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调控棘孢木霉几丁质酶Tachi2基因的转录因子和蛋白的互作研究
1
作者 曲珊 赵月 +2 位作者 李雅华 郑桂玲 咸洪泉 《生物技术通报》 北大核心 2025年第5期310-319,共10页
【目的】生防菌棘孢木霉(Trichoderma asperellum)TD3104产生的几丁质酶Tachi2在植物病害防治过程中发挥重要作用,47号转录因子作用于特异响应几丁质诱导的Tachi2基因启动子顺式作用元件。探究47号转录因子与一种新调控蛋白H63的互作关... 【目的】生防菌棘孢木霉(Trichoderma asperellum)TD3104产生的几丁质酶Tachi2在植物病害防治过程中发挥重要作用,47号转录因子作用于特异响应几丁质诱导的Tachi2基因启动子顺式作用元件。探究47号转录因子与一种新调控蛋白H63的互作关系,为解析几丁质诱导调控基因转录表达机制提供科学依据。【方法】利用酵母双杂交系统对棘孢木霉几丁质酶基因Tachi2中47号转录因子的候选互作蛋白H63进行体内点对点互作鉴定;采用大肠杆菌表达系统分别对H63蛋白与47号转录因子基因进行原核诱导表达,利用亲和层析技术纯化融合蛋白,通过GST pull-down实验进行体外蛋白互作检测;利用农杆菌介导的洋葱表皮细胞亚细胞定位技术和BiFC实验进一步检测细胞内蛋白的相互作用。【结果】H63蛋白与47号转录因子在酵母细胞内存在互作关系;原核表达的重组H63蛋白、47号转录因子大小分别为36 kD和18 kD,二者在体外存在互作关系;成功构建了双分子荧光互补载体,证实H63蛋白与47号转录因子在洋葱内表皮细胞中存在相互作用,并且互作发生在细胞核内。【结论】证实H63蛋白与47号转录因子在细胞内外均存在相互作用,为解析真菌几丁质酶基因的表达调控、几丁质酶在农业和生物医药领域的开发利用奠定理论基础。 展开更多
关键词 棘孢木霉 几丁质酶 转录因子 基因表达 互作蛋白 酵母双杂交 GSTPull-down 双分子荧光互补
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利用酵母双杂交筛选豌豆叶绿体镁离子螯合酶D亚基相互作用蛋白 被引量：3
2
作者 余静 罗韬 罗美中 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期864-872,共9页
植物叶绿体镁离子螯合酶是四吡咯化合物生物合成途径中合成叶绿素分支(镁分支)的第一个酶,它催化镁离子螯合到原卟啉IX中,形成镁原卟啉IX.镁离子螯合酶是1个由3个亚基H、D和I组成的多亚基酶,3个亚基均由细胞核编码,进入叶绿体发挥功能.... 植物叶绿体镁离子螯合酶是四吡咯化合物生物合成途径中合成叶绿素分支(镁分支)的第一个酶,它催化镁离子螯合到原卟啉IX中,形成镁原卟啉IX.镁离子螯合酶是1个由3个亚基H、D和I组成的多亚基酶,3个亚基均由细胞核编码,进入叶绿体发挥功能.该酶不仅控制着叶绿素的合成,其各个亚基还具有很多其它的功能:H亚基既是ABA受体,又参与叶绿体到细胞核的反向信号传导;D亚基也与叶绿体到细胞核的反向信号传导有关.本文利用酵母双杂交技术,将编码豌豆镁离子螯合酶D亚基的cDNA片段构建到诱饵载体pGBKT7中,分别用共转化的方法筛选豌豆叶片细胞核编码的均一化cDNA文库和用Mating的方法筛选豌豆叶片叶绿体编码的均一化cDNA文库,共得到121个候选克隆,其中有60个克隆共编码21个叶绿体蛋白质,19个来自于核基因编码,2个来自于叶绿体基因编码.这些候选蛋白参与叶绿素合成、卡尔文循环、叶绿体蛋白质翻译和叶绿体基因转录等多个代谢过程.酵母点对点和GST-pull down对其中的4个蛋白做了进一步的验证.这些结果将为D亚基的功能研究提供进一步的线索. 展开更多
关键词 镁离子螯合酶D亚基 酵母双杂交系统 gst-pulldown 叶绿体
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干扰素诱导蛋白Nmi与人巨细胞病毒皮层蛋白UL23相互作用区域的研究
3
作者 叶倩宸 陈业伟 +5 位作者 傅政民 李晓钿 冯琳远 杨晓苹 冉艳红 李弘剑 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期1270-1276,共7页
