静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达、纯化与结晶 被引量：1

1

作者 林波 孟海玲 +3 位作者 吴勇 邴晖 长孙东亭 罗素兰 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期126-131,共6页

表达、纯化静水椎螺(Lymnaea stagnalis)乙酰胆碱结合蛋白(Ls-AChBP)并得到晶体。将静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白cDNA序列克隆到表达载体pFastBac1上,构建了重组表达质粒pFastBac1-Ls-AChBP-His,经重组子筛选,得到重组杆状病毒质粒Bacmid,... 表达、纯化静水椎螺(Lymnaea stagnalis)乙酰胆碱结合蛋白(Ls-AChBP)并得到晶体。将静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白cDNA序列克隆到表达载体pFastBac1上,构建了重组表达质粒pFastBac1-Ls-AChBP-His,经重组子筛选,得到重组杆状病毒质粒Bacmid,采用CellfectinⅡ脂质体,把带有外源基因的杆状病毒质粒Bacmid转染到昆虫细胞中,经镍柱和凝胶色谱柱对重组蛋白进行纯化得到五聚体,并用机器人进行结晶筛选获得其蛋白晶体。重组蛋白Ls-AChBP在Bac-to-Bac表达系统中得到高效表达并被纯化,结晶筛选得到晶体。 展开更多

关键词 静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统 重组表达 纯化 结晶

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TAP系统分离纯化MT1-MMP-hTAP融合基因蛋白复合物及表达效应评估 被引量：1

2

作者 俞炽阳 Yang Mao-zhou 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第12期1084-1087,共4页

目的　应用TAP系统分离纯化的MT1 MMP hTAP蛋白复合物的表达效应。方法　应用TAP系统分子生物学特性采用IgG和钙调蛋白亲和胶粒二次亲和层析法分离纯化MT1 MMP hTAP蛋白复合物。PAP免疫染色及Westernblot法检测蛋白表达效应。结果　PAP... 目的　应用TAP系统分离纯化的MT1 MMP hTAP蛋白复合物的表达效应。方法　应用TAP系统分子生物学特性采用IgG和钙调蛋白亲和胶粒二次亲和层析法分离纯化MT1 MMP hTAP蛋白复合物。PAP免疫染色及Westernblot法检测蛋白表达效应。结果　PAP免疫染色显示MT1 MMP hTAP融合基因在鸡成纤维细胞内有效表达 ,融合蛋白染色呈深蓝色 ,Westernblot法检测经TAP系统分离纯化后MT1 MMP hTAP蛋白复合物分子稳定表达在相应 68× 10 3 位置。结论　TAP系统分离纯化MT1 MMP hTAP蛋白复合物及其在动物细胞的构建成功并有效表达为在人类肿瘤细胞建立TAP纯化蛋白质体系和寻找MT1 MMP 展开更多

关键词 MT1-MMP-hTAP融合基因 TAP系统 蛋白质纯化

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甲型副伤寒杆菌鞭毛蛋白的分离纯化及其抗血清的制备 被引量：4

3

作者 胡明冬 徐剑铖 +2 位作者 冯英凯 周长喜 龚传明 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第7期607-609,共3页

目的　提纯甲型副伤寒杆菌鞭毛蛋白并制备其抗血清。方法　酸裂解法分离副伤寒杆菌鞭毛蛋白,通过半饱和硫酸铵提取、AKTAExplorer蛋白纯化系统除盐及弱阴离子交换层析纯化,所获得鞭毛蛋白的产量通过考马斯亮蓝法测定。纯化后的鞭毛蛋白... 目的　提纯甲型副伤寒杆菌鞭毛蛋白并制备其抗血清。方法　酸裂解法分离副伤寒杆菌鞭毛蛋白,通过半饱和硫酸铵提取、AKTAExplorer蛋白纯化系统除盐及弱阴离子交换层析纯化,所获得鞭毛蛋白的产量通过考马斯亮蓝法测定。纯化后的鞭毛蛋白免疫新西兰大白兔,通过免疫印迹试验和双向免疫扩散试验,确定血清中是否有抗鞭毛蛋白抗体产生及其效价。结果　SDS PAGE提示,纯化的鞭毛蛋白为1条相对分子量为5 2×10 3 蛋白带;免疫印迹实验亦提示条带在5 2×10 3 处;蛋白定量测得每1克湿重的细菌可提取(4 8±0 5 )mg鞭毛蛋白;抗鞭毛蛋白抗血清效价为1∶64。结论　经酸裂解法可获得高产量的鞭毛蛋白,其抗血清易于制备,滴度高,该抗血清可能在拮抗脓毒血症炎症损伤作用方面有积极意义。 展开更多

关键词 甲型副伤寒杆菌 鞭毛蛋白 AKTA explorer蛋白纯化系统

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2019-nCoV N蛋白在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及纯化

4

作者 海毕瑞 杨扬 +2 位作者 刘世火 吴峻 徐家萍 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期333-339,共7页

