H3N2亚型猪流感病毒HA1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

1

作者 司维 谭茜宇 +3 位作者 徐玲芸 罗廷荣 李晓宁 顾金燕 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第4期1739-1749,共11页

【目的】获得免疫原性良好的H3N2亚型猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)血凝素(haemagglutinin, HA)头部结构域HA1蛋白,并制备特异性多克隆抗体,用于HA1蛋白的鉴定及功能研究。【方法】本研究通过扩增A型SIV(A/swine/Guangdong/04... 【目的】获得免疫原性良好的H3N2亚型猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)血凝素(haemagglutinin, HA)头部结构域HA1蛋白,并制备特异性多克隆抗体,用于HA1蛋白的鉴定及功能研究。【方法】本研究通过扩增A型SIV(A/swine/Guangdong/04/2005(H3N2))毒株的HA1片段,采用同源重组方法构建原核表达载体pET-28a(+)-H3N2-HA1,经PCR和测序鉴定正确后将重组阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。对HA1蛋白表达条件(诱导温度、诱导时间、IPTG浓度)进行优化,通过镍柱亲和层析法纯化蛋白。将获得的重组蛋白与QuickAntibody-Mouse3W佐剂混合后以肌内注射方式免疫BALB/c小鼠,制备H3N2亚型SIV HA1蛋白多克隆抗体,并通过ELISA、Western blotting和免疫荧光试验(IFA)对多克隆抗体的效价、反应性及特异性进行鉴定。【结果】本研究成功构建原核表达载体pET-28a(+)-H3N2-HA1;H3N2亚型SIV HA1重组蛋白在1 mmol/L IPTG 26℃诱导10 h时表达量最高,且主要以包涵体形式表达,蛋白分子质量大小约为39.5 ku。成功制备5株H3N2亚型SIV HA1蛋白多克隆抗体,效价均为1∶1 638 400。Western blotting和IFA鉴定结果显示,制备的多克隆抗体可特异性识别真核表达的H3N2亚型SIV HA1蛋白,与H1N1亚型SIV、H7N9亚型禽流感病毒(AIV)等其他亚型流感病毒的HA1蛋白均不发生反应,具有良好的反应性及特异性。【结论】本研究成功表达并纯化了免疫原性良好的H3N2亚型SIV HA1蛋白,制备了反应性及特异性良好的鼠源多克隆抗体,为深入研究H3N2亚型SIV HA1蛋白的生物学功能提供了重要工具。 展开更多

关键词 猪流感病毒(siv) h3N2亚型 hA1蛋白 原核表达 多克隆抗体

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广东省H1和H3亚型猪流感病毒抗体血清学调查 被引量：14

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作者 徐敏 贾春玲 +7 位作者 杨德胜 魏文康 朱燕秋 黄元 陈晶 张健騑 宣华 向华 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第10期116-120,共5页

为了解广东省规模化猪场H1和H3亚型猪流感病毒的流行情况,采用ELISA检测方法对采集于广东省14个市的28个规模化猪场的1 015份猪血清进行H1亚型和H3亚型猪流感病毒的抗体检测。结果表明,H1亚型抗体总阳性率为40.9%,猪场阳性率高达92.9%(2... 为了解广东省规模化猪场H1和H3亚型猪流感病毒的流行情况,采用ELISA检测方法对采集于广东省14个市的28个规模化猪场的1 015份猪血清进行H1亚型和H3亚型猪流感病毒的抗体检测。结果表明,H1亚型抗体总阳性率为40.9%,猪场阳性率高达92.9%(26/28);H3亚型抗体总阳性率为16.8%,猪场阳性率为78.6%(22/28)。其中粤西和珠三角地区H1亚型抗体阳性率分别为49.6%和45.4%,H3亚型抗体阳性率分别为14%和20.8%;而粤东和粤北地区H1亚型抗体阳性率分别为2.7%和12%,H3亚型抗体阳性率分别为6.3%和0。说明在广东省被调查的猪场中,H1和H3猪流感病毒的感染较为普遍,其中H1型感染率高于H3型。广东省SIV流行情况存在明显的地域性差异。 展开更多

