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靶标替换消减SELEX技术筛选小鼠IgG Fc片段的DNA配基及其活性鉴定 被引量:4
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作者 陈桦 葛廷 +8 位作者 王小琦 廖世奇 马瑾 王黎 庞鑫 张宁 张丽琼 张洁瑜 王晓清 《兰州大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期66-72,共7页
建立高特异性和亲和力的小鼠IgGFc片段DNA配基筛选方法.采用几种小鼠IgG亚类(鼠抗HBV-IgG、小鼠IgG的Fc,IgG1,IgG2a)作为靶分子,利用靶标替换消减SELEX筛选方法进行16轮筛选.利用dot-blot,高压液相色谱以及凝胶阻滞(EMSA)方法对所得配... 建立高特异性和亲和力的小鼠IgGFc片段DNA配基筛选方法.采用几种小鼠IgG亚类(鼠抗HBV-IgG、小鼠IgG的Fc,IgG1,IgG2a)作为靶分子,利用靶标替换消减SELEX筛选方法进行16轮筛选.利用dot-blot,高压液相色谱以及凝胶阻滞(EMSA)方法对所得配基进行活性鉴定.经过16轮筛选,得到了与小鼠IgG不同亚类相同Fc片段特异性结合的寡核苷酸配基(IgG的Fc配基).特异性分析显示,此配基只与小鼠IgG特异性结合,与胰蛋白酶、小牛血清白蛋白、人血清均无明显结合.高压液相色谱和凝胶阻滞结果均说明了配基和靶蛋白具有特异结合.通过使用靶标替换消减SELEX技术可以有效得到小鼠IgG不同亚型相同部分Fc片段的特异性结合配基,为不同分子相同部位的分子作用机制,以及应用于小鼠抗体亲和层析的研究奠定基础. 展开更多
关键词 靶标替换 SELEX DNA配基 小鼠IgG fc片段 特异性
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人免疫球蛋白G酶解制备Fab和Fc片段及其分离纯化 被引量:8
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作者 唐思远 林东强 +1 位作者 童红飞 姚善泾 《化工学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2013年第5期1750-1756,共7页
为了制备抗体Fab和Fc片段,采用木瓜蛋白酶酶解人免疫球蛋白G(IgG),通过优化酶解条件和色谱法分离过程,得到了纯度较高的Fab片段和Fc片段。考察了酶解pH、酶加入量、添加半胱氨酸和酶解时间等对IgG酶解过程的影响,优化了酶解条件,提高酶... 为了制备抗体Fab和Fc片段,采用木瓜蛋白酶酶解人免疫球蛋白G(IgG),通过优化酶解条件和色谱法分离过程,得到了纯度较高的Fab片段和Fc片段。考察了酶解pH、酶加入量、添加半胱氨酸和酶解时间等对IgG酶解过程的影响,优化了酶解条件,提高酶解效率,IgG转化率大于98%。酶解产物通过Protein A亲和色谱法和DEAE阴离子交换色谱法进行了纯化,分离得到Fc片段和Fab片段,收率分别为72.6%和40.1%。经SEC-HPLC分析,Fc片段纯度达95.7%,Fab片段纯度达96.6%。 展开更多
关键词 人免疫球蛋白G fc片段 FAB片段 木瓜蛋白酶 亲和色谱法 离子交换色谱法
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牛免疫球蛋白G的体外人源唾液酸化及Fc片段的制备
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作者 李天慧 陈春旭 +2 位作者 陈贵杰 孙怡 曾晓雄 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2022年第2期151-157,共7页
