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SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测结直肠癌中Tiam-1和HPA-1基因的表达 被引量:2
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作者 崔京远 马红 +2 位作者 马文慧 王贺 周东风 《中国现代普通外科进展》 CAS 2010年第7期509-513,共5页
目的:检测Tiam-1基因和HPA-1基因在结直肠癌组织中的表达水平,探讨两者与结直肠癌侵袭转移及预后的关系。方法:选取2009年8月-2010年1月我院行手术治疗的结直肠癌患者53例。采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方... 目的:检测Tiam-1基因和HPA-1基因在结直肠癌组织中的表达水平,探讨两者与结直肠癌侵袭转移及预后的关系。方法:选取2009年8月-2010年1月我院行手术治疗的结直肠癌患者53例。采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Tiam-1 mRNA及HPA-1 mRNA在结直肠癌组织、癌旁组织(距癌2cm)及远离结直肠癌的手术切缘正常组织中(距癌5cm以上)的表达水平,并分析两者与结直肠癌临床病理参数的关系。结果:HPA-1 mRNA和Tiam-1 mRNA在结直肠癌中的表达水平(35.87±12.30,40.79±9.32)显著高于癌旁组织(13.13±6.71,12.39±5.38)和正常组织(4.06±3.55,6.09±4.86,P均<0.05),癌旁组织中二者的表达水平高于正常组织,差异有统计学意义(P<0.05)。Tiam-1和HPA-1的基因表达水平在肿瘤的高/中分化和低分化之间,T1~T2和T3~T4之间,有淋巴结转移和无淋巴结转移之间、有血行转移和无血行转移之间及Ⅰ~Ⅱ和Ⅲ~Ⅳ期之间的差异均有统计学意义(P均<0.05)。Spearman等级相关分析证明了Tiam-1与HPA-1的表达呈正相关趋势(OR=0.46,P=0.048)。结论:Tiam-1 mRNA和HPA-1 mRNA在结肠癌组织中呈高表达,且二者的表达增强可促进结肠癌的侵袭转移,联合检测Syndecan-1及HPA-1对于指导结肠癌临床治疗及判断预后有重要价值。 展开更多
关键词 结直肠肿瘤 侵袭转移 预后 TIAM-1 HPA-1 SYBR greenⅰ实时荧光定量pcr
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猪伪狂犬病病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立 被引量:6
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作者 陈如敬 吴学敏 +5 位作者 陈秋勇 严山 车勇良 王晨燕 王隆柏 周伦江 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第7期1717-1722,共6页
本研究根据猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的gE基因序列特点,设计特异性实时荧光定量引物,建立基于SYBR GreenⅠ染料的猪PRV实时荧光定量PCR方法。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法检测猪PRVgE基因在7.53×10^1~7.53... 本研究根据猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的gE基因序列特点,设计特异性实时荧光定量引物,建立基于SYBR GreenⅠ染料的猪PRV实时荧光定量PCR方法。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法检测猪PRVgE基因在7.53×10^1~7.53×10^6拷贝/μL范围内有较好的线性关系;对猪圆环病毒(porcine circovirus2,PCV2)、猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)和猪链球菌(Streptococcus susi)核酸均未见阳性扩增信号;从生成的熔解曲线可见,建立的方法仅对猪PRV检测出现单一特异峰,其熔解温度(Tm值)为(92.9±0.1)℃,PCV2、PPV、副猪嗜血杆菌和猪链球菌均未见特异性峰值;建立的实时荧光定量PCR方法的组内和组间变异系数分别为0.31%~1.14%和0.42%~1.74%。以上结果表明,本研究建立的猪PRV实时荧光定量PCR方法敏感性高、特异性强、重复性好,为深入开展猪PRV对宿主致病机制的研究提供检测手段。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病毒 GE基因 SYBR green 实时荧光定量pcr
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检测猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用 被引量:1
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作者 杨春华 胡慧 +2 位作者 钟毅 韩志涛 祝建新 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第6期745-749,共5页