关键词 猪流感 血清学调查 h1亚型 h3亚型

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H1、H3亚型猪流感病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：4

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作者 王博 王慧煜 +4 位作者 赵宝华 罗静 王承民 何宏轩 韩雪清 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第10期3035-3041,共7页

为建立一种快速、准确地检测H1和H3亚型猪流感病毒(swine influence virus,SIV)的方法,根据H1和H3亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计2对特异性引物和2条Taq Man探针,建立双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该... 为建立一种快速、准确地检测H1和H3亚型猪流感病毒(swine influence virus,SIV)的方法,根据H1和H3亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计2对特异性引物和2条Taq Man探针,建立双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法敏感性高,可检测到最低拷贝数为102拷贝/μL;重复性良好,重复孔Ct值的变异系数均在5%以下;特异性好,除H1和H3亚型SIV外,H4、H5、H7、H9亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒检测均为阴性;在田间样品中成功检出1株H1和1株H3亚型SIV,检出率为1.16%。该方法准确、快速、灵敏、特异,可为H1、H3亚型SIV的快速鉴别检测及流行病学调查提供有效的技术手段。 展开更多

关键词 h1和h3亚型猪流感病毒(siv) 双重实时荧光定量RT-PCR TAQMAN探针

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猪流感病毒H1、H3、N1、N2亚型分型RT-PCR方法的建立 被引量：7

4

作者 齐海涛 孔维立 张桂红 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第3期187-191,共5页

根据GenBank中H1N1和H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(neuraminidase,NA)和M基因保守序列,分别设计合成了5对特异性引物,利用RT-PCR技术对SIV的型和亚型进行鉴定。结果表明,该方法的型RT-PCR可以检测出104... 根据GenBank中H1N1和H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(neuraminidase,NA)和M基因保守序列,分别设计合成了5对特异性引物,利用RT-PCR技术对SIV的型和亚型进行鉴定。结果表明,该方法的型RT-PCR可以检测出104 EID50病毒量所提取的RNA;H1、H3、N1和N2的亚型RT-PCR均可以检测出104 EID50病毒量所提取的RNA。除每对特异性引物所对应的亚型外,对其他亚型及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CS-FV)的检测均为阴性,应用该方法对临床样品进行检测,其结果与病毒分离结果符合率为100%。结果表明,该方法特异性好、敏感性高,有望成为SIV的一种特异、敏感、快速的分型检测方法,为猪流感分子流行病学的调查奠定了良好的基础。 展开更多

关键词 猪流感病毒 h1亚型 h3亚型 N1亚型 N2亚型 RT-PCR方法

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H1和H3亚型猪流感病毒二重TaqMan-MGB探针荧光RT-PCR检测方法的建立

5

作者 王建华 陈小金 +8 位作者 张俊哲 王玉玲 肖妍 赵丹 谭旭菲 王乃福 陈本龙 董志珍 赵祥平 《中国动物检疫》 CAS 2016年第10期90-94,共5页

根据H1和H3亚型猪流感病毒（SIV）血凝素（HA）编码基因的保守序列,分别设计合成特异性引物和Taq Man-MGB探针,建立了一种检测H1和H3亚型SIV的二重荧光RT-PCR方法。结果显示,该方法仅对H1和H3亚型SIV呈特异性扩增,对H9亚型SIV、猪繁殖... 根据H1和H3亚型猪流感病毒（SIV）血凝素（HA）编码基因的保守序列,分别设计合成特异性引物和Taq Man-MGB探针,建立了一种检测H1和H3亚型SIV的二重荧光RT-PCR方法。结果显示,该方法仅对H1和H3亚型SIV呈特异性扩增,对H9亚型SIV、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（SFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）无交叉扩增反应;用该方法检测H1和H3亚型SIV的HA基因的RNA标准对照（SIV-H1-RNA,SIV-H3-RNA）,最适线性检测范围分别为3.7×10~1~3.7×10~8拷贝数/反应和3.4×10~0~3.4×10~8拷贝数/反应,最低检出限分别为38和34个拷贝数;该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于2.0%,显示其具有良好的可重复性。用该方法对520份进口猪的鼻拭子样本和78份国内猪鼻拭子样本进行SIV检测发现,进口猪鼻拭子样本的SIV检测结果均为阴性,12份国内猪鼻拭子样本的H1亚型SIV检测结果为阳性,5份国内猪鼻拭子样本的H3亚型SIV检测结果为阳性。本方法的建立为H1和H3亚型SIV检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。 展开更多

