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不同厂家来源的新生牛血清对BHK-21细胞培养及FMDV增殖效果的研究
1
作者 申晓丽 刘原子 +4 位作者 闫鑫 李建明 李玲 杨文欣 赵磊 《畜牧兽医科技信息》 2025年第4期63-67,共5页
为了对比不同厂家来源新生牛血清对BHK-21细胞培养、以培养的BHK-21细胞增殖口蹄疫病毒(FMDV)的效果,以及同一厂家来源的不同批次血清间的差异,本实验选择不同厂家、同一厂家不同批次新生牛血清按照我公司《新生牛血清质量标准》进行检... 为了对比不同厂家来源新生牛血清对BHK-21细胞培养、以培养的BHK-21细胞增殖口蹄疫病毒(FMDV)的效果,以及同一厂家来源的不同批次血清间的差异,本实验选择不同厂家、同一厂家不同批次新生牛血清按照我公司《新生牛血清质量标准》进行检验,将合格的血清用于BHK-21贴壁细胞培养,通过细胞形态观察、细胞密度、增殖倍数等指标来评价各厂家、各批次血清对细胞生长的作用。以培养的BHK-21细胞接种FMDV,通过比较病变产生时间、TCID50、146S含量等指标评价血清对BHK-21细胞培养及FMDV增殖的影响。结果表明:A厂家的T-02、T-03、C厂家的T-08检验结果不符合我公司的《新生牛血清质量标准》;以检验结果合格批次的血清进行细胞连续传代培养,所有批次新生牛血清均有较好的促细胞生长的作用:其中,以B厂家的T-04和C厂家的T-09血清培养的细胞形态及细胞倍增数为最佳;对应试验组的细胞接种FMDV后,以B厂家的T-06和C厂家的T-06血清增殖病毒滴度最高;146S含量检测结果为C厂家的T-07显著高于其他试验组。不同厂家的新生牛血清存在差异,同一厂家的不同批次之间也存在差异,新生牛血清在使用时需要先对其进行血清质量检验,检验合格后,还需对血清进行细胞适应性培养后方可用于生产。 展开更多
关键词 新生牛血清 BHK-21细胞 fmdv
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用大肠杆菌表达FMDV NSP3ABC鉴别感染与注苗动物ELISA方法的建立 被引量：15
2
作者 曹轶梅 卢曾军 +1 位作者 刘在新 谢庆阁 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期381-386,共6页
用大肠杆菌表达的FMDV NSP3ABC经纯化复性后作为抗原,建立了鉴别感染动物与注苗动物的间接ELISA方法。用该方法检测了大量的牛血清样品,确定了3ABC-I-ELISA判定标准。3ABC-I-ELISA以(OD样品-OD阴性)÷(OD阳性-OD阴性)来计算待测样... 用大肠杆菌表达的FMDV NSP3ABC经纯化复性后作为抗原,建立了鉴别感染动物与注苗动物的间接ELISA方法。用该方法检测了大量的牛血清样品,确定了3ABC-I-ELISA判定标准。3ABC-I-ELISA以(OD样品-OD阴性)÷(OD阳性-OD阴性)来计算待测样品效价。当效价小于012为阴性,介于012～013之间为可疑,大于013为阳性。根据此判定标准所测试验感染动物血清都为阳性,敏感性达100%;97.06%疫苗注射动物血清为阴性;98.39%的非免疫健康牛(未感染也未注射疫苗牛)血清为阴性。研究证实感染牛在1年以后仍能检测到3ABC抗体。这说明3ABC-I-ELISA能够鉴别FMDV感染动物和注苗动物,可作为大面积疫情监测的方法应用。 展开更多
关键词 大肠杆菌表达 鉴别 间接ELISA方法 fmdv 感染动物 判定标准 动物血清 血清样品 疫苗注射 注射疫苗 方法应用 疫情监测 阳性 敏感性 健康牛 检测 效价 抗原 后作 免疫 抗体
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重组伪狂犬病病毒TK^-/FMDV VP1的构建 被引量：3
3
作者 卜春玲 罗满林 +2 位作者 刘镇明 黄毓茂 贺东生 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期241-244,269,共5页