利用反转录PCR(RT-PCR)技术扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因部分片段,并克隆到pGEM-TEasy载体上,得到重组质粒作为荧光定量PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立PRRS... 利用反转录PCR(RT-PCR)技术扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因部分片段,并克隆到pGEM-TEasy载体上,得到重组质粒作为荧光定量PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立PRRSV的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对16份临床疑似病料进行了检测,发现15份均为荧光定量PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出12份阳性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5基因 实时荧光定量pcr SYBR green
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猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:3
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作者 吴忆春 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第2期20-24,共5页
为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,采用RT-PCR扩增PRRSV N基因266bp片段,并克隆到pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,建立了PRRSV荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏... 为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,采用RT-PCR扩增PRRSV N基因266bp片段,并克隆到pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,建立了PRRSV荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.3×101拷贝/μL,与猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪日本脑炎病毒(JEV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明,建立的PRRSV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床猪繁殖与呼吸综合征病毒病(PRRS)的诊断。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 N基因 实时荧光定量pcr
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牛轮状病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量:6
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作者 贾伟强 曹禹 +8 位作者 周玉龙 孟野 胡林杰 翟海瑞 范增磊 盛守志 于力 常继涛 范春玲 《动物医学进展》 北大核心 2020年第5期1-5,共5页
旨在建立一种SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测牛轮状病毒(BRV)的方法,并采用针对BRV vp6基因序列保守区设计的引物,使用RT-qPCR方法进行目的基因扩增,优化反应条件,制备阳性标准品,建立标准曲线,确定重复性、敏感性和特异性,... 旨在建立一种SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测牛轮状病毒(BRV)的方法,并采用针对BRV vp6基因序列保守区设计的引物,使用RT-qPCR方法进行目的基因扩增,优化反应条件,制备阳性标准品,建立标准曲线,确定重复性、敏感性和特异性,与常规PCR方法比较。结果显示,建立的RT-qPCR方法最佳引物浓度为5μmol/L,退火温度为58℃,40个循环,熔解温度为77℃±0.5℃,最小检出量8.13copies/μL。两种方法检出率分别为30.4%和19.6%,RT-qPCR具有较高敏感性。建立的RT-qPCR可为BRV感染早期诊断、分子流行病学调查及定量检测分析等提供技术保障。 展开更多
关键词 牛轮状病毒 SYBR green 实时荧光定量pcr
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GCLV病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用
6
作者 陈辉麟 李唯 栗孟飞 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期82-86,共5页
根据 GenBank 发表的大蒜普通潜隐病毒(GCLV)的外壳蛋白基因的保守序列设计了一对引物,以全基因序列合成的方法获得质粒标准品,以此质粒标准品为模板建立 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测 GCLV的方法.该方法在4.2×10^1~4.2×... 根据 GenBank 发表的大蒜普通潜隐病毒(GCLV)的外壳蛋白基因的保守序列设计了一对引物,以全基因序列合成的方法获得质粒标准品,以此质粒标准品为模板建立 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测 GCLV的方法.该方法在4.2×10^1~4.2×10^7拷贝之间呈现良好的线性关系,相关系数为0.999,扩增效率为106%,最低可检测42拷贝/PCR反应阳性标准品,比常规PCR敏感100倍;扩增产物的溶解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,溶解温度为(77.5±0.9)℃;重复性好,组内变异系数为0.2%~1.1%.用该方法对疑似带病的大蒜材料进行检测,结果表明 GCLV-SYBR GreenⅠPCR特异性强,操作简便,敏感性高,可以用于 GCLV 感染的检测及定量分析. 展开更多
