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变性高效液相色谱技术定量检测急性髓细胞白血病FLT3基因内部串联重复突变方法学的建立 被引量：4
1
作者 陈建兰 李庆山 +7 位作者 王汉平 应逸 杜庆华 许艳丽 陈晓燕 谢健晋 毛平 李志鹏 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期1852-1856,共5页
目的:建立一种应用变性高效液相色谱技术(DHPLC)相对定量检测急性髓细胞白血病(AML)患者Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)基因的内部串联重复(ITD)突变的方法。方法:根据FLT3-ITD突变基因多位于14外显子而设计引物,用聚合酶链反应(PCR)方法特异... 目的:建立一种应用变性高效液相色谱技术(DHPLC)相对定量检测急性髓细胞白血病(AML)患者Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)基因的内部串联重复(ITD)突变的方法。方法:根据FLT3-ITD突变基因多位于14外显子而设计引物,用聚合酶链反应(PCR)方法特异性扩增121例AML患者FLT3-ITD突变基因,再用DH-PLC技术相对定量检测FLT3-ITD等位基因突变的情况;与毛细管电泳法(CE)检测突变的结果对比进行该方法的有效性检验;最后与121例样品PCR扩增产物的测序结果进行对比。结果:经DHPLC分析后均能得到特征性的洗脱峰。121例样本中检测到FLT3-ITD突变阳性的样本13例,总阳性率为10.7%,阳性突变等位基因的比例不一,分布范围中位数为34.5%(11.4%-80.2%),为21-87 bp单个插入片段。阳性率和突变比例与CE方法检测结果相比较均无显著差异(P>0.05),并与121例样本FLT3-ITD扩增PCR产物基因测序结果一致。结论:成功建立了一种应用DHPLC相对定量检测AML患者FLT3-ITD基因突变的方法。 展开更多
关键词 变性高效液相色谱 白血病 髓样 急性 fms样酪氨酸激酶3 内部串联重复 基因
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去泛素化酶UCHL3维持FLT3-ITD阳性急性髓性白血病细胞存活的功能研究 被引量：1
2
作者 胡家诚 朱倩 +2 位作者 王佳琦 吴英理 雷虎 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期1383-1393,共11页
目的·探究FMS样的酪氨酸激酶3 (FMS-like tyrosine kinase 3,FLT3)近膜区的内部串联重复(FLT3-ITD)阳性急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞中存在表达差异的去泛素化酶及其对FLT3-ITD阳性AML细胞功能的影响。方法... 目的·探究FMS样的酪氨酸激酶3 (FMS-like tyrosine kinase 3,FLT3)近膜区的内部串联重复(FLT3-ITD)阳性急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞中存在表达差异的去泛素化酶及其对FLT3-ITD阳性AML细胞功能的影响。方法·采用Western blotting检测外源性导入FLT3-ITD质粒和使用FLT3-ITD抑制剂对部分去泛素化酶蛋白表达量的影响;利用癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)公共数据库分析泛素羧基末端水解酶L3 (ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L3,UCHL3)在FLT3-ITD阳性患者中的表达情况及与AML患者预后的相关性;利用短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)技术在FLT3-ITD阳性AML细胞系中敲低所筛选出的去泛素化酶;采用细胞计数、CCK-8法、流式细胞术、瑞氏染色检测所筛选出的去泛素化酶对AML细胞功能的影响以及敲低相应的去泛素化酶或使用其抑制剂与全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)的合加效应。