究根据GenBank已登录的H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因序列设计RT-PCR扩增引物,以H1N1亚型猪流感病毒、H3N2亚型猪流感病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒为试验对照,通过优化RT-PCR反应条件和反应体系,建立了H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因双重RT-PCR定型检测方法。同时,运用H1N1亚型猪流感病毒血凝和血凝抑制试验方法和本研究建立的方法对165份猪病料样品进行了对比验证。结果表明,本研究建立的H1N1亚型猪流感病毒双重RT-PCR具有良好的特异性、敏感性、重复性,所扩增的目的基因片段大小分别为428 bp和678 bp左右,可检出最小基因组RNA浓度为2.9×10-5μg/μL。本研究建立的方法和H1N1亚型猪流感病毒血凝和血凝抑制试验方法均从同一份猪肺脏样品中检测出H1N1亚型猪流感病毒,其余样品中均未检出H1N1亚型猪流感病毒,两种方法符合率为100%。本研究建立的方法适用于H1N1亚型猪流感病毒双基因定型检测,可在H1N1亚型猪流感病毒流行病学调查和临床诊断中应用。 展开更多
关键词 h1n1亚型猪流感 双重RT-PCR方法 hA基因 nA基因
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辽宁省H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析 被引量：2
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作者 兰德松 赵凤菊 +4 位作者 魏澍 闫明媚 谷志大 顾贵波 胡钧 《现代畜牧兽医》 2013年第12期24-28,共5页
本研究2012年底从辽宁省某屠宰场猪鼻咽拭子样品中分离到1株流感病毒,经HA-HI试验和RT-PCR鉴定为H1N1亚型猪流感病毒株,命名为A/swine/Liaoning/01/2012(H1N1),通过对病毒的8个基因片段克隆并测序,并利用分子生物学软件进行遗传演化分... 本研究2012年底从辽宁省某屠宰场猪鼻咽拭子样品中分离到1株流感病毒,经HA-HI试验和RT-PCR鉴定为H1N1亚型猪流感病毒株,命名为A/swine/Liaoning/01/2012(H1N1),通过对病毒的8个基因片段克隆并测序,并利用分子生物学软件进行遗传演化分析。结果表明,分离株HA基因裂解位点附近的氨基酸序列为IPSIOSR↓G,符合低致病力流感病毒的分子特征。全基因组进化树结果表明,分离株的8个基因片段与A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)株核苷酸同源性最高,分离株处在类禽型H1N1亚型遗传进化分支上;由于类禽型H1N1猪流感病毒具有潜在感染人的潜力,在国外和国内均有感染人的报道,因此,辽宁省首次分离到该型猪流感病毒对全省养猪业和公共卫生安全具有重要意义,值得深入研究。 展开更多
关键词 猪流感病毒 h1n1亚型 分离鉴定 遗传演化分析
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3株H1N1亚型猪流感病毒的HA基因遗传信息及抗原特异性分析
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作者 秦锋 蔡孟楷 +9 位作者 张伟东 张京 方博 黄俊明 卜德新 罗勇峰 马骏 付新亮 曹振鹏 张桂红 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期13-18,共6页
【目的】分析3株属于欧亚类禽(SWSS1)、经典(SWL6)与Pdm09H1N1(Pdm091057)分支的猪流感病毒的HA基因遗传信息及抗原的特异性,为HA基因抗原表位的功能研究及流感防控奠定基础。【方法】以SWSS1株、SWL6株和Pdm091057株流感病毒为材料,比... 【目的】分析3株属于欧亚类禽(SWSS1)、经典(SWL6)与Pdm09H1N1(Pdm091057)分支的猪流感病毒的HA基因遗传信息及抗原的特异性,为HA基因抗原表位的功能研究及流感防控奠定基础。【方法】以SWSS1株、SWL6株和Pdm091057株流感病毒为材料,比较分析3株H1N1亚型HA基因片段的遗传信息,制备全病毒灭活疫苗,各免疫3只雌性新西兰大白兔,采用血凝抑制(Hemagglutination inhibition,HI)反应试验检测抗体滴度。【结果】3株病毒的HA基因片段的氨基酸序列相似性为69.4%~89.1%,各分支的HA基因的抗原表位存在差异;3株病毒经过2次免疫后平均HI抗体滴度均能达1 280以上,且SWSS1的平均HI抗体滴度高达2 560。同时SWSS1与SWL6、Pdm091057这2株病毒均无血清学交叉反应,而SWL6与Pdm091057有较低的血清学交叉反应。【结论】3株猪流感病毒的HA基因片段抗原表位存在着差异,可能是3毒株之间血清学交叉反应较低的原因。3株病毒免疫原性均较好,可作为候选疫苗株。 展开更多
关键词 猪流感病毒 h1n1 遗传信息 抗原表位 血凝抑制 抗体滴度 hA基因
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microRNA-124-3p调控H1N1亚型猪流感病毒致小鼠肺损伤的研究
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作者 黄良宗 张海龙 +4 位作者 颜广智 谢博 陈盛楠 邓汝森 顾万军 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第10期3049-3057,共9页