关键词 实时荧光定量pcr 大蒜普通潜隐病毒 SYBR green I
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基于SYBR GreenⅡ的BVDV NS3基因实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用
7
作者 李阳 张世勋 +4 位作者 赫鸣睿 刘珊珊 岳山 刘宇 朱战波 《黑龙江八一农垦大学学报》 2025年第2期23-31,共9页
为了建立基于SYBR GreenⅡ的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法,设计并筛选了BVDV NS3基因的qRT-PCR引物,建立了BVDV NS3 qRT-PCR检测方法,并利用CFX96和猪警-2000 qRT-PCR仪检测了临床牛血清样本。结果显... 为了建立基于SYBR GreenⅡ的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法,设计并筛选了BVDV NS3基因的qRT-PCR引物,建立了BVDV NS3 qRT-PCR检测方法,并利用CFX96和猪警-2000 qRT-PCR仪检测了临床牛血清样本。结果显示,筛选出1对特异性好的引物,CFX96和猪警-2000 qRT-PCR的标准品最小检出值分别为1×10^(1)copies·μL^(-1)和1×10^(2) copies·μL^(-1),特异性和重复性均良好,且临床血清样本的检测结果准确、一致。研究为BVDV检测提供了技术手段。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 NS3基因 实时荧光定量pcr SYBR green
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鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用
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作者 张玉霞 董雯雯 +2 位作者 袁小远 孟凯 徐怀英 《山东农业科学》 北大核心 2024年第6期128-132,共5页
鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基... 鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基因为靶基因设计引物,扩增并构建pMD18-T-TK质粒标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行验证,并对临床疑似病例进行检测。结果发现,该检测方法特异性良好,与其他常见症状相似病原无交叉反应;最低检测浓度为1.55拷贝/μL,灵敏度是普通PCR方法的10倍;重复性好,批内、批间变异系数在0.79%~1.83%之间。表明本研究建立的ILTV实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可为ILTV的临床诊断和流行病学研究等提供有效的检测方法。 展开更多
关键词 鸡喉气管炎病毒 TK基因 实时荧光定量pcr 特异性 敏感性 重复性
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实时荧光定量PCR法检测左旋多巴中大肠埃希菌宿主细胞DNA残留量
9
作者 许冰瑜 刘妍 +2 位作者 郭心瑶 严方 孙桂斌 《中国药科大学学报》 北大核心 2025年第2期176-182,共7页
采用实时荧光定量PCR技术,建立特异性强、灵敏度高的左旋多巴中大肠埃希菌(Escherichiacoli)宿主细胞DNA残留量的检测方法,并进行验证和初步应用。以大肠埃希菌中的相对保守的E.coli MB6菌株16S核糖体RNA基因序列作为目的基因设计多对引... 采用实时荧光定量PCR技术,建立特异性强、灵敏度高的左旋多巴中大肠埃希菌(Escherichiacoli)宿主细胞DNA残留量的检测方法,并进行验证和初步应用。以大肠埃希菌中的相对保守的E.coli MB6菌株16S核糖体RNA基因序列作为目的基因设计多对引物,通过PCR进行特异性扩增获得目的片段。将目的片段重组至pLENTI-BSD-CON载体构建重组质粒命名为pLENTI-BSD-CON-E.coli-16S,以其为标准品,结合磁珠法提取纯化DNA,建立定量PCR检测方法(SYBR-Green法)。对建立的方法进行线性与范围、准确度、精密度、专属性、定量限及耐用性的方法学验证,应用于左旋多巴原料药的检测,并与试剂盒检测方法(Taqman探针法)进行比较。建立的定量PCR检测方法(SYBR-Green法)正向引物序列:5'-TTCGATGCAACGCGAAGAAC-3';反向引物序列:5'-GTGTAGCCCTGGTCGTAAGG-3'。以重组质粒作为标准品,DNA质量浓度在10fg/μL~3 ng/μL范围内线性关系良好(R^(2)≥0.98),定量限为10 fg/μL,加标溶液回收率在59.7%~80.7%范围内,RSD均小于30%。应用该法对3批左旋多巴原料药进行检测,DNA残留量均在限度以下。结果表明,建立的检测方法可用于定量检测左旋多巴等由大肠埃希菌作为宿主细胞生产的生物制品的DNA残留量,并且其灵敏度优于试剂盒检测方法。 展开更多