结果·Ba/F3细胞中表达FLT3-ITD后能够显著诱导UCHL3的表达,而在FLT3-ITD阳性的MOLM-13和MV4-11细胞系中抑制FLT3-ITD的活性后能够显著抑制UCHL3的表达,该抑制作用具有时间和浓度依赖性。利用数据库分析发现FLT3的表达与UCHL3的表达量在AML中具有显著正相关性(P=0.000),并且UCHL3表达量与AML患者生存率存在显著负相关性(P=0.016)。敲低UCHL3对FLT3-ITD阳性AML细胞有抑制增殖和促进凋亡的作用,且敲低UCHL3后细胞核型发生显著改变,分化相关转录因子PU.1和C/EBPβ表达显著升高。UCHL3敲低显著增强了100 nmol/L ATRA诱导的MOLM-13和MV4-11细胞凋亡,并且相应的凋亡相关蛋白PARP1、caspase 9和caspase 3均发生明显剪切。同时,敲低UCHL3的细胞在ATRA处理后出现更多核体积变小、核凹陷、呈杆状或不规则状的细胞特征。ATRA与UCHL3抑制剂TCID合加的量效反应曲线表明,TCID与ATRA协同能够抑制MOLM-13和MV4-11细胞活率。结论·FLT3-ITD上调UCHL3促进AML细胞的存活,UCHL3与AML患者预后负相关;敲低或抑制UCHL3协同ATRA能够抑制FLT3-ITD阳性AML细胞的存活。 展开更多
关键词 泛素羧基末端水解酶L3 急性髓系白血病 fms样的酪氨酸激酶3 fms样的酪氨酸激酶3近膜区的内部串联重复 全反式维甲酸
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FLT3-ITD-mt和FLT3-ITD-wt初治原发AML患者外周血象和DNMT3A基因突变的临床特征对比 被引量：3
3
作者 李敬东 韩效林 +1 位作者 杨翠 李昂 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1820-1824,共5页
目的:比较初治原发急性髓系白血病(AML)FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)-内部串联重复野生型(ITD-wt)与突变型(FLT3-ITD-mt)患者临床特征的差异。方法:收集并回顾性研究本院2016年1月至2018年12月收治的108例初治原发AML患者的临床资料,根据是... 目的:比较初治原发急性髓系白血病(AML)FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)-内部串联重复野生型(ITD-wt)与突变型(FLT3-ITD-mt)患者临床特征的差异。方法:收集并回顾性研究本院2016年1月至2018年12月收治的108例初治原发AML患者的临床资料,根据是否伴有FLT3-ITD基因突变分为2组:A组(FLT3-ITD-wt)84例,B组(FLT3-ITD-mt)24例。对2组患者均行细胞形态学、分子生物学及免疫学分型检查,比较2组患者外周血红细胞数(RBC)、血红蛋白(Hb)水平、血小板数(Plt)、白细胞数(WBC)等血常规检查,骨髓原始细胞比例,FAB分型结果,融合基因分析及基因突变的发生情况等差异。结果:B组外周血Hb和RBC水平相比A组明显下降(P<0.05),WBC计数明显升高(P<0.01);而2组患者外周血Plt计数和骨髓原始细胞比例则无明显差异(P>0.05)。2组患者FAB分型结果无明显差异(P>0.05)。MLL-ELL、CBFβ-MYH11、PML-RARA及AML-ETO是初治原发AML患者的常见融合基因,而2组患者常见融合基因占比无明显差异(P>0.05)。本组108例患者共检出27种基因突变(包括FLT3-ITD在内);B组DNMT3A基因突变检出率相比A组明显升高(P<0.05);而2组其它基因突变检出率无明显差异(P>0.05)。结论:FLT3-ITD-wt与FLT3-ITD-mt初治原发AML患者临床特征存在一定差异;与FLT3-ITD-wt比较,FLT3-ITD-mt的初治原发AML患者外周血Hb与RBC较低,而外周血WBC较高,且DNMT3A基因突变较多见。 展开更多
关键词 急性髓系白血病 基因突变 fms样酪氨酸激酶3 内部串联重复
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稳定表达FLT3-ITD/FIV载体的急性髓细胞白血病细胞株的构建及鉴定 被引量：1
4
作者 陈姣 王晓冬 贾永前 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期727-732,共6页