目的:探究干扰素诱导蛋白N-Myc相互作用因子(Nmi)与人巨细胞病毒(HCMV)皮层蛋白UL23相互作用的关键区域。方法:根据前期实验结果,分别将10个不同截短突变型的Nmi构建到原核表达载体p GEX-4T-1上,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中... 目的:探究干扰素诱导蛋白N-Myc相互作用因子(Nmi)与人巨细胞病毒(HCMV)皮层蛋白UL23相互作用的关键区域。方法:根据前期实验结果,分别将10个不同截短突变型的Nmi构建到原核表达载体p GEX-4T-1上,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,表达并纯化出带有GST标签的融合蛋白,利用GST-pulldown的方法探究Nmi与UL23相互作用的区域。根据GST-Pulldown实验结果,用同源重组的方法在真核表达载体pc DNA4-Myc上分别构建3个缺失突变型Nmi。将实验组和对照组的Nmi分别与含有Flag标签的UL23质粒共转染至He La细胞中,通过免疫共沉淀法进一步研究Nmi与UL23的相互作用区域。结果:(1)10个截短突变型Nmi与GST基因融合的原核表达载体构建成功;(2)3个缺失突变型Nmi与Myc基因融合的真核表达载体构建成功;(3)GST-pulldown实验证明Nmi与UL23相互作用位点位于Nmi上的第192~202位氨基酸区域;(4)免疫共沉淀法确认Nmi的第192~202位氨基酸区域是与UL23相互作用的区域,与GST-pulldown实验结果一致。结论:Nmi与UL23相互作用的区域位于Nmi上第192~202位氨基酸区域。这为阐明UL23帮助HCMV在宿主体内潜伏的分子机理提供了基础。 展开更多
关键词 人巨细胞病毒 N-Myc相互作用因子 gst-pulldown实验 免疫共沉淀
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人肝再生增强因子CXXC结构域与生物学活性的关系 被引量：1
4
作者 潘艳 鞠桂芝 +1 位作者 佟明华 孔祥平 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期1000-1003,共4页
目的:初步探讨人肝再生增强因子蛋白(human augmenter of liver regeneration protein,hALRp)CXXC结构域与生物学活性的关系。方法:根据酶催化反应中巯基浓度的变化,测定目的蛋白巯基氧化酶活性;采用GST-pulldown方法测定目的蛋白与GST-... 目的:初步探讨人肝再生增强因子蛋白(human augmenter of liver regeneration protein,hALRp)CXXC结构域与生物学活性的关系。方法:根据酶催化反应中巯基浓度的变化,测定目的蛋白巯基氧化酶活性;采用GST-pulldown方法测定目的蛋白与GST-Na+,K+-ATPase融和蛋白体外相互作用;用MTT法检测目的蛋白促进成人肝细胞HL-7702增殖情况;探讨hALR与hALR-C65A(hALRp的CXXC结构域突变)蛋白活性差异。结果:在巯基氧化酶活性实验中,酶活性以转换数(TN)表示,hALR组TN=1.25±0.21,而hALR-C65A组TN=0,与hALR组比较差异有显著性(P<0.05)。但hALR-C65A与GST-Na+,K+-ATPase融和蛋白体外相互作用和促进肝细胞增殖活性与hALRp比较无明显变化。结论:hALRp的CXXC结构在巯基氧化酶活性方面有重要作用,但该结构改变并不影响hALRp与Na+,K+-ATPase的相互作用和促进肝细胞增殖活性。 展开更多
关键词 人肝再生增强因子 突变体 GST结合实验
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GST pulldown技术检测HEK293T细胞Daam1的活性 被引量：1
5
作者 李卫星 杜军 朱一超 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期1412-1416,共5页
目的:运用GST pulldown技术建立真核细胞中Daam1活性检测的可靠方法。方法:构建GST-RhoA的原核表达载体,并使其在大肠杆菌BL21菌株中大量表达。用GST pulldown和Western blot技术分别检测HEK293T细胞中活化的Daam1及Daam1蛋白的表达。结... 目的:运用GST pulldown技术建立真核细胞中Daam1活性检测的可靠方法。方法:构建GST-RhoA的原核表达载体,并使其在大肠杆菌BL21菌株中大量表达。用GST pulldown和Western blot技术分别检测HEK293T细胞中活化的Daam1及Daam1蛋白的表达。结果:在成功构建了GST-RhoA的原核表达载体,并使其在原核细胞中大量表达融合蛋白GST-RhoA后,用GST pulldown和Western blot技术证实HEK293T细胞中有活化的Daam1和Daam1总蛋白的表达。结论:本工作所建立的GST pulldown技术可以检测HEK293T细胞中Daam1的活性,从而为进一步深入研究Daam1在真核细胞中的功能提供了技术保障。 展开更多