关键词 大肠埃希菌 左旋多巴 构建质粒 实时荧光定量pcr 外源性DNA残留 帕金森病
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PCV4 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用 被引量:13
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作者 黄小武 杜倩 +7 位作者 闭璟珊 韦正吉 邹联斌 赵子欣 闫修魁 韩知晓 辛佳亮 郑敏 《中国动物检疫》 CAS 2020年第10期109-113,共5页
为建立一种灵敏、可快速检测猪圆环病毒4型(PCV4)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,根据PCV4 Rep基因的保守区域设计引物,建立针对PCV4的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显... 为建立一种灵敏、可快速检测猪圆环病毒4型(PCV4)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,根据PCV4 Rep基因的保守区域设计引物,建立针对PCV4的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显示,该检测方法的Ct值与标准品在5.64×10~2~5.64×10~9 copies/μL范围内呈良好的线性关系,R^2为0.999,斜率为-3.638,检测下限为5.64×10~2 copies/μL,且无非特异性扩增。利用该方法对56份临床样品进行检测,发现PCV4核酸阳性率为3.57%,比普通PCR更灵敏可靠。结果表明,本试验建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法可用于PCV4的快速诊断。 展开更多
关键词 猪圆环病毒4型 SYBR greenⅰ实时荧光定量pcr 快速检测
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跨膜蛋白39A基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及评价
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作者 李向茸 王兴陇 +5 位作者 李倩 马瑞仙 张海霞 李琼毅 马忠仁 冯若飞 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2018年第11期1958-1964,共7页
为建立一种快速检测跨膜蛋白39A(TMEM39A)基因的方法,根据GenBank中登录的不同种属TMEM39A基因序列的保守区域,设计并合成1对荧光定量通用性引物,经过条件优化,建立了检测TMEM39A基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:标准... 为建立一种快速检测跨膜蛋白39A(TMEM39A)基因的方法,根据GenBank中登录的不同种属TMEM39A基因序列的保守区域,设计并合成1对荧光定量通用性引物,经过条件优化,建立了检测TMEM39A基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:标准品模板在3. 937×10~8~3. 937×10~3拷贝·μL^(-1)范围内呈良好的线性关系,R^2可达0. 999;该方法特异性较好,检测灵敏度可达3. 937×10~2拷贝·μL^(-1);组内和组间变异系数均小于1%,具有较高的重复性和稳定性;利用该方法能够检测出不同细胞中的TMEM39A含量,具有种属通用性。该研究方法的建立为临床上提供了一种TMEM39A的快速检测和定量分析技术。 展开更多
关键词 跨膜蛋白39A SYBR greenⅰ实时荧光定量pcr 特异性 灵敏性
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姜荷花苞片实时荧光定量PCR内参基因筛选
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作者 谭健俊 黄李珊 +2 位作者 周熠玮 徐晔春 叶远俊 《广东农业科学》 2025年第2期108-116,共9页
[目的]筛选适用于姜荷花苞片组织qRT-PCR分析的内参基因,为苞片颜色相关基因功能研究奠定理论基础。[方法]以9个不同颜色的姜荷花品种为试材,根据姜荷花基因组数据选择常用的内参基因,包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、18S核糖体RNA(18S... [目的]筛选适用于姜荷花苞片组织qRT-PCR分析的内参基因,为苞片颜色相关基因功能研究奠定理论基础。[方法]以9个不同颜色的姜荷花品种为试材,根据姜荷花基因组数据选择常用的内参基因,包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、18S核糖体RNA(18S rRNA)、蛋白磷酸酶2A(PP2A)、泛素蛋白(UBQ)、苹果酸脱氢酶(MDH)、肌动蛋白(Actin)、微管蛋白(TUB)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)8个看家基因,使用ΔCt、geNorm、NormFinder和BestKeeper 4种分析方法评估基因表达的稳定性,通过RefFinder程序综合评价以筛选出姜荷花苞片组织的最佳内参基因。[结果]8个内参基因均扩增出单一主峰,引物标准曲线相关系数R~(2 )≥ 0.98,扩增效率为99.5%~125.0%,PCR产物经1%琼脂糖电泳检测显示条带清晰单一,表明引物设计特异性好。4种不同的算法分析获得的结果排名有差异,其中MDH在ΔCt、geNorm和NormFinder分析中为表达最稳定的内参基因,18S rRNA在BestKeeper分析中为表达最稳定的内参基因。利用RefFinder程序综合评价得出候选内参基因稳定性综合排名,排序依次为MDH>Actin>TUB>18S rRNA>PP2A>GAPDH>UBQ>PAL,表明不同品种姜荷花苞片最佳内参基因是MDH,其次为Actin和TUB,PAL稳定性最差、不适合作为姜荷花苞片组织的内参基因。[结论]MDH可作为不同品种姜荷花苞片组织的稳定内参基因,为后续深入开展姜荷花苞片颜色合成相关基因的表达模式分析提供参考。 展开更多