关键词 猪流感病毒 h1亚型 h3亚型 TaqMan探针 荧光RT-PCR

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H3N2亚型猪流感病毒HA1、HA2基因的原核表达及抗原性分析 被引量：3

6

作者 宋玉慧 王翔宇 +4 位作者 王洁琼 潘梦梦 张剑 刘琳 李新生 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第10期2762-2767,共6页

血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白是猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的一个重要蛋白,在疾病预防和治疗中具有重要作用。本试验旨在克隆和表达H3N2亚型猪流感病毒A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的HA1和HA2基因。用含有H3N2亚型SIV的鸡... 血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白是猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的一个重要蛋白,在疾病预防和治疗中具有重要作用。本试验旨在克隆和表达H3N2亚型猪流感病毒A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的HA1和HA2基因。用含有H3N2亚型SIV的鸡胚尿囊液提取RNA,RT-PCR扩增后将目的基因定向克隆到pET-28a(+)原核表达载体上,并将其转入宿主菌BL21(DE3)pLyS进行表达,IPTG诱导后经SDS-PAGE检测并用该病毒重组HA蛋白制备的特异性单克隆抗体1C10作为一抗对两种蛋白进行Western blotting分析。SDS-PAGE结果显示,得到HA1和HA2大小分别为34.8、23.2ku的重组蛋白,Western blotting结果表明,HA1蛋白与1C10单克隆抗体具有良好的反应原性,且1C10单克隆抗体表位在HA1蛋白上。本试验结果为进一步研究血凝素蛋白的结构和功能,以及建立快速诊断方法和基因工程疫苗提供材料。 展开更多

关键词 h3N2亚型猪流感病毒 hA1基因 hA2基因 原核表达

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H3N2亚型猪流感病毒HA和HA1蛋白的原核表达 被引量：1

7

作者 纪方晓 陈济铛 +2 位作者 石庆伟 王衡 张桂红 《动物医学进展》 北大核心 2016年第6期22-25,共4页

为原核表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的HA和HA1蛋白,通过RT-PCR方法获得SIV的HA和HA1基因,克隆至原核表达载体pMAL-c5X,并转化至原核表达菌Rosetta(DE3)中,表达菌经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示,成功表达了H... 为原核表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的HA和HA1蛋白,通过RT-PCR方法获得SIV的HA和HA1基因,克隆至原核表达载体pMAL-c5X,并转化至原核表达菌Rosetta(DE3)中,表达菌经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示,成功表达了H3亚型SIV的HA和HA1蛋白,目的蛋白均以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,并与H3N2亚型SIV的HA单克隆抗体反应,说明HA和HA1蛋白具有良好的反应原性。 展开更多

关键词 h3N2亚型猪流感病毒 hA蛋白 hA1蛋白 原核表达

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H3N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆与序列分析 被引量：2