关键词 GST pulldown HEK293T Daam1 真核细胞
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hTRIP15对甲状腺激素受体功能的影响
6
作者 彭永德 曲建 +2 位作者 张新 韩泽广 陈家伦 《上海第二医科大学学报》 CSCD 北大核心 2005年第4期365-367,共3页
目的确立人甲状腺激素受体相互作用蛋白15(hTRIP15)对甲状腺激素受体(TR)功能的影响。方法应用融合蛋白、蛋白体外翻译及谷胱苷肽S转移酶“拉下”(GSTpulldown)试验研究蛋白—蛋白的相互作用,凝胶阻滞(gelshift)试验检测蛋白-DNA的结合... 目的确立人甲状腺激素受体相互作用蛋白15(hTRIP15)对甲状腺激素受体(TR)功能的影响。方法应用融合蛋白、蛋白体外翻译及谷胱苷肽S转移酶“拉下”(GSTpulldown)试验研究蛋白—蛋白的相互作用,凝胶阻滞(gelshift)试验检测蛋白-DNA的结合活性。结果经大肠杆菌表达hTRIP15融合蛋白或体外翻译TRα所显示的分子量与预测大小相吻合。hTRIP15及hTRIP15N末端均可与TRα相互作用;hTRIP15抑制TR与TR反应元件(TRE)结合,且增加hTRIP15剂量时更明显。结论提示hTRIP15作为共抑制因子调节TR对靶基因的转录,hTRIP15N端是TR结合功能域,而C端可能为调节功能域。 展开更多
关键词 人甲状腺激素受体相互作用蛋白15 甲状腺激素受体 GST pulldown试验 gel-shifl试验
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小G蛋白RhoA活性检测方法的优化 被引量：1
7
作者 曾婷 崔照盟 +3 位作者 蒋维 李增霞 党永军 余龙 《生物学杂志》 CAS CSCD 2016年第4期103-106,共4页
Rho蛋白家族的小G蛋白是调节细胞迁移的关键蛋白,具有GTP酶活性。RhoA是该蛋白家族的重要成员,通过其催化活性来调节肌动蛋白的聚集和收缩,在肿瘤迁移和侵袭中发挥重要作用。所以,RhoA的GTP酶活性检测对于研究细胞迁移的机制,以及靶向R... Rho蛋白家族的小G蛋白是调节细胞迁移的关键蛋白,具有GTP酶活性。RhoA是该蛋白家族的重要成员,通过其催化活性来调节肌动蛋白的聚集和收缩,在肿瘤迁移和侵袭中发挥重要作用。所以,RhoA的GTP酶活性检测对于研究细胞迁移的机制,以及靶向RhoA的治疗策略具有重要意义。RhoA下游效应子Rhotekin基因(RhoA effector)具有RhoA结合结构域(RhoA binding domain,RBD),该RBD蛋白结构域能与活化状态的GTP-RhoA特异结合。通常用外源表达的RBD蛋白pulldown结合GTP-RhoA的蛋白量,作为RhoA活性检测方法。但是,哺乳动物来源的RBD蛋白在原核细胞中的表达量很低,使得pulldown结合GTP-RhoA蛋白量的效率低下,从而不利于RhoA的活性检测。因此,目的在于提高RBD蛋白在大肠杆菌中的产量,提高RBD蛋白pulldown结合GTP-RhoA的效率,从而优化RhoA活性检测方法。通过密码子优化技术对RBD基因进行改良,提高其蛋白在大肠杆菌中的表达量,优化RBD蛋白pulldown实验检测GTP-RhoA的效率。优化后的RBD与GST标签蛋白融合后在大肠杆菌中高效表达,并且能够特异性地与GTP-RhoA结合。成功地构建了具有较高表达水平的GST-RBD载体,并优化了传统的GST-RBD pulldown检测体系,为进一步深入研究RhoA在细胞迁移中的功能提供了一种有效的技术手段。 展开更多
关键词 RHOA 密码子优化 GST-RBD pulldown
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去泛素酶复合体Ubp3/Bre5的制备及与Cdc48作用（英文）
8
作者 苏文成 吕操 +8 位作者 时丽丽 景晓飞 盖园明 张洁 谭焕波 王鹏举 夏立新 邹培建 秦刚 《深圳大学学报（理工版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2015年第1期58-67,共10页