以伪狂犬病病毒 (PRV)为载体表达其他病原体抗原蛋白是伪狂犬病疫苗研究的一个重要方向。本文以广东地方分离株 (以下简称YA)为亲本株 ,用PCR方法得到同源左右臂 ,然后将重组转移载体和PRVYA的基因组共转染 ,用BUDR筛选出了表达口蹄疫病... 以伪狂犬病病毒 (PRV)为载体表达其他病原体抗原蛋白是伪狂犬病疫苗研究的一个重要方向。本文以广东地方分离株 (以下简称YA)为亲本株 ,用PCR方法得到同源左右臂 ,然后将重组转移载体和PRVYA的基因组共转染 ,用BUDR筛选出了表达口蹄疫病毒 (Foot_and_MouthDiseaseVirus ,FMDV)结构蛋白VP1的TK_重组病毒 ,用PCR和SDS -PAGE的方法对VP1蛋白进行了初步鉴定 。 展开更多
关键词 重组伪狂犬病病毒 TK基因缺失疫苗 fmdv VP1
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Asia 1型FMDV感染BHK-21细胞差异蛋白质点2-DE分析 被引量：4
4
作者 刘永杰 张克山 +5 位作者 尚佑军 郭建宏 郑海学 田宏 卢国栋 刘湘涛 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期145-149,共5页
为研究Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)感染BHK-21细胞后蛋白质组的变化及差异,将FMDV接种于培养的单层BHK-21细胞,同时设未接毒的BHK-21细胞作对照组。待细胞病变后分别提取2组细胞总蛋白借助2-DE技术及PDQuest8.0软件进行细胞蛋白质组二维... 为研究Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)感染BHK-21细胞后蛋白质组的变化及差异,将FMDV接种于培养的单层BHK-21细胞,同时设未接毒的BHK-21细胞作对照组。待细胞病变后分别提取2组细胞总蛋白借助2-DE技术及PDQuest8.0软件进行细胞蛋白质组二维电泳图谱差异性分析。结果显示感染组有1 457个可见蛋白质点,而对照组可见的蛋白质点为1 427个。感染组蛋白点的表达量与对照组相比,二者具有统计学差异(P<0.05)的蛋白质点472个,其中表达上调251个点,表达下调221个点,新合成蛋白点30个。结果表明FMDV感染BHK-21细胞后引起了细胞蛋白质组表达模式的改变,这种变化是病毒与细胞相互作用的结果。本研究首次利用蛋白质组学技术研究Asia 1型FMDV感染BHK-21细胞后蛋白质组学差异,有助于深入研究Asia 1型FMDV和BHK-21细胞相互作用的分子机制。 展开更多
关键词 Asia1型fmdv BHK-21细胞 感染 差异蛋白质组
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共表达FMDV P1-2A和3C重组鸡痘病毒疫苗与核酸疫苗的实验免疫研究 被引量：4
5
作者 张洪勇 金宁一 +4 位作者 葛淑敏 尹革芬 郑敏 李子健 江文正 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 2004年第8期20-23,共4页
将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因分别插入到鸡痘病毒表达载体质粒pUTA-16Lac Z的复合启动子和单一启动子的下游，构建共表达重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL3CP1，与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞，经RT-PCR、... 将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因分别插入到鸡痘病毒表达载体质粒pUTA-16Lac Z的复合启动子和单一启动子的下游，构建共表达重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL3CP1，与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞，经RT-PCR、IFA及Western blotting检测，成功获得能正确表达目的蛋白的重组鸡痘病毒株vU-TAL3CP1。并与FMDV重组核酸疫苗免疫小鼠实验表明，各实验免疫组均能诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫反应，其中以重组鸡痘病毒与核酸疫苗联合免疫效果好于其它实验各组。 展开更多
关键词 fmdv 重组鸡痘病毒疫苗 重组核酸疫苗 免疫原性 口蹄疫病毒