8

作者 高敏 薛慧文 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 2006年第3期1-4,共4页

从鸡胚尿囊液中提取H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的RNA,根据已发表的A型流感病毒的核苷酸序列,设计了一对特异性引物,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)成功地扩增了SIV的NS1基因．将NS1基因的cDNA克隆后进行了序列测定,测序结果表明,所扩增... 从鸡胚尿囊液中提取H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的RNA,根据已发表的A型流感病毒的核苷酸序列,设计了一对特异性引物,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)成功地扩增了SIV的NS1基因．将NS1基因的cDNA克隆后进行了序列测定,测序结果表明,所扩增的778 nt片段包含了完整的NS1基因的开放阅读框．核苷酸序列比较分析结果表明,该毒株与A／Swine／Texas／4199-2／98(H3N2)、A／Swine／Iowa／533／99(H3N2)、A／Swine／HongKong／126／ 82(H3N2)、A／Swine／Pingtung／7-12／99(HIN2)核苷酸序列的同源性为92．7％～98．6％,推导的氨基酸序列同源性为92．6％～96．3％． 展开更多

关键词 h3N2亚型猪流感病毒NSI基因 克隆 序列分析

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实时荧光定量PCR检测H1N1亚型猪流感病毒 被引量：21

9

作者 段廷云 陈红英 +3 位作者 崔保安 魏战勇 李新生 王学斌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期752-756,共5页

根据GenBank中H1N1亚型猪流感病毒NP基因的序列(DQ889686),利用Premier express设计并合成1对引物和相应的TaqMan探针,从猪流感病毒HN407株接种的鸡胚尿囊液中提取总RNA,经RT-PCR扩增NP基因。将鉴定正确的NP基因片段克隆入pGEM-T Easy... 根据GenBank中H1N1亚型猪流感病毒NP基因的序列(DQ889686),利用Premier express设计并合成1对引物和相应的TaqMan探针,从猪流感病毒HN407株接种的鸡胚尿囊液中提取总RNA,经RT-PCR扩增NP基因。将鉴定正确的NP基因片段克隆入pGEM-T Easy载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒。以该阳性重组质粒为荧光定量PCR标准品模板建立标准曲线。对探针浓度、引物浓度、镁离子浓度和退火温度进行优化,建立了最佳的荧光定量PCR反应体系和扩增程序。经临床应用表明荧光定量PCR的建立为早期诊断猪流感病毒、定量分析猪流感病毒感染程度奠定了基础。 展开更多

关键词 猪流感病毒 h1N1亚型 荧光定量PCR

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表达H5N1亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的构建及其免疫原性 被引量：5

10

作者 吴运谱 乔传玲 +4 位作者 杨焕良 陈艳 展小过 辛晓光 陈化兰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期1363-1369,共7页

RT-PCR扩增猪流感病毒A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)株的HA基因,构建重组腺病毒穿梭质粒pDC315-H5 HA-EGFP。采用Ad-Max同源重组系统和共转染技术,构建了表达H5N1亚型猪流感病毒HA基因的复制缺陷型重组腺病毒(rAd-H5 HA-EGFP)。经目的基... RT-PCR扩增猪流感病毒A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)株的HA基因,构建重组腺病毒穿梭质粒pDC315-H5 HA-EGFP。采用Ad-Max同源重组系统和共转染技术,构建了表达H5N1亚型猪流感病毒HA基因的复制缺陷型重组腺病毒(rAd-H5 HA-EGFP)。经目的基因PCR检测及序列测定,结果表明:HA基因已经正确地插入到腺病毒的基因组中;通过RT-PCR检测与Western blot分析,结果表明:HA基因能够进行正确转录,并且所表达的蛋白具有相应的生物学活性。子代重组腺病毒rAd-H5 HA-EGFP经增殖、纯化后感染性滴度可达2.26×1010TCID50mL-1。rAd-H5 HA-EGFP免疫BALB/c小鼠能够诱导特异性的HI抗体产生,有效阻止病毒在体内的复制。 展开更多