构建稳定表达FLT3-ITD/FIV载体的急性髓细胞白血病细胞(AML)株,为研究FLT3-ITD在急性髓细胞白血病中的作用和以FLIT3为靶点的治疗提供一种新的体外模型。筛选临床上FLT3-ITD突变的AML患者,选取mutant/wt比值最高的FLT3-ITD突变作为克隆... 构建稳定表达FLT3-ITD/FIV载体的急性髓细胞白血病细胞(AML)株,为研究FLT3-ITD在急性髓细胞白血病中的作用和以FLIT3为靶点的治疗提供一种新的体外模型。筛选临床上FLT3-ITD突变的AML患者,选取mutant/wt比值最高的FLT3-ITD突变作为克隆对象,PCR扩增FLT3基因全长。然后通过同源重组的方法构建FLT3-ITD/FIV慢病毒载体并包病毒,收集病毒液上清液进行K562白血病细胞株感染,通过流式细胞分选术筛选阳性转染细胞。收集阳性转染细胞做Western blot验证阳性质粒的表达情况。207名AML患者中有42例FLT3-ITD突变,成功扩增出了mutant/wt比值最高的FLT3-ITD突变患者的FLT3基因全长。双酶切FIV载体和模板DNA,连接以及感受态细胞转化筛选出阳性重组子,双酶切鉴定和测序结果验证。慢病毒成功感染K562白血病细胞株,用流式细胞分选术筛选出了稳定感染的细胞,且该细胞可以传代、扩增。同时,稳定感染细胞的Western blot鉴定也证实了阳性质粒的表达情况。通过筛选FLT3-ITD突变的AML患者,成功构建了稳定表达FLT3-ITD/FIV载体的白血病细胞株,为研究FLT3-ITD在AML发病中的作用以及针对FLT3-ITD为靶点的药物筛选治疗等提供了一个稳定的体外细胞模型。 展开更多
关键词 急性髓细胞白血病(AML) fms样酪氨酸激酶-3 内部串联重复 细胞株
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FLT3及FLT3-ITD突变体在HEK293T细胞的表达和纯化
5
作者 杨凡 杜佳慧 +7 位作者 吴洁 袁濮玉 苏倩 撖荣 邱桥成 薛胜利 刘松柏 孙中文 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第3期242-246,共5页
目的构建fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)及FLT3-内部串联重复序列(FLT3-ITD)突变体的真核表达载体,在HEK293T细胞中稳定表达并通过免疫沉淀技术对蛋白进行纯化。方法从正常人及FLT3-ITD阳性急性髓系白血病患者骨髓干细胞中提取RNA,反转录为cD... 目的构建fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)及FLT3-内部串联重复序列(FLT3-ITD)突变体的真核表达载体,在HEK293T细胞中稳定表达并通过免疫沉淀技术对蛋白进行纯化。方法从正常人及FLT3-ITD阳性急性髓系白血病患者骨髓干细胞中提取RNA,反转录为cDNA,使用带有流感病毒血凝素(HA)标签序列的特异性引物,采用PCR扩增出人FLT3及FLT3-ITD突变体编码区全长并克隆到CD530A-T2A-GFP载体上。重组的FLT3及突变体FLT3-ITD表达质粒,通过脂质体polyJ et转染到HEK293T细胞进行表达。使用HA抗体结合微珠沉淀带HA标签的FLT3及FLT3-ITD突变体蛋白。然后,通过HA肽段将蛋白竞争洗脱下来,洗脱下来的蛋白经银染染色。结果 FLT3及FLT3-ITD突变体全长编码序列成功构建到CD530A-T2A-GFP载体上,Western blot法及聚丙烯酰胺凝胶银染法成功检测到FLT3及FLT3-ITD突变体蛋白的表达、纯化。结论在HEK293T细胞中成功表达并纯化FLT3及FLT3-ITD突变体蛋白。 展开更多
关键词 fms样的酪氨酸激酶3 突变体 蛋白纯化 fms样的酪氨酸激酶3-内部串联重复
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FLT3-ITD基因突变型和野生型初治原发急性髓细胞白血病的临床特征 被引量：4
6
作者 姜艳红 盛家和 +1 位作者 许青霞 陈光意 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2017年第23期3975-3979,共5页