泛素化是一种存在于真核细胞中与生理功能密切相关的蛋白修饰,泛素化与去泛素化处于动态调节过程中.Ubp3是与人USP10同源的酵母去泛素化酶,结合辅引子Bre5在细胞内发挥广泛作用.为研究该复合体的工作机制,制备重组蛋白复合体,在大肠杆... 泛素化是一种存在于真核细胞中与生理功能密切相关的蛋白修饰,泛素化与去泛素化处于动态调节过程中.Ubp3是与人USP10同源的酵母去泛素化酶,结合辅引子Bre5在细胞内发挥广泛作用.为研究该复合体的工作机制,制备重组蛋白复合体,在大肠杆菌中成功表达并纯化重组Ubp3与Bre5单体及Ubp3/Bre5复合体,首次成功大规模制备重组Ubp3/Bre5复合体.通过一系列pulldown实验,检验Ubp3/Bre5与AAA家族中泛素选择性ATP酶Cdc48的相互作用模式,结果发现,Ubp3及Bre5无法单独与Cdc48结合,但Ubp3/Bre5复合体可以有效与Cdc48相互作用.提出了Ubp3/Bre5-Cdc48相互作用的新模式,制备了高质量重组Ubp3/Bre5复合体.该研究为通过生化及结构生物学进行分子机制探索奠定了基础. 展开更多
关键词 结合蛋白质 Ubp3去泛素化酶 结合辅因子Bre5 ATP酶Cdc48 去泛素化复合体 与谷光苷肽巯基转移酶沉淀试验 直接相互作用
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GST Pulldown技术检测HEK293T细胞活化的Rab35
9
作者 张万秋 朱一超 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第12期1652-1655,共4页
目的:运用GST pulldown技术建立真核细胞中活化的Rab35的可靠检测方法。方法:构建GST-RUN的原核表达载体,并使其在大肠杆菌BL21中大量表达。用GST pulldown和Western blot技术分别检测HEK293T细胞中活化的Rab35及Rab35蛋白的表达。结果... 目的:运用GST pulldown技术建立真核细胞中活化的Rab35的可靠检测方法。方法:构建GST-RUN的原核表达载体,并使其在大肠杆菌BL21中大量表达。用GST pulldown和Western blot技术分别检测HEK293T细胞中活化的Rab35及Rab35蛋白的表达。结果:成功构建了GST-RUN的原核表达载体,并使其在原核细胞中大量表达融合蛋白GST-RUN,用GSTPulldown和Western blot技术证实了HEK293T细胞中有活化的Rab35和Rab35总蛋白的表达。结论:本工作所建立的GSTPulldown技术可以检测HEK293T细胞中活化的Rab35,从而为进一步深入研究Rab35在真核细胞中的功能提供了技术保障。 展开更多
关键词 GST pulldown HEK293T Rab35 真核细胞
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氯离子通道蛋白1的缺失突变体CLIC1(Δ49-51)与Sedlin蛋白相互作用的研究
10
作者 洪翠丽 金振辉 +3 位作者 朱亮亮 潘林鑫 耿慧武 刘晓颖 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2018年第11期1690-1695,共6页
目的探究胞内氯离子通道蛋白1(CLIC1)的缺失突变体CLIC1(Δ49-51)在哺乳动物细胞中的表达、定位改变,及与Sedlin蛋白在体内、体外相互作用的影响。方法构建CLIC1的缺失突变体的真核表达质粒pc DNA3. 1-CLIC1(Δ49-51)-FLAG;免疫荧光观察... 目的探究胞内氯离子通道蛋白1(CLIC1)的缺失突变体CLIC1(Δ49-51)在哺乳动物细胞中的表达、定位改变,及与Sedlin蛋白在体内、体外相互作用的影响。方法构建CLIC1的缺失突变体的真核表达质粒pc DNA3. 1-CLIC1(Δ49-51)-FLAG;免疫荧光观察CLIC1(Δ49-51)与Sedlin在COS7细胞中的共定位;在HEK 293T细胞中进行免疫共沉淀和GST pulldown实验,研究CLIC1(Δ49-51)与Sedlin的相互作用。结果 CLIC1(Δ49-51)在COS7细胞中主要定位于细胞质,小部分定位于细胞核。相对于野生型CLIC1的细胞核定位,缺失突变体的细胞内定位发生明显改变并且与Sedlin蛋白没有共定位。Western blot结果显示CLIC1(Δ49-51)能在HEK 293T细胞中有效表达;免疫共沉淀实验结果表明其与Sedlin在体内没有相互作用; GST pulldown结果表明其与Sedlin在体外没有相互作用。结论 CLIC1蛋白的第49~51位氨基酸序列KRR对CLIC1蛋白在细胞内的正确定位发挥重要作用;其缺失突变后影响了CLIC1在细胞内的定位、表达及CLIC1与Sedlin的相互作用。 展开更多
关键词 CLIC1缺失突变体 免疫荧光 免疫共沉淀 GST pulldown
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