建立将牛免疫球蛋白G(bovine immunoglobulin G,bIgG)糖链末端N-羟乙酰神经氨酸酶切并连接人源N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)的方法,在实现bIgG转化为人源IgG(human IgG,hIgG)的基础上,研究hIgG可结晶(Fc)片段的制备... 建立将牛免疫球蛋白G(bovine immunoglobulin G,bIgG)糖链末端N-羟乙酰神经氨酸酶切并连接人源N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)的方法,在实现bIgG转化为人源IgG(human IgG,hIgG)的基础上,研究hIgG可结晶(Fc)片段的制备。结果表明:以170 U/mL神经氨酸酶酶切bIgG(4.0 mg/mL)后,通过β-1,4-半乳糖基转移酶和α-2,6-唾液酸转移酶分别转移半乳糖(galactose,Gal)和Neu5Ac残基,可制备增加8.4个Gal残基和42个Neu5Ac残基的hIgG分子。此外,在10.0 mg/mL hIgG、m(木瓜蛋白酶)∶m(hIgG)=0.05、10.0 mmol/L半胱氨酸激活剂、2.0 mmol/L EDTA溶液、pH 7.0条件下,酶解3 h可制得hIgG的较高纯度Fc片段,最终hIgG得率为71.7%,Fc片段得率为20.8%。本研究为bIgG的产品开发和营养价值评价提供科学依据。 展开更多
关键词 牛免疫球蛋白G fc片段 体外糖基化 唾液酸
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小鼠IgG2b单克隆抗体Fab、Fc和Fab/c片段的制备和纯化(文摘)
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作者 DenignotS. 刘建军 赵洪礼 《单克隆抗体通讯》 CSCD 1989年第4期29-29,共1页
本文报道了用小鼠IgG2b单克隆抗体制备和纯化Fab、Fc和Fab/c片段。由于IgG2b抗体具有对蛋白酶敏感的特性,用胃蛋白酶在酶与抗体之比为1:30,pH4.8的条件下消化抗体.可获得的Fab/c片段产量高达30%。消化液经DEAE—纤维素初步层析... 本文报道了用小鼠IgG2b单克隆抗体制备和纯化Fab、Fc和Fab/c片段。由于IgG2b抗体具有对蛋白酶敏感的特性,用胃蛋白酶在酶与抗体之比为1:30,pH4.8的条件下消化抗体.可获得的Fab/c片段产量高达30%。消化液经DEAE—纤维素初步层析,可以含有Fc片段的混合液中分离出Fab片段。 展开更多
关键词 IgG2b B/C 单克隆抗体 小鼠 纯化 文摘 FAB片段 抗体制备 胃蛋白酶 DEAE fc片段 B抗体 纤维素 消化液 混合液
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抗癌胚抗原纳米抗体与人Fc融合蛋白在毕赤酵母和HEK293细胞中的表达、纯化和性质比较 被引量:1
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作者 郭万美 陈玉娟 +6 位作者 周宇杭 陈泉 李飞 咸漠 冯东晓 年锐 宋海鹏 《科学技术与工程》 北大核心 2018年第21期30-35,共6页
通过对不同系统表达的肿瘤标记物癌胚抗原(CEA)纳米抗体与人Fc融合蛋白(11C12-Fc)的表达、纯化及抗体性质等的比较分析,比较不同表达系统的特点及其对融合抗体性质的影响;从而为CEA融合纳米抗体在体内检测方面的应用提供理论依据。构建... 通过对不同系统表达的肿瘤标记物癌胚抗原(CEA)纳米抗体与人Fc融合蛋白(11C12-Fc)的表达、纯化及抗体性质等的比较分析,比较不同表达系统的特点及其对融合抗体性质的影响;从而为CEA融合纳米抗体在体内检测方面的应用提供理论依据。构建两种11C12-Fc表达系统(Pichia pastoris和HEK293)相应的表达载体和菌株,分别进行诱导表达、分离纯化;并对其纯化产物的生物学活性等进行初步研究。成功构建了毕赤酵母、HEK293细胞两种CEA纳米抗体融合蛋白(11C12-Fc)表达系统并实现11C12-Fc的胞外分泌表达;通过protein A柱及阴离子交换层析纯化,获得了较高纯度和浓度的11C12-Fc样品;通过突变糖基化位点的方式有效去除了毕赤酵母表达11C12的过度糖基化作用;并且其抗体亲和力较突变前未发生明显改变,与HEK293细胞表达的11C12-Fc都表现出较高的亲和力。毕赤酵母和HEK293系统均能够表达具有较高生物活性的11C12-Fc,后续的科研或生产可根据实际需要和条件来合理选择表达系统。为后续的纳米抗体融合蛋白规模化生产、体内诊断与靶向治疗的应用提供了理论和技术参考。 展开更多
关键词 癌胚抗原 纳米抗体 fc片段 融合蛋白 毕赤酵母 HEK293