关键词 实时荧光定量pcr 姜荷花 内参基因 苞片颜色 MDH 基因表达模式
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SYBR GreenⅠ染料-实时荧光定量聚合酶链式反应法检测发酵乳中的霉菌和酵母含量 被引量:1
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作者 张捷 李献 +4 位作者 张瑞 刘雨蒙 明若阳 陈佳 周巍 《食品安全质量检测学报》 CAS 2024年第16期31-38,共8页
目的建立一种应用SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量聚合酶链式反应法快速检测发酵乳中的霉菌和酵母菌。方法本研究针对霉菌与酵母菌的保守序列设计引物,确定最优反应体系与反应条件。通过熔解曲线以及非目标菌株的检测验证该方法的特异性... 目的建立一种应用SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量聚合酶链式反应法快速检测发酵乳中的霉菌和酵母菌。方法本研究针对霉菌与酵母菌的保守序列设计引物,确定最优反应体系与反应条件。通过熔解曲线以及非目标菌株的检测验证该方法的特异性;通过菌悬液的梯度稀释检测确定该方法的灵敏度;通过菌悬液与发酵乳样品混合后进行检测,确定该方法的检出限,并得到标准曲线。结果该方法能够特异性的检测发酵乳中的霉菌、酵母菌,无交叉反应。该方法检测霉菌、酵母菌的灵敏度均为10^(2) CFU/mL,并且当菌悬液与发酵乳样品混合后,并没有降低该方法的检出限。在10^(2)~10^(6) CFU/mL浓度范围内,菌液浓度的对数值与循环阈值(cyclethreshold,Ct)具有良好的线性关系,可以在市售样品的检测中通过Ct值计算样品中目标菌的含量,更快的判断发酵乳是否被霉菌、酵母菌污染。结论该方法可用于发酵乳中霉菌和酵母菌的快速检测,为发酵乳的食品安全提供了技术保障。 展开更多
关键词 霉菌 酵母 SYBR green染料 检测 实时荧光定量聚合酶链式反应 发酵乳
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SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测PRRSV方法的建立 被引量:6
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作者 罗忠永 王印 杨泽晓 《动物医学进展》 北大核心 2016年第4期1-5,共5页
根据编码PRRSV M蛋白的基因序列设计用于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增的引物,通过温度梯度法优化反应体系;以不同科属常见猪致病性RNA病毒疫苗验证该检测方法的特异性,参考国内PRRSV分子流行病学特征,选择基因型代表性的2株疫苗株... 根据编码PRRSV M蛋白的基因序列设计用于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增的引物,通过温度梯度法优化反应体系;以不同科属常见猪致病性RNA病毒疫苗验证该检测方法的特异性,参考国内PRRSV分子流行病学特征,选择基因型代表性的2株疫苗株验证该检测方法的稳定性;以10倍梯度稀释的质粒为标准品扩增并构建标准曲线,探究该检测方法的灵敏度,随机挑取10份保存的PRRSV阳性病料和10份阴性病料同时使用农业部推荐的PRRSV RT-PCR检疫标准方法和建立的方法进行检测,以确定2种方法检测的符合率。结果显示,使用建立的方法可以在54.4℃80min内完成对PRRSV的检测,该检测方法具有特异性和稳定性;检测灵敏度为6.8×10拷贝/μL;以Ct值为横坐标,扩增序列拷贝浓度的对数值为纵坐标,得到标准曲线,方程为y=-3.411 x+39.002,R2=0.999;对随机挑取的10份PRRSV阳性病料和10份阴性病料进行检测,结果2种方法检测结果的符合率100%。结果表明,成功建立了PRRSV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR快速检测方法,为临床提供了一种很好的检测手段。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 M蛋白 SYBR greenⅰ实时荧光定量pcr
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兔出血症病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用 被引量:4
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作者 王波 李桂黎 +2 位作者 王印 姚学萍 杨泽晓 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2016年第3期400-405,共6页