目的分析FMS样酪氨酸激酶3-内部串联重复突变型(FLT3-ITDmt)和野生型(FLT3-ITD-wt)初治原发急性髓系白血病(AML)患者临床特征的差异。方法回顾性分析2015年1月至2016年12月河南省肿瘤医院血液科144例初治原发AML住院患者的临床资料,按... 目的分析FMS样酪氨酸激酶3-内部串联重复突变型(FLT3-ITDmt)和野生型(FLT3-ITD-wt)初治原发急性髓系白血病(AML)患者临床特征的差异。方法回顾性分析2015年1月至2016年12月河南省肿瘤医院血液科144例初治原发AML住院患者的临床资料,按是否有FLT3-ITD突变分组,其中FLT3-ITDmt组31例,FLT3-ITDwt组113例,根据临床特征数据的类型,分别采用t检验、秩和检验或卡方检验比较两组临床特征的差异。结果 FLT3-ITDmt组外周血WBC、RBC、HGB和DNMT3A基因突变与FLT3-ITDwt组比较,差异均有统计学意义(统计值分别为:705.000;-2.535;-2.290;5.715,均P<0.05)。结论相对于FLT3-ITDwt初治原发AML患者,FLT3-ITDmt初治原发AML患者有较高的外周血WBC,较低的RBC和HGB,更易伴DNMT3A基因突变。 展开更多
关键词 fms样酪氨酸激酶3 内部串联重复 基因突变 急性髓系白血病 临床特征
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紫草素对人白血病MV4-11细胞的增殖抑制和促凋亡作用 被引量：5
7
作者 苏龙 张云蔚 +3 位作者 王卓 宋飞 秦田雪 高素君 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期96-101,共6页
目的:探讨紫草素对FMS样酪氨酸激酶3受体基因内部串联重复序列(FLT3-ITD)突变急性髓系白血病(AML)MV4-11细胞的增殖抑制和促凋亡作用,并初步阐明其分子机制。方法:生长状态良好的MV4-11细胞分为二甲基亚砜(DMSO)组和不同浓度(0.5、1.0、... 目的:探讨紫草素对FMS样酪氨酸激酶3受体基因内部串联重复序列(FLT3-ITD)突变急性髓系白血病(AML)MV4-11细胞的增殖抑制和促凋亡作用,并初步阐明其分子机制。方法:生长状态良好的MV4-11细胞分为二甲基亚砜(DMSO)组和不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0和8.0μmol·L-1)紫草素组,处理细胞24和48 h,采用CCK-8法检测各组细胞增殖抑制率,并计算半数抑制浓度(IC 50)。MV4-11细胞分为空白对照组、DMSO组和不同浓度(0.25、0.50和1.00μmol·L-1)紫草素组,处理细胞48和72 h,采用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)标记法检测各组细胞增殖率。MV4-11细胞分为DMSO组和不同浓度(0.702、1.404和2.808μmol·L-1)紫草素组,处理细胞48 h,采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。MV4-11细胞分为DMSO组和不同浓度(0.351、0.702和1.404μmol·L-1)紫草素组,处理细胞48 h,Real-time PCR法检测各组细胞中微小RNA-155(miR-155)的表达水平。结果:CCK-8法和CFSE法检测,与DMSO组比较,不同浓度紫草素组细胞增殖抑制率明显升高(P<0.05或P<0.01),增殖率明显降低(P<0.05),且呈剂量依赖性;24和48 h时IC 50分别为1.743和1.404μmol·L-1。流式细胞术检测,与DMSO组比较,不同浓度紫草素组细胞凋亡率明显升高(P<0.01),且呈剂量依赖性。Real-time PCR法检测,与DMSO组比较,不同浓度紫草素组细胞中miR-155表达水平明显降低(P<0.01),1.404μmol·L-1紫草素组细胞中miR-155表达水平降低超过75%。结论:紫草素对人FLT3-ITD突变AML MV4-11细胞具有增殖抑制和促凋亡作用,并可下调miR-155表达,提示紫草素可能作为FLT3-ITD突变AML的潜在治疗药物之一。 展开更多
关键词 急性髓系白血病 fms样酪氨酸激酶3受体基因内部串联重复序列 基因突变 紫草素 微小RNA-155
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