关键词 猪流感病毒 h5N1亚型 hA基因 重组腺病毒

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繁殖障碍型H3亚型猪流感病毒的分离与鉴定 被引量：5

11

作者 黄淑坚 龚中贵 +2 位作者 吴志新 梁小英 冼琼珍 《广东农业科学》 CAS CSCD 2007年第7期78-80,共3页

于广东惠州市某猪场采集流产死胎的肺组织、胎衣及鼻棉拭子,病料处理后经SPF鸡胚绒毛尿囊腔接种获得1株有血凝(HA)活性的病毒,通过AGP试验初步确定为猪流感流感病毒;但此病毒的血凝现象不能被抗H1亚型猪流感单因子血清、抗H5亚型猪流感... 于广东惠州市某猪场采集流产死胎的肺组织、胎衣及鼻棉拭子,病料处理后经SPF鸡胚绒毛尿囊腔接种获得1株有血凝(HA)活性的病毒,通过AGP试验初步确定为猪流感流感病毒;但此病毒的血凝现象不能被抗H1亚型猪流感单因子血清、抗H5亚型猪流感单因子血清、抗H7亚型猪流感单因子血清、抗H9亚型猪流感单因子血清抑制,而能被抗H3亚型猪流感单因子血清抑制;通过H3亚型猪流感病毒RT-PCR分子生物学诊断,最终确定该病毒为H3亚型猪流感病毒。动物回归试验结果显示,攻毒小鼠出现精神萎靡、厌食、嗜睡、被毛松乱、呼吸较急促,攻毒后7 d采集小鼠血清进行检测,HI效价为3log2～4log2;剖检发现病毒性肺炎,且能从病料中再次分离到H3亚型猪流感病毒。 展开更多

关键词 繁殖障碍型 h3亚型 猪流感病毒 分离 鉴定

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H1亚型猪流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：7

12

作者 刘好朋 胡京京 +5 位作者 唐续 裴仉福 李冰 李琳 陈瑞爱 贺东生 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第11期63-68,共6页

为建立一种快速、简便、准确的方法以诊断和检测H1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV),试验根据H1亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,建立检测H1亚型SIV的一步法实... 为建立一种快速、简便、准确的方法以诊断和检测H1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV),试验根据H1亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,建立检测H1亚型SIV的一步法实时荧光定量RT-PCR技术。结果显示,该方法的敏感性可达102拷贝/μL,除H1亚型SIV外,对H3N2亚型SIV、H9N1亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒的检测均为阴性,且应用该方法对疑似猪流感样品进行检测,其结果与SPF鸡胚分离病毒方法结果的符合率为94%。本试验结果表明该方法特异性强、重复性好,有望成为一种特异、敏感、快速、定量检测H1亚型SIV的方法。 展开更多

关键词 猪流感病毒 h1亚型 TAQMAN MGB探针 一步法实时荧光定量RT-PCR

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逆转录环介导等温扩增技术检测H3亚型猪流感病毒 被引量：8

13

作者 刘中勇 朱道中 +4 位作者 李少璃 冀君 毕英佐 谢青梅 曹永长 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第7期1-5,共5页

基于环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立了一种用于快速检测H3亚型猪流感病毒的方法。根据GenBank中收录的H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因保守区的序列,设计一组对应HA序列6个区域的4条特异性引物,建立RT-LAMP反应体系;经优化,确定了最佳... 基于环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立了一种用于快速检测H3亚型猪流感病毒的方法。根据GenBank中收录的H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因保守区的序列,设计一组对应HA序列6个区域的4条特异性引物,建立RT-LAMP反应体系;经优化,确定了最佳的LAMP反应条件。扩增后产物形成的焦磷酸离子和溶液中的镁离子结合而形成焦磷酸镁沉淀,结果可视。同时用特异性内切酶HhaⅠ对所获得的产物进行酶切鉴定,所得的酶切产物大小与理论值完全符合。用已建立的RT-LAMP技术检测临床样品,检测结果与RT-PCR方法符合率均达到100%。结果表明,本研究建立的RT-LAMP检测猪流感病毒方法,操作简单,灵敏度高,特异性强,是一种适用于现场诊断的检测技术。 展开更多