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猪O型FMDV抗体检测试纸条与ELISA对比试验 被引量：3
6
作者 杨继飞 杨苏珍 +7 位作者 焦海燕 邓瑞广 杨艳艳 赵东 邢广旭 柴书军 李学伍 张改平 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2010年第4期112-115,共4页
为初步评价研制的猪O型FMDV抗体检测试纸条的性能,检测了免疫FMDV多肽疫苗20 d后制备的猪血清(143份),并对比FMDV VP1抗体检测ELISA试剂盒的检测结果。结果显示,二者的符合率为100%。猪O型FMDV抗体检测试纸条特异、敏感、快速、简便,具... 为初步评价研制的猪O型FMDV抗体检测试纸条的性能,检测了免疫FMDV多肽疫苗20 d后制备的猪血清(143份),并对比FMDV VP1抗体检测ELISA试剂盒的检测结果。结果显示,二者的符合率为100%。猪O型FMDV抗体检测试纸条特异、敏感、快速、简便,具有广阔的推广应用前景。 展开更多
关键词 fmdv 试纸条 ELISA 抗体
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含O型FMDVP1-2A、3C基因和EGFP基因表达盒的构建 被引量：2
7
作者 王建科 吴国华 +6 位作者 叶奕优 颜新敏 朱海霞 李健 朱彩珠 张强 王雯慧 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期15-20,共6页
采用RT-PCR方法分别扩增口蹄疫病毒O/China99毒株的P1-2A和3C基因,将P1-2A基因连接到pUC119载体,3C基因连接到pMD18-T载体,分别得到重组载体pUC119-P1-2A和pMD18-T-3C;将重组载体pUC119-P1-2A用HindⅢ、BamHⅠ酶切,重组载体pMD18-T-3C用... 采用RT-PCR方法分别扩增口蹄疫病毒O/China99毒株的P1-2A和3C基因,将P1-2A基因连接到pUC119载体,3C基因连接到pMD18-T载体,分别得到重组载体pUC119-P1-2A和pMD18-T-3C;将重组载体pUC119-P1-2A用HindⅢ、BamHⅠ酶切,重组载体pMD18-T-3C用BamHⅠ、NheⅠ酶切;利用酶切所得到的基因片段P1-2A、3C有共同的BamHⅠ酶切位点,实现基因P1-2A、3C的连接,构建重组载体pMD18-T-P1-2A-3C.将基因P1-2A-3C与启动EGFP表达的双向串连痘苗病毒启动子P7.5相连,构建载体p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C,并进行PCR扩增、酶切鉴定及序列测定.结果表明:试验成功构建了一侧启动表达P1-2A-3C基因,一侧启动表达标记基因EGFP的表达盒p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C. 展开更多
关键词 fmdv 启动子P7 5 P1—2A基因 3C基因
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用原位杂交对BHK-21细胞中的FMDV定位和检测 被引量：1
8
作者 邵军军 常惠芸 +3 位作者 林彤 丛国正 独军政 谢庆阁 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第11期1170-1173,共4页
为了明确FMDV在细胞内的增殖部位,建立检测细胞内低拷贝FMDV的方法,对试验接种FMDV O/Akesu/58(107TCID50)毒株的BHK-21细胞中2～10 h不同时间段的病毒RNA进行检测和定位.选用FMDVRNA非结构蛋白区3D保守序列作为寡核苷酸探针,采用尾段... 为了明确FMDV在细胞内的增殖部位,建立检测细胞内低拷贝FMDV的方法,对试验接种FMDV O/Akesu/58(107TCID50)毒株的BHK-21细胞中2～10 h不同时间段的病毒RNA进行检测和定位.选用FMDVRNA非结构蛋白区3D保守序列作为寡核苷酸探针,采用尾段标记法以地高辛-11-dUTP标记,用原位杂交敏感加强型试剂盒检测杂交体.结果显示,从感染FMDV后2～10 h内的BHK-21细胞中检测出阳性染色的病毒粒子,这些病毒粒子大多集中在核周围,随感染时间延长阳性染色信号增强.这说明用寡核苷酸探针与敏感加强型试剂盒结合对检测细胞内低拷贝的病毒粒子是可行的,同时也从分子水平上证明FMDV主要在细胞质中进行复制和繁殖. 展开更多
