为建立牛副流感病毒5型(BPIV5)的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究经PCR扩增BPIV5 L基因的保守片段,构建重组质粒p MD18-T-BPIV5,并经PCR、双酶切与测序鉴定正确后作为标准品,经各反应条件优化后初步建立检测BPIV5的qPCR...为建立牛副流感病毒5型(BPIV5)的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究经PCR扩增BPIV5 L基因的保守片段,构建重组质粒p MD18-T-BPIV5,并经PCR、双酶切与测序鉴定正确后作为标准品,经各反应条件优化后初步建立检测BPIV5的qPCR方法。利用10倍倍比稀释的质粒标准品作为模板,利用优化的qPCR扩增,建立该方法的标准曲线,结果显示,重组质粒标准品的拷贝数与其Ct值呈良好的线性关系,相关系数为0.998,扩增效率为1.09。以BPIV5、牛肠道病毒(BEV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛诺如病毒(BNOV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)和牛冠状病毒(BCOV)的cDNA作为模板,采用该qPCR扩增,评估该方法的特异性;以10倍倍比稀释的重组质粒标准品pMD18-T-BPIV5作为模板,利用本研究建立的qPCR方法扩增,评估该方法的敏感性;以3种不同浓度的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的qPCR方法在同一时间和不同时间分别进行批内和批间重复性试验。结果显示,该方法仅能特异性扩增BPIV5,其他相关病毒均为阴性结果;对质粒标准品的检测限为6.43拷贝/μL;批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。利用该方法和已发表的qPCR方法分别检测采自内蒙古东部部分牛场的80份鼻拭子样品,结果显示,两种方法对样品的阳性检测率均为10%(8/80),阴性样品的检测率均为90%(72/80),二者的阳性符合率和总符合率均达100%。本研究建立的检测BPIV5的qPCR方法特异性较强、敏感性较高、重复性较好,可以用于临床样品的检测,为BPIV5的检测和流行病学调查提供了一种新的检测手段。展开更多
为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38....为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。展开更多
【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列(No.MBU87961,gi9954088)设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采...【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列(No.MBU87961,gi9954088)设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。展开更多
文摘为建立牛副流感病毒5型(BPIV5)的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究经PCR扩增BPIV5 L基因的保守片段,构建重组质粒p MD18-T-BPIV5,并经PCR、双酶切与测序鉴定正确后作为标准品,经各反应条件优化后初步建立检测BPIV5的qPCR方法。利用10倍倍比稀释的质粒标准品作为模板,利用优化的qPCR扩增,建立该方法的标准曲线,结果显示,重组质粒标准品的拷贝数与其Ct值呈良好的线性关系,相关系数为0.998,扩增效率为1.09。以BPIV5、牛肠道病毒(BEV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛诺如病毒(BNOV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)和牛冠状病毒(BCOV)的cDNA作为模板,采用该qPCR扩增,评估该方法的特异性;以10倍倍比稀释的重组质粒标准品pMD18-T-BPIV5作为模板,利用本研究建立的qPCR方法扩增,评估该方法的敏感性;以3种不同浓度的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的qPCR方法在同一时间和不同时间分别进行批内和批间重复性试验。结果显示,该方法仅能特异性扩增BPIV5,其他相关病毒均为阴性结果;对质粒标准品的检测限为6.43拷贝/μL;批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。利用该方法和已发表的qPCR方法分别检测采自内蒙古东部部分牛场的80份鼻拭子样品,结果显示,两种方法对样品的阳性检测率均为10%(8/80),阴性样品的检测率均为90%(72/80),二者的阳性符合率和总符合率均达100%。本研究建立的检测BPIV5的qPCR方法特异性较强、敏感性较高、重复性较好,可以用于临床样品的检测,为BPIV5的检测和流行病学调查提供了一种新的检测手段。
文摘为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。
文摘【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列(No.MBU87961,gi9954088)设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。