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免疫复合物抑制B淋巴细胞内Toll样受体9激活的JNK和p38通路 被引量:3
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作者 钱莉 董改琴 +5 位作者 吴梦芸 荣于馨 陈文艳 刘阳 叶枫 刘露 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期182-187,共6页
目的考察B淋巴细胞内免疫复合物(IC)对Toll样受体9(TLR9)激动剂Cp G寡脱氧核苷酸(ODN)诱导的CD40和CD80高表达信号通路的抑制作用。方法给小鼠腹腔注射Cp G ODN和IC后,用免疫磁珠法分选小鼠脾脏CD19+B淋巴细胞,流式细胞术检测B淋巴细胞... 目的考察B淋巴细胞内免疫复合物(IC)对Toll样受体9(TLR9)激动剂Cp G寡脱氧核苷酸(ODN)诱导的CD40和CD80高表达信号通路的抑制作用。方法给小鼠腹腔注射Cp G ODN和IC后,用免疫磁珠法分选小鼠脾脏CD19+B淋巴细胞,流式细胞术检测B淋巴细胞表面CD40和CD80的表达。免疫磁珠法分选野生型和免疫球蛋白G Fcγ段受体Ⅱb(FcγRⅡb)缺陷小鼠脾脏B淋巴细胞,体外用Cp G ODN和(或)IC刺激后,蛋白质印迹法检测细胞内相关蛋白激酶的磷酸化水平。用JNK抑制剂(SP600125,50μmol/L)和p38抑制剂(SB203580,20 mg/L)处理后,流式细胞术检测Cp G ODN活化B淋巴细胞表面CD40和CD80的表达。结果体内实验结果显示,IC抑制Cp G ODN活化B淋巴细胞表面CD40和CD80的表达(P均<0.05)。IC抑制B淋巴细胞内Cp G ODN诱导的JNK和p38磷酸化水平,但不能抑制FcγRⅡb缺陷小鼠B淋巴细胞JNK和p38的磷酸化水平。SP600125和SB203580处理后,Cp G ODN活化B淋巴细胞表面CD40和CD80的表达均下调(P均<0.01)。结论 B淋巴细胞内IC通过抑制JNK和p38通路抑制TLR9激动剂Cp G ODN诱导的CD40和CD80表达。 展开更多
关键词 免疫复合物 TOLL样受体 fc片段 B淋巴细胞 分化群
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人源抗Met基因工程抗体scFv的改造与特性分析
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作者 熊林 张爱霞 +4 位作者 李芸茜 张大为 曹伯良 朱进 唐荣才 《南京医科大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期605-608,617,共5页
目的:将已制备的抗Met单链抗体基因与人IgGFc基因片段融合,表达有活性的融合蛋白分子,以增强单链抗体的可溶性。方法:从人淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增并制备人IgG的Fc基因片段,并克隆于已构建好的pBAD-scFv原核表达载体中,转化大肠... 目的:将已制备的抗Met单链抗体基因与人IgGFc基因片段融合,表达有活性的融合蛋白分子,以增强单链抗体的可溶性。方法:从人淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增并制备人IgG的Fc基因片段,并克隆于已构建好的pBAD-scFv原核表达载体中,转化大肠杆菌Top10,经阿拉伯糖诱导表达融合蛋白scFv-Fc。所表达的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDS-PAGE、Westernblot分析鉴定,并用ELISA检测抗体效价。结果:序列分析表明重组质粒pBAD-scFv-Fc基因序列正确;SDS-PAGE分析表明,scFv-Fc融合蛋白分子量为60ku,且为可溶性蛋白;该蛋白经过His亲和层析纯化、ELISA检测,结果表明,该融合蛋白能够与抗原分子Met特异性结合。结论:改造后的抗体融合蛋白scFv-Fc能与人Met特异性结合,增加了抗体蛋白溶解度,有利于抗体的大量制备。 展开更多
关键词 MET 基因工程抗体 融合蛋白 fc片段
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