关键词 原位杂交 fmdv 探针 BHK-21
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基于免疫层析试纸的猪O型FMDV抗体水平监测 被引量：1
9
作者 卢清侠 杨继飞 +5 位作者 金前跃 杨苏珍 柴书军 万博 郝慧芳 张改平 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期558-561,567,共5页
为了应用免疫层析试纸评价猪口蹄疫O型合成肽疫苗的免疫效果,对50头试验仔猪进行免疫注射,并在首次免疫后28 d及2次免疫后20 d采血,通过试纸定量测定结果来监测试验猪抗体水平变化,同时对比猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试... 为了应用免疫层析试纸评价猪口蹄疫O型合成肽疫苗的免疫效果,对50头试验仔猪进行免疫注射,并在首次免疫后28 d及2次免疫后20 d采血,通过试纸定量测定结果来监测试验猪抗体水平变化,同时对比猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒的检测结果.结果表明,猪口蹄疫O型合成肽疫苗能快速诱导产生高水平的抗体,首次免疫抗体阳性率达88%,2次免疫抗体阳性率高达100%.试纸定量测定结果表明,2次免疫后猪群免疫抗体水平整体显著提升,并保持在较高水平.与ELISA试剂盒比较二者具有相同的敏感性和特异性,符合率为100%. 展开更多
关键词 fmdv 免疫抗体水平 免疫层析试纸 定量测定 ELISA
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用原位RT-PCR对BHK-21细胞中的FMDV检测和定位 被引量：1
10
作者 邵军军 常惠芸 +3 位作者 林彤 丛国正 独军政 谢庆阁 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第12期1086-1088,共3页
目的为了明确FMDV在BHK-21细胞中的复制和增殖部位,建立原位检测FMDV的方法。方法以地高辛标记的寡核苷酸作为探针,用间接原位RT-PCR技术对实验接种FMDV的BHK-21细胞中的FMDV RNA进行检测和定位。结果在接毒细胞的细胞质中有大量强阳性... 目的为了明确FMDV在BHK-21细胞中的复制和增殖部位,建立原位检测FMDV的方法。方法以地高辛标记的寡核苷酸作为探针,用间接原位RT-PCR技术对实验接种FMDV的BHK-21细胞中的FMDV RNA进行检测和定位。结果在接毒细胞的细胞质中有大量强阳性蓝染颗粒,阴性对照细胞中没有蓝染颗粒出现,也没有明显的背景染色。结论结果表明FMDV RNA在细胞的细胞质中进行复制和增殖,同时也表明原位RT-PCR是检测细胞内病毒的一种敏感、特异的方法。 展开更多
关键词 原位RT-PCR fmdv BHK-21细胞 原位杂交
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运用RT-PCR一步法和Nested-CR法快速检测FMDV的研究 被引量：2
11
作者 蒋正军 尹燕博 +11 位作者 龚振华 马洪超 孙淑芳 蔡丽娟 郭福生 李葳 吴时友 黄运生 林庆燕 丁有胜 骆德海 陈义民 《中国动物检疫》 CAS 1997年第2期3-5,共3页
将Ｏ、Ａ型ＦＭＤＶＲＮＡ分离纯化，用ＲＴ－ＰＣＲ法扩增其聚合酶编码基因，可检测到Ａ型１０－６倍稀释、Ｏ型１０－４倍稀释乳鼠肌肉毒。Ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ扩增该基因内部片段，进一步说明该方法准确可靠。ＲＴ－ＰＣＲ一步完成... 将Ｏ、Ａ型ＦＭＤＶＲＮＡ分离纯化，用ＲＴ－ＰＣＲ法扩增其聚合酶编码基因，可检测到Ａ型１０－６倍稀释、Ｏ型１０－４倍稀释乳鼠肌肉毒。Ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ扩增该基因内部片段，进一步说明该方法准确可靠。ＲＴ－ＰＣＲ一步完成使整个检测时间不超过１２小时。 展开更多
关键词 口蹄疫 病毒 fmdv 聚合酶链反应