兔病毒性出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)是一种具有高度传染性的疾病,严重威胁养兔业的健康发展。为了建立一种能够快速、高效、敏感的检测RHDV的方法,试验设计了一对特异性引物进行PCR扩增,得到RHDV VP60基因中979 bp的保守序... 兔病毒性出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)是一种具有高度传染性的疾病,严重威胁养兔业的健康发展。为了建立一种能够快速、高效、敏感的检测RHDV的方法,试验设计了一对特异性引物进行PCR扩增,得到RHDV VP60基因中979 bp的保守序列,并将其克隆到p MD19-T载体中作为标准品建立标准曲线;在扩增区域内设计一对简并引物,建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,优化反应条件,并验证该方法的敏感性、特异性、重复性。结果表明:该方法可检测到的模板的最低拷贝数为8.18×101copies,只能特异性扩增RHDV,pGM19-T-EBHSV、兔巴氏杆菌、兔沙门氏菌、兔大肠埃希菌和健康兔组织RNA的扩增均为阴性,具有良好的特异性和重复性;同时用此方法对人工感染家兔的内脏分别进行检测,结果表明SYBR GreenⅠ荧光定量PCR能快速检测到不同脏器中的兔病毒性出血症病毒RNA含量,可用于临床兔瘟病毒的检测。 展开更多
关键词 兔病毒性出血症病毒(RHD) VP60 SYBR green 实时荧光定量pcr
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火鸡疱疹病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量:2
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作者 刘杉杉 孙伟 +4 位作者 闫敏鑫 黄秀芬 姜良 何诚 李永清 《动物医学进展》 北大核心 2015年第2期16-20,共5页
针对火鸡疱疹病毒(HVT)特异性的sorf1区基因序列设计引物,建立检测HVT的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行检测。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好线性关... 针对火鸡疱疹病毒(HVT)特异性的sorf1区基因序列设计引物,建立检测HVT的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行检测。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好线性关系(r2=0.99),熔解曲线分析显示该PCR扩增具有良好的特异性、敏感性和重复性,试验表明该方法最低检测浓度为7×101拷贝/μL。利用该方法对野生型HVT和rHVT-pmpD-N在体内和体外的复制特性进行检测,结果表明重组后的HVT与野生型HVT的增殖速度基本一致。本试验建立的检测方法能够快速检测HVT,准确率高,特异性好,具有较高的灵敏度和稳定性,为监测HVT体内和体外的病毒含量和复制情况提供了一种有效的手段。 展开更多
关键词 火鸡疱疹病毒 SYBR green 实时荧光定量pcr sorf1
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鸡β-防御素-1 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:3
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作者 李岩 王元心 +1 位作者 隋欣 郑世民 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第6期46-51,共6页
以鸡β-防御素-1(Gallinacin-1,Gal-1)为研究对象,据GenBank中已发表的鸡β-actin和Gal-1序列设计引物,构建重组质粒作为标准品,成功建立了检测鸡免疫器官组织中Gal-1mRNA表达的实时荧光定量PCR方法,并进行灵敏度、重复性、特异性试验... 以鸡β-防御素-1(Gallinacin-1,Gal-1)为研究对象,据GenBank中已发表的鸡β-actin和Gal-1序列设计引物,构建重组质粒作为标准品,成功建立了检测鸡免疫器官组织中Gal-1mRNA表达的实时荧光定量PCR方法,并进行灵敏度、重复性、特异性试验。结果显示,此方法具有快速、高通量、线性范围广、特异性强、灵敏度高等特点,为进一步定量研究Gal-1mRNA表达及其与机体免疫机能的关系奠定了技术基础。 展开更多
关键词 Gal-1基因 实时荧光定量pcr
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SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测类风湿关节炎患者血清miR-146a的表达及意义 被引量:3
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作者 刘琴 王伟 张仙珍 《临床检验杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期422-425,共4页
目的用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法检测类风湿关节炎(RA)患者血清miR-146a的表达水平,探讨其在RA诊断中的意义。方法以U6为内参照,用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测RA患者48例(活动期30例、缓解期18例)、骨性关节炎(OA)患者2... 目的用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法检测类风湿关节炎(RA)患者血清miR-146a的表达水平,探讨其在RA诊断中的意义。方法以U6为内参照,用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测RA患者48例(活动期30例、缓解期18例)、骨性关节炎(OA)患者22例和体检健康者25例血清miR-146a的表达水平,并进行ROC曲线分析;对各组进行红细胞沉降率(ESR)检测。