关键词 h3亚型猪流感病毒 血凝素 逆转录环介导等温扩增

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H3亚型猪流感病毒荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：6

14

作者 王云龙 陈小科 +4 位作者 韩洁 李玉林 李恒思 王真 邓黎黎 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第6期30-35,共6页

通过RT-PCR方法克隆了H3亚型猪流感病毒HA基因一段靶序列，构建重组质粒作为标准阳性模板。根据GenBank中的H3亚型猪流感病毒HA基因保守序列设计了用于FQ-PCR的1对引物和1条TaqMan探针。通过条件优化，以10倍系列稀释的质粒为标准品进... 通过RT-PCR方法克隆了H3亚型猪流感病毒HA基因一段靶序列，构建重组质粒作为标准阳性模板。根据GenBank中的H3亚型猪流感病毒HA基因保守序列设计了用于FQ-PCR的1对引物和1条TaqMan探针。通过条件优化，以10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增，并制作标准曲线，建立了检测H3亚型猪流感的荧光定量PCR方法。结果表明，该方法检测灵敏度可达1．0×10^0拷贝／μL，线性范围为10^9-10^0，达10个数量级；对起始浓度为1．0×10^9、1．0×10^8、1．0×10^7拷贝／μL的标准品的最终实际测得值（Ct）分别为13．68，18．21和20．57；变异系数分别为0．31％、0．17％和0．12％，均小于5％，说明此方法具有良好的准确性和重现性。对阳性组织病料的检测表明，该方法的检测灵敏度高出常规PCR，与套式PCR具有相近的灵敏度。 展开更多

关键词 猪流感病毒 h3亚型 荧光定量PCR TAQMAN探针

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数字RT-PCR技术检测H3N2亚型猪流感病毒方法的建立 被引量：3

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作者 唐连飞 禹思宇 周宇 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第6期1847-1853,共7页

试验旨在利用新型荧光探针——分子信标,建立一种检测猪流感病毒的新方法。根据H3N2亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的H3和N2基因的保守基因序列,分别设计并合成了特异性引物和分子信标探针,利用数字RT-PCR技术检测H3N2亚型... 试验旨在利用新型荧光探针——分子信标,建立一种检测猪流感病毒的新方法。根据H3N2亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的H3和N2基因的保守基因序列,分别设计并合成了特异性引物和分子信标探针,利用数字RT-PCR技术检测H3N2亚型SIV。结果显示,该数字RT-PCR检测方法与其他主要相关病毒均不发生交叉反应,重复性良好;对猪H3N2流感病毒而言,最低可检测到106倍稀释的病毒株。数字RT-PCR方法能够对RNA模板定量分析。在H3N2SIV的鉴定上,数字RT-PCR方法较实时荧光定量PCR方法更灵敏、准确。 展开更多

关键词 猪流感病毒 h3N2亚型 分子信标探针 数字RT-PCR 实时荧光定量PCR 灵敏性 特异性 重复性

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分子信标荧光定量PCR检测H3N2亚型猪流感病毒方法的建立 被引量：2

16

作者 禹思宇 周宇 +3 位作者 唐连飞 孟芳 袁晓芬 梁斌 《中国动物检疫》 CAS 2015年第7期67-71,76,共6页

利用新型荧光探针—分子信标,建立一种检测猪流感病毒的新方法。根据H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的HA和NA基因的保守基因序列,分别设计并合成了特异性引物和分子信标探针,利用实时荧光定量PCR技术检测H3N2亚型SIV。构建重组质粒p SK-H3和p ... 利用新型荧光探针—分子信标,建立一种检测猪流感病毒的新方法。根据H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的HA和NA基因的保守基因序列,分别设计并合成了特异性引物和分子信标探针,利用实时荧光定量PCR技术检测H3N2亚型SIV。构建重组质粒p SK-H3和p SK-N2并绘制标准曲线。结果显示,该检测方法的敏感性达到102拷贝/μL;与其它主要相关病毒均不发生交叉反应,批内和批间试验的重复性变异系数(CV)均小于3%,表明该方法灵敏度强、特异性好。此方法的建立将为流感病毒H3N2亚型定型检测提供一种快速有效的方法。 展开更多