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牛FMDV受体整合素β6亚基LBD的多克隆抗体制备及初步应用 被引量：1
12
作者 独军政 常惠芸 +3 位作者 高闪电 王景锋 赵建勇 才学鹏 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期696-698,共3页
目的:利用大肠杆菌表达牛FMDV受体整合素β6亚基的配体结合域(LBD)片段,纯化重组目的蛋白后制备兔多克隆抗体并对其进行初步应用。方法:以含有牛整合素β6亚基全长cDNA的质粒为模板PCR扩增得到β6LBD基因片段,与原核表达载体pGEX4T-1相... 目的:利用大肠杆菌表达牛FMDV受体整合素β6亚基的配体结合域(LBD)片段,纯化重组目的蛋白后制备兔多克隆抗体并对其进行初步应用。方法:以含有牛整合素β6亚基全长cDNA的质粒为模板PCR扩增得到β6LBD基因片段,与原核表达载体pGEX4T-1相连,构建原核表达质粒pGEX/β6LBD,测序确认开放阅读框正确后,转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达重组牛β6LBD融合蛋白。SDS-PAGE和Westernblot鉴定后提取包涵体,电泳分离纯化重组融合蛋白,免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,以ELISA、琼脂扩散实验、免疫组化鉴定该抗体的效价和特异性。结果:重组牛β6LBD融合蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,重组蛋白主要以包涵体形式表达,相对分子质量(Mr)约为45000。制备的兔多克隆抗体效价达1∶12800以上,该抗体可与牛舌上皮细胞中的抗原分子结合,具有很好的特异性。结论:实现了牛FMDV受体整合素β6亚基LBD的原核表达和抗体制备,为研究受体β6亚基在牛体内的分布及其在FMDV感染过程中的作用机制提供了工具。 展开更多
关键词 牛fmdv受体 β6LBD 多克隆抗体 免疫组化
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AsiaⅠ型FMDV全衣壳蛋白基因在昆虫细胞中的表达与免疫活性分析
13
作者 曹轶梅 孙甲川 +3 位作者 卢曾军 孙普 郭建宏 刘在新 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期83-88,共6页
将AsiaⅠ型FMDV全衣壳蛋白P12A基因插入到带有蜂毒溶血肽信号序列的杆状病毒转移载体pMel-Bac中,构建重组转移载体pMel-P12A。然后将含有目的基因的转移载体与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。以感染复数(MOI)10的... 将AsiaⅠ型FMDV全衣壳蛋白P12A基因插入到带有蜂毒溶血肽信号序列的杆状病毒转移载体pMel-Bac中,构建重组转移载体pMel-P12A。然后将含有目的基因的转移载体与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。以感染复数(MOI)10的重组病毒感染Sf9细胞,72 h后收获细胞,经Western blotting、间接免疫荧光检测,结果表明P12A基因在昆虫细胞中获得表达,相对分子质量约82 ku,与预测蛋白大小一致,且能被FMDV阳性血清所识别。免疫荧光检测表明表达蛋白主要集中在细胞膜部分。夹心ELISA检测结果表明一部分表达蛋白分泌至培养基中,而有一部分蛋白仍在细胞中未能分泌。表达蛋白加入等量佐剂乳化后免疫豚鼠,间接ELISA检测结果表明豚鼠免疫后15 d即产生了特异性FMDV抗体。本研究为空衣壳的体外组装及基因工程亚单位疫苗的研究进行了有益的探索。 展开更多
关键词 fmdv 衣壳蛋白基因P12A 杆状病毒 SF9细胞 表达
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偶蹄家畜FMDV受体通用亚基αv基因的分子特征及其进化关系
14
作者 独军政 高闪电 +6 位作者 常惠芸 赵建勇 丛国正 邵军军 林彤 刘湘涛 才学鹏 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第11期1530-1536,共7页