结果 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测结果表明,活动期RA患者血清miR-146a水平为(2.42±0.75),显著高于缓解期RA患者(1.66±0.29)、OA患者(1.12±0.43)和体检健康者(1.01±0.34),差异均有统计学意义(P均〈0.05);miR-146a诊断活动期RA的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.914(95%CI:0.872~0.926);以1.96为cut off值,敏感性为95.0%、特异性为87.5%、准确性为91.9%。活动期RA组ESR为(37.5±5.2)mm/h,缓解期RA组为(14.4±4.7)mm/h,OA组为(11.6±5.1)mm/h,健康对照组为(9.6±3.9)mm/h,各组间差异有统计学意义(F=177.01,P〈0.01)。结论建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR可用于RA患者血清miR-146a的检测。miR-146a可用于诊断活动期RA。 展开更多
关键词 SYBR greenⅰ实时荧光定量pcr 微小RNA-146a 类风湿关节炎
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SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测宫颈癌血清中miR-21的表达 被引量:9
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作者 陈文璟 温旺荣 《临床检验杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期523-525,共3页
目的建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法检测宫颈疾病患者血清中miR-21的表达水平,探讨miR-21在宫颈癌临床监测中的意义。方法设计miR-21、U6茎环逆转录引物和PCR扩增引物,以U6为内参,用实时荧光定量PCR检测32例不同宫颈疾病患者血清中m... 目的建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法检测宫颈疾病患者血清中miR-21的表达水平,探讨miR-21在宫颈癌临床监测中的意义。方法设计miR-21、U6茎环逆转录引物和PCR扩增引物,以U6为内参,用实时荧光定量PCR检测32例不同宫颈疾病患者血清中miR-21表达水平。结果建立的实时荧光定量PCR法能特异地检测血清中的miR-21扩增信号,熔解曲线单一,产物特异。宫颈癌患者血清中miR-21水平明显高于子宫肌瘤、宫颈炎等其他良性宫颈疾病(P<0.05),而宫颈癌患者手术切除后血清中miR-21水平明显下降(P<0.05)。结论 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR是一种快速简便、敏感性高、特异性好的检测方法,对宫颈癌早期诊断、分子分期和预后判断有很好的应用前景。 展开更多
关键词 SYBRgreenⅰ实时荧光定量pcr MIR-21 宫颈癌
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鸡传染性贫血病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:5
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作者 杨丽聪 苏霞 +4 位作者 朱瑞豪 周宏专 徐福州 杨兵 孙继国 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第4期859-864,共6页
为建立鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)的实时荧光定量PCR检测方法,本试验通过CIAV基因组保守区域设计1对扩增片段大小为180bp的特异性引物,构建pGM-T-CIAV重组质粒,制备阳性标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定... 为建立鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)的实时荧光定量PCR检测方法,本试验通过CIAV基因组保守区域设计1对扩增片段大小为180bp的特异性引物,构建pGM-T-CIAV重组质粒,制备阳性标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果显示,CIAV的Ct阈值与标准品浓度在5.33×108至5.33×103拷贝/μL间呈良好的线性关系,相关系数R2=0.998,斜率为-3.443,产物Tm值在86℃左右。该方法与网状内皮组织增生病病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)J亚型、马立克氏病病毒(MDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组均无交叉反应,敏感性为5.33拷贝/μL,比普通PCR高1 000倍,批内和批间重复试验变异系数均小于3%。结果表明,本试验建立的CIAV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可实现对鸡传染性贫血病的早期诊断及感染程度的定量分析的检测。 展开更多
关键词 鸡传染性贫血病毒 实时荧光定量 pcr SYBR green I 定量分析
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