关键词 猪流感病毒 h3N2亚型 分子信标探针 实时荧光定量PCR

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H1和H3亚型禽流感病毒二重PCR检测方法的建立 被引量：8

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作者 郭捷 谢芝勋 +5 位作者 彭宜 刘加波 谢志勤 庞耀珊 邓显文 谢丽基 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2012年第12期31-34,共4页

为建立简便、快速同时检测H1和H3亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的方法,根据GenBank中H1亚型AIV-HA基因和H3亚型AIV-HA基因的序列,分别设计了2对针对H1AIV和H3AIV的保守基因序列的引物。应用这2对引物对混有H1AIV和H3AIV的... 为建立简便、快速同时检测H1和H3亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的方法,根据GenBank中H1亚型AIV-HA基因和H3亚型AIV-HA基因的序列,分别设计了2对针对H1AIV和H3AIV的保守基因序列的引物。应用这2对引物对混有H1AIV和H3AIV的模板进行二重PCR扩增,得到了2个特异性扩增条带,大小与试验设计相符的302bp(H1AIV)和626bp(H3AIV),而对其他亚型AIV和禽呼吸道病原体的PCR扩增结果均为阴性,敏感性测定结果表明,该二重PCR技术能同时检出50pg的H1AIV模板和26pg的H3AIV模板。 展开更多

关键词 禽流感病毒 h1亚型 h3亚型 二重聚合酶链反应

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microRNA-124-3p调控H1N1亚型猪流感病毒致小鼠肺损伤的研究

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作者 黄良宗 张海龙 +4 位作者 颜广智 谢博 陈盛楠 邓汝森 顾万军 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第10期3049-3057,共9页

为研究microRNA-124-3p(miR-124-3p)对H1N1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)感染小鼠所致肺损伤的调控作用,本试验构建miR-124-3p腺病毒表达载体,通过小鼠尾部静脉注射法构建miR-124-3p差异表达小鼠模型,试验分3组:过表达组... 为研究microRNA-124-3p(miR-124-3p)对H1N1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)感染小鼠所致肺损伤的调控作用,本试验构建miR-124-3p腺病毒表达载体,通过小鼠尾部静脉注射法构建miR-124-3p差异表达小鼠模型,试验分3组:过表达组、抑制组和对照组。48 h后,各组小鼠鼻腔接种H1N1亚型SIV,每只105 EID50(50μL)。连续观察14 d,计算小鼠平均体重变化率、观察病理切片并测定相关炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA相对表达量。结果显示,已成功将pre-miR序列及其sponge序列插入腺病毒的穿梭质粒,并将其共转染293A细胞。实时荧光定量PCR检测证实,与对照组相比,过表达组和抑制组小鼠黑色素瘤细胞miR-124-3p表达水平分别极显著升高(P<0.01)和显著降低(P<0.05),表明成功构建腺病毒表达载体。过表达组、抑制组和对照组小鼠体重变化率分别为-5.5%、-12.4%和-8.6%。抑制组和对照组均可见肺泡壁增厚,其间有多量淋巴细胞浸润,部分肺泡内出现纤维蛋白渗出,且抑制组病理变化更为严重,肺泡中还有大量的红细胞浸润;而过表达组仅有少量的淋巴细胞浸润,肺脏组织较正常。与对照组相比,过表达组检测的炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA表达水平均显著降低(P<0.05);抑制组炎症相关炎症因子mRNA表达水平均显著升高(P<0.05)。本试验结果表明,miR-124-3p对H1N1亚型SIV感染小鼠所致的肺脏炎症因子的表达具有抑制作用,同时能减轻肺脏病理损伤。 展开更多