已发现至少有αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8 4种整联蛋白是FMDV的细胞受体,αv是4种受体的通用亚基。本试验中从FMDV实验感染猪和牛、健康羊和双峰驼等的肺组织中克隆到了受体通用亚基αv基因,并对其序列进行了比较和进化关系分析。... 已发现至少有αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8 4种整联蛋白是FMDV的细胞受体,αv是4种受体的通用亚基。本试验中从FMDV实验感染猪和牛、健康羊和双峰驼等的肺组织中克隆到了受体通用亚基αv基因,并对其序列进行了比较和进化关系分析。结果显示,羊、牛、猪、双峰驼的αv亚基基因的编码区分别含有3147、3147、3141、3165个核苷酸,分别编码1048、1048、1046、1054个氨基酸,信号肽均由氨基端30个氨基酸组成,跨膜区、胞浆区均分别由29、32个氨基酸组成;胞外区分别由957、957、955、963个氨基酸组成。羊、牛、猪、双峰驼αv亚基基因在Gen-Bank中的登录号分别为EU367989、DQ871215、EF474019、EU367990。同源性分析表明,信号肽变异最大,胞外区次之,跨膜区和胞浆区比较保守;进化树表明,与灵长类、啮齿类、奇蹄类、禽类、食肉类等口蹄疫非易感物种相比,口蹄疫易感动物羊、双峰驼、猪、牛等偶蹄家畜αv亚基的亲缘关系较近,处于同一进化分支。这表明受体αv亚基可能与FMDV的宿主范围和组织嗜性有关。 展开更多
关键词 偶蹄家畜 fmdv受体 αv基因 分子特征 进化关系
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猪O型FMDV主要抗原表位多肽的合成与鉴定
15
作者 杨苏珍 赵冬 +2 位作者 郅玉宝 邓瑞广 张改平 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期8-12,共5页
为筛选口蹄疫病毒表位抗原,使用Symphony 12通道多肽合成仪,采用Fmoc固相合成原理,合成5条O型FMDV抗原表位肽。Quattro Micro液-质联用仪分析多肽分子的结构特性,分析结果表明,在误差允许的范围内所检测的结果与理论值相符,5条多肽均通... 为筛选口蹄疫病毒表位抗原,使用Symphony 12通道多肽合成仪,采用Fmoc固相合成原理,合成5条O型FMDV抗原表位肽。Quattro Micro液-质联用仪分析多肽分子的结构特性,分析结果表明,在误差允许的范围内所检测的结果与理论值相符,5条多肽均通过质谱检测。通过SMCC双功能偶联剂将多肽偶联于BSA载体蛋白,以Dot-blot和间接ELISA法检测这5条与BSA偶联得多肽与O型FMDV阳性血清的结合能力,结果显示,中和表位Pep1、Pep2、Pep3能特异性结合O型FMDV感染血清和免疫血清,为抗FMDV中和表位单克隆抗体的制备和FMDV抗体检测试纸条方法的建立奠定基础。 展开更多
关键词 fmdv 抗原表位 多肽 合成 鉴定
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靶向FMDV受体猪源整联蛋白α_V亚基基因抑制FMDV复制的最佳siRNA筛选
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作者 骆继怀 独军政 +2 位作者 高闪电 张国锋 常惠芸 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期1732-1737,共6页
筛选靶向FMDV受体猪源整联蛋白αV亚基基因抑制FMDV复制的最佳siRNA。根据猪源αV mRNA序列,设计并合成siRNA,Lipofectamine 2000转染siRNA于PK-15细胞,利用qRT-PCR检测RNAi组(iαV-480、iαV-1719和iαV-2077)、空白组(Mock)和阴性对照... 筛选靶向FMDV受体猪源整联蛋白αV亚基基因抑制FMDV复制的最佳siRNA。根据猪源αV mRNA序列,设计并合成siRNA,Lipofectamine 2000转染siRNA于PK-15细胞,利用qRT-PCR检测RNAi组(iαV-480、iαV-1719和iαV-2077)、空白组(Mock)和阴性对照组(Control)中αVmRNA表达情况;在转染siRNA12h后通过接种100TCID50,收集病毒液,测定TCID50,确定其抗病性变化。结果显示,瞬间转染PK-15后,与阴性对照组和空白组相比,3个RNAi组均不同程度抑制αV亚基基因表达,在24hiαV-480组在mRNA水平抑制90.1%,作用最明显。TCID50测定表明iαV-480组有较低的病毒滴度,说明其抗病性增加。针对猪源整联蛋白αV亚基基因的最佳siRNA的筛选成功,为深入研究干扰FMDV受体抗FMDV转基因路线奠定了基础。 展开更多