为研究microRNA-124-3p(miR-124-3p)对H1N1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)感染小鼠所致肺损伤的调控作用,本试验构建miR-124-3p腺病毒表达载体,通过小鼠尾部静脉注射法构建miR-124-3p差异表达小鼠模型,试验分3组:过表达组... 为研究microRNA-124-3p(miR-124-3p)对H1N1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)感染小鼠所致肺损伤的调控作用,本试验构建miR-124-3p腺病毒表达载体,通过小鼠尾部静脉注射法构建miR-124-3p差异表达小鼠模型,试验分3组:过表达组、抑制组和对照组。48 h后,各组小鼠鼻腔接种H1N1亚型SIV,每只105 EID50(50μL)。连续观察14 d,计算小鼠平均体重变化率、观察病理切片并测定相关炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA相对表达量。结果显示,已成功将pre-miR序列及其sponge序列插入腺病毒的穿梭质粒,并将其共转染293A细胞。实时荧光定量PCR检测证实,与对照组相比,过表达组和抑制组小鼠黑色素瘤细胞miR-124-3p表达水平分别极显著升高(P<0.01)和显著降低(P<0.05),表明成功构建腺病毒表达载体。过表达组、抑制组和对照组小鼠体重变化率分别为-5.5%、-12.4%和-8.6%。抑制组和对照组均可见肺泡壁增厚,其间有多量淋巴细胞浸润,部分肺泡内出现纤维蛋白渗出,且抑制组病理变化更为严重,肺泡中还有大量的红细胞浸润;而过表达组仅有少量的淋巴细胞浸润,肺脏组织较正常。与对照组相比,过表达组检测的炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA表达水平均显著降低(P<0.05);抑制组炎症相关炎症因子mRNA表达水平均显著升高(P<0.05)。本试验结果表明,miR-124-3p对H1N1亚型SIV感染小鼠所致的肺脏炎症因子的表达具有抑制作用,同时能减轻肺脏病理损伤。 展开更多
关键词 microRnA-124-3p h1n1亚型猪流感病毒 肺损伤 差异表达
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一株H1N1亚型猪流感病毒全基因组序列分析以及生物学特性研究 被引量：5
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作者 孟飞 杨焕良 +2 位作者 王增 马树杰 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期467-470,共4页
本实验室于2016年在江西分离到一株猪流感病毒(SIV),命名为A/swine/Jiangxi/261/2016(H1N1),为进一步弄清该株流感病毒的遗传进化背景和生物学特点,本研究对其进行了全基因组测序,遗传进化分析,BALB/c小鼠致病性试验,抗原性差异试验,受... 本实验室于2016年在江西分离到一株猪流感病毒(SIV),命名为A/swine/Jiangxi/261/2016(H1N1),为进一步弄清该株流感病毒的遗传进化背景和生物学特点,本研究对其进行了全基因组测序,遗传进化分析,BALB/c小鼠致病性试验,抗原性差异试验,受体结合特性试验。测序结果显示该病毒HA碱性裂解位点仅具有一个碱性氨基酸,符合低致病性流感病毒特点。外部基因来自欧亚类禽,内部基因来自2009/H1N1(PB2、PB1、PA、NP),欧亚类禽(M)和Triplereassortant H1N2(NS)。10~6 EID_(50)/50μL剂量可感染小鼠并致死,HA抗原性差异试验结果显示其与欧亚类禽Group1代表株差异较小,受体结合试验结果显示该病毒株主要结合α-2,6唾液酸受体。其传播性和致病性增强机理还有待进一步研究,本实验结果为SIV的检测和防控提供借鉴意义。 展开更多
关键词 猪流感病毒 h1n1 遗传进化 致病性 抗原性
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两株EA H1N1亚型猪流感病毒在豚鼠体内的复制和传播能力评估 被引量：2
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作者 陶世宇 王增 +4 位作者 陈艳 杨焕良 孔晖晖 陈化兰 胡永浩 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期190-193,共4页
为评价欧亚类禽H1N1(EA H1N1)亚型猪流感病毒(SIV)在哺乳动物间呼吸道飞沫的传播能力,本研究选取A/swine/Henan/11/2005(H1N1)(He N11)和A/swine/Hunan/26/2010(H1N1)(HuN26)为代表病毒株,以106EID50/300μL的剂量,经鼻腔分别感染3只豚... 为评价欧亚类禽H1N1(EA H1N1)亚型猪流感病毒(SIV)在哺乳动物间呼吸道飞沫的传播能力,本研究选取A/swine/Henan/11/2005(H1N1)(He N11)和A/swine/Hunan/26/2010(H1N1)(HuN26)为代表病毒株,以106EID50/300μL的剂量,经鼻腔分别感染3只豚鼠,24 h后在相邻笼内分别放入3只豚鼠作为传播组,通过检测鼻洗液内的病毒滴度评价2株病毒在豚鼠间呼吸道飞沫的传播能力;并以相同剂量分别感染2只豚鼠,感染72 h后通过检测脏器内病毒滴度评价2株病毒在豚鼠体内的复制能力。传播试验结果表明,HeN11株在豚鼠间的传播能力为3传1,HuN26株为3传3。脏器中病毒滴定结果表明,HeN11株在下呼吸道具有良好的复制能力,而HuN26株主要在上呼吸道复制。进一步的氨基酸差异分析表明,2株病毒株共有62个氨基酸差异。以上结果表明,2株病毒株均能够在豚鼠呼吸道内进行不同程度的复制,而呼吸道飞沫传播能力显著不同。本实验为进一步研究EA H1N1 SIV在哺乳动物间呼吸道飞沫传播的分子机制奠定基础,也为猪流感的防控提供了实验依据。 展开更多
关键词 EA h1n1 猪流感病毒 豚鼠 复制 传播
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