关键词 microRNA-124-3p h1N1亚型猪流感病毒 肺损伤 差异表达

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部分猪场H1和H3亚型猪流感的血清学调查 被引量：5

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作者 陈锦成 张丹琳 +2 位作者 陈敏鸿 张显浩 贺东生 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第9期178-181,共4页

为了解中国部分省市规模化猪场H1和H3亚型猪流感病毒的流行情况,采用血凝抑制试验对采集于广东、湖南、河南省12个市县28个规模化猪场的799份血清进行H1和H3亚型猪流感病毒的抗体检测。结果表明,H1亚型抗体阳性率在0～83.33%之间,猪抗... 为了解中国部分省市规模化猪场H1和H3亚型猪流感病毒的流行情况,采用血凝抑制试验对采集于广东、湖南、河南省12个市县28个规模化猪场的799份血清进行H1和H3亚型猪流感病毒的抗体检测。结果表明,H1亚型抗体阳性率在0～83.33%之间,猪抗体总阳性率为46.18%(369/799),猪场阳性率为89.29%(25/28)。H3亚型抗体阳性率在0～100.00%之间,猪抗体总阳性率为61.33%(490/799),猪场阳性率为85.71%(24/28)。广东、湖南和河南地区H1亚型抗体阳性率分别为48.91%、40.26%和50.67%,H3亚型抗体阳性率分别为58.55%、70.78%和78.67%。在被调查的上述3个地区的猪群中,H1和H3亚型猪流感病毒的感染较为普遍,其中H3亚型感染率高于H1亚型,且各地区猪流感病毒的流行情况存在地域性差异。 展开更多

关键词 猪流感 血清学调查 h1亚型 h3亚型 血凝抑制试验

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两株H1N1亚型重组流感病毒的猪致病性研究 被引量：3

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作者 何剑桥 何平 +10 位作者 赵卫锋 周华波 丁仰保 梁明丽 祝健 李瑞凯 莫彦宁 韦祖樟 欧阳康 黄伟坚 陈樱 《动物医学进展》 北大核心 2019年第2期45-50,共6页

选取2种不同宿主来源的新型甲型重组H1N1亚型流感病毒(犬流感病毒(A/canine/Guangxi/QZ5/2013)(简称CIV-QZ5)和猪流感病毒(A/swine/Guangxi/QZ5/2014)(简称SIV-QZ5),以猪为动物模型,分别以106 PFU/mL病毒剂量和气管攻毒的方式感染3周龄... 选取2种不同宿主来源的新型甲型重组H1N1亚型流感病毒(犬流感病毒(A/canine/Guangxi/QZ5/2013)(简称CIV-QZ5)和猪流感病毒(A/swine/Guangxi/QZ5/2014)(简称SIV-QZ5),以猪为动物模型,分别以106 PFU/mL病毒剂量和气管攻毒的方式感染3周龄仔猪,从而探究新型甲型重组犬流感病毒对猪的致病性。试验发现CIV-QZ5及SIV-QZ5均能有效感染仔猪,攻毒仔猪均出现发热(≥39.5℃)、流鼻涕、食欲减退、活动减少等流感症状,其中CIV组出现1头仔猪(A3)死亡。通过对肺脏灌洗液进行病毒滴定,发现CIV组在攻毒后3d和5d在肺脏的复制能力较SIV组强,最高达到3.12log10PFU/mL。病理剖检发现,肺脏出现不同程度的实变。肺脏病理切片发现两组均出现不同病变,其中以死亡仔猪(A3)最为明显,主要以支气管上皮细胞坏死脱落,肺泡壁增厚,肺泡腔以及支气管内有大量的弥漫性浸润的单核细胞为主要特征。结果表明,猪源甲型重组CIV不仅能引发猪出现明显流感症状,而且能有效地在肺脏复制,为了解潜在的猪-犬跨宿主传播机制奠定了基础。 展开更多

关键词 h1N1亚型流感 重组病毒 犬流感病毒 致病性 猪

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