关键词 fmdv siRNA 转染 PK-15细胞 αv亚基基因 病毒滴度
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FMDV 2A介导的乳腺上皮细胞双基因表达载体构建及表达
17
作者 陈秋菊 王韵斐 +4 位作者 崔易虹 朱广琴 杨明明 宋宇轩 曹斌云 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期1396-1401,共6页
构建FMDV 2A介导的人白细胞介素2基因(hIL-2)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子乳腺特异性表达载体,并验证其在乳腺上皮细胞中的表达。克隆奶山羊β-酪蛋白启动子序列,将hIL-2基因序列置于启动子之后,然后利用口蹄疫病毒2A(FMDV ... 构建FMDV 2A介导的人白细胞介素2基因(hIL-2)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子乳腺特异性表达载体,并验证其在乳腺上皮细胞中的表达。克隆奶山羊β-酪蛋白启动子序列,将hIL-2基因序列置于启动子之后,然后利用口蹄疫病毒2A(FMDV 2A)自剪切序列连接EGFP基因,构建出乳腺特异性的双顺反子表达载体pFIENβ,并利用脂质体转染山羊乳腺上皮细胞,然后用RT-PCR技术和Western blot检测hIL-2基因与EG-FP基因的表达。重组质粒pFIENβ经酶切鉴定后表明构建成功,转染质粒PFIENβ和pEGFP-C1的细胞均观察到绿色荧光;从转染pFIENβ的乳腺上皮细胞中扩增出hIL-2基因和EGFP基因,而转染pEGFP-C1的细胞中只扩增出EGFP基因;经Western blot检测,转染pFIENβ的细胞中均表达了hIL-2和EGFP蛋白。结果表明山羊β-酪蛋白启动子能同时启动hIL-2基因和EGFP基因在山羊乳腺上皮细胞中的表达,并且利用FMDV 2A元件实现了hIL-2基因和EGFP基因的非融合型表达。 展开更多
关键词 人白细胞介素2 EGFP fmdv2A 双顺反子
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猪FMDV受体β3亚基配体结合域的基因克隆及其多克隆抗体制备
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作者 独军政 高闪电 +5 位作者 常惠芸 丛国正 林彤 邵军军 刘湘涛 才学鹏 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期358-361,共4页
目的:克隆猪FMDV受体β3亚基的配体结合域(LBD)基因,利用原核细胞表达β3亚基的LBD片段,纯化目的蛋白后制备兔多克隆抗体。方法:利用RT-PCR方法从FMDV实验感染猪的肺组织中克隆β3亚基的LBD基因,将其与pGEMT-easy载体相连构建pGEM/β3 L... 目的:克隆猪FMDV受体β3亚基的配体结合域(LBD)基因,利用原核细胞表达β3亚基的LBD片段,纯化目的蛋白后制备兔多克隆抗体。方法:利用RT-PCR方法从FMDV实验感染猪的肺组织中克隆β3亚基的LBD基因,将其与pGEMT-easy载体相连构建pGEM/β3 LBD,经BamHⅠ/XhoⅠ酶切后回收β3LBD片段,与同样酶切处理的原核表达载体pGEX4T-1相连,构建原核表达质粒pGEX/β3 LBD,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达β3LBD蛋白。纯化目的蛋白后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。通过ELISA和Western blot鉴定血清效价和特异性。结果:猪β3亚基的LBD基因含有507个核苷酸,编码169个氨基酸,猪β3 LBD基因与牛、人、黑猩猩、猕猴、马、犬、挪威大鼠、家鼠、和鸡的β3 LBD基因核苷酸序列同源性分别为90·3%、92·3%、92·1%、91·3%、90·5%、90·3%、87·8%、85·2%、79·5%。哺乳动物的β3亚基LBD基因同源性较高,与鸡的同源性较低。实现了重组猪β3LBD蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量(Mr)约为44000,制备的兔多克隆抗体效价达1∶12800以上。结论:实现了猪FMDV受体β3 LBD的基因克隆、原核表达和多克隆抗体的制备,为深入研究受体β3亚基在FMDV感染过程中的作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 fmdv病毒受体 猪β3LBD基因 原核表达 多克隆抗体
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O型FMDVP1-2A基因与猪IFN-γ基因共表达质粒的构建及其在BHK-21细胞中的表达
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作者 吴国华 张强 +6 位作者 颜新敏 侯俊玲 赵志荀 崔力凡 李健 朱海霞 朱彩珠 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2010年第5期11-15,共5页
为了构建O型FMDVP1-2A基因与猪IFN-γ基因共表达质粒并在BHK-21细胞中进行表达,本研究利用聚合酶链式反应(PCR)从阳性质粒pGEM-P12A克隆到P1-2A基因,将扩增产物纯化、双酶切后连接到pBudCE-IFN载体,构建重组质粒pBudCE-IFN-P1-2A。重组... 为了构建O型FMDVP1-2A基因与猪IFN-γ基因共表达质粒并在BHK-21细胞中进行表达,本研究利用聚合酶链式反应(PCR)从阳性质粒pGEM-P12A克隆到P1-2A基因,将扩增产物纯化、双酶切后连接到pBudCE-IFN载体,构建重组质粒pBudCE-IFN-P1-2A。重组表达质粒鉴定后,在脂质体介导下转染BHK-21细胞,用RT-PCR和直接免疫荧光试验分别检测P1-2A和IFN-γ在BHK-21细胞中的表达。RT-PCR检测显示,重组表达质粒转染细胞后P1-2A和IFN-γ基因成功转录出mRNA;免疫荧光试验表明目的基因在BHK-21细胞中获得了表达。结果证明,本研究成功构建了重组质粒pBudCE-IFN-P1-2A并在体外进行了表达,这为研制抗FMDVDNA疫苗和IFN-γ的佐剂作用奠定了坚实基础。 展开更多
关键词 fmdv P1—2A基因 IFN-Γ基因 共表达
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FMDV非结构蛋白3A和3B的表达与反应活性分析
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作者 付元芳 卢曾军 +4 位作者 曹轶梅 张小丽 郭建宏 刘在新 才学鹏 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 2008年第6期9-13,共5页
根据已测得的O/China/99口蹄疫病毒(FMDV)基因组序列,设计两对特异性表达引物,以带有O/Chi-na/99 3ABC基因片段的重组质粒pGEM-3ABC为模板,扩增得到了3A、3B基因,通过两端的BamHI和SalI酶切位点插入原核表达载体pET28a,将重组表达质粒... 根据已测得的O/China/99口蹄疫病毒(FMDV)基因组序列,设计两对特异性表达引物,以带有O/Chi-na/99 3ABC基因片段的重组质粒pGEM-3ABC为模板,扩增得到了3A、3B基因,通过两端的BamHI和SalI酶切位点插入原核表达载体pET28a,将重组表达质粒转化宿主菌BL21,用IPTG诱导表达目的蛋白.表达产物经SDS-PAGE检测表明,3A和3B基因成功的在大肠埃希氏菌中得到了表达;通过Western blotting分析和斑点ELISA分析表明,纯化后的蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应. 展开更多
关键词 fmdv 非结构蛋白3A 3B 表达 活性分析
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