核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白是新型冠状病毒的结构蛋白,与病毒RNA的转录和复制有关。目前,N蛋白已被广泛应用于新型冠状病毒肺炎的检测诊断及治疗。本研究克隆的2019-nCoV-n基因CDS由1257个碱基构成,编码419个氨基酸。将该基因连接到昆... 核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白是新型冠状病毒的结构蛋白,与病毒RNA的转录和复制有关。目前,N蛋白已被广泛应用于新型冠状病毒肺炎的检测诊断及治疗。本研究克隆的2019-nCoV-n基因CDS由1257个碱基构成,编码419个氨基酸。将该基因连接到昆虫表达载体pFastBacTMHTB构建重组Bacmid,转染至BmN细胞中获得重组病毒,将重组病毒注射家蚕蛹体内,收集发病家蚕蛹血淋巴,通过镍柱亲和纯化,SDS-PAGE和Western blot检测表明获得一定纯度具有活性的重组2019-nCoV-N蛋白,为后期进一步开发抗体检测试剂盒鉴定了基础。 展开更多

关键词 杆状病毒表达系统 家蚕蛹 2019-nCoV 核衣壳蛋白 蛋白质纯化

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乙型脑炎病毒膜蛋白B区多肽抗原的表达、纯化及血清学评价 被引量：4

5

作者 周惠琼 江立敏 +3 位作者 郑夔 顾耀亮 梁文燕 柯昌文 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期53-55,82,共4页

目的在原核表达系统中对乙型脑炎病毒包膜糖蛋白(E蛋白)的B区多肽抗原进行高效表达、纯化及血清学评价。方法利用PCR技术从乙脑减毒活疫苗中扩增编码B区的DNA片段,酶切消化后连接到表达载体pET22b上,用此连接产物转化大肠埃希菌BL21(DE3... 目的在原核表达系统中对乙型脑炎病毒包膜糖蛋白(E蛋白)的B区多肽抗原进行高效表达、纯化及血清学评价。方法利用PCR技术从乙脑减毒活疫苗中扩增编码B区的DNA片段,酶切消化后连接到表达载体pET22b上,用此连接产物转化大肠埃希菌BL21(DE3)并表达B区多肽抗原,表达产物经液相层析纯化;用乙脑病人血清对纯化后的B区多肽抗原进行评价。结果重组质粒pET22b-JEB经双酶切,其插入的外源基因片段为372 bp,与预期DNA片段大小一致。将纯化前与纯化后的蛋白作SDS-PAGE电泳,均可见一条约16kD的外源基因蛋白带,与计算的相对分子质量相符。经WB和ELISA血清学评价,表明重组B区多肽抗原具有较高的灵敏性及特异性。结论成功构建了表达载体pET22b-JEB,在原核系统中表达的B区多肽抗原具有良好的血清学检测价值。 展开更多

关键词 乙型脑炎病毒 包膜糖蛋白B区 原核表达系统 蛋白纯化

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人乳腺珠蛋白基因亚型的原核表达及纯化 被引量：2

6

作者 刘秀娜 潘自铁 +3 位作者 王仙园 周娟 赵力军 胡川闽 《医学研究生学报》 CAS 2006年第2期107-110,共4页

目的:克隆人乳珠蛋白(hMAM)编码全长cDNA,原核表达并纯化蛋白产物,为后期研制乳腺癌早期诊断试剂盒奠定基础。方法:自乳腺癌组织及乳腺癌细胞株MD-MB453提取总RNA,通过RT-PCR克隆hMAM cD-NA,构建pQE40-hMAM表达质粒,在大肠杆菌M15中表达... 目的:克隆人乳珠蛋白(hMAM)编码全长cDNA,原核表达并纯化蛋白产物,为后期研制乳腺癌早期诊断试剂盒奠定基础。方法:自乳腺癌组织及乳腺癌细胞株MD-MB453提取总RNA,通过RT-PCR克隆hMAM cD-NA,构建pQE40-hMAM表达质粒,在大肠杆菌M15中表达,利用镍-亚硝胺乙酸组氨酸(N i-NTA-H is)亲和层析法对重组蛋白进行纯化。结果:乳腺癌组织和乳腺癌细胞株中发现两种hMAM cDNA亚型,即hMAM和hMAM(Isoform),长度分别为279和270 bp,两者相差9个连续碱基,其翻译产物相差3个连续氨基酸残基;表达的融合蛋白以不溶性包涵体形式存在,纯化后得到纯度为97%的目的蛋白。结论:获得hMAM cDNA并发现一个新的hMAM突变体;融合蛋白的表达及纯化成功。 展开更多

关键词 乳腺癌 人乳腺珠蛋白 原核表达系统 蛋白纯化

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蛋白质层析系统在实验教学中的应用 被引量：3

7

作者 赵玉红 李欣 +5 位作者 崔建林 赵立青 李小菊 李登文 张金红 周浩 《实验技术与管理》 CAS 北大核心 2016年第5期48-51,57,共5页

设计"KTAprime plus蛋白质层析系统纯化绿色荧光蛋白(GFP)"的综合实验,以GFP蛋白为研究对象,在大肠杆菌中大量表达重组GFP蛋白,经镍柱亲和层析、离子交换层析以及凝胶过滤层析3种常用层析技术逐步纯化,各步纯化样品经SDS-P... 设计"KTAprime plus蛋白质层析系统纯化绿色荧光蛋白(GFP)"的综合实验,以GFP蛋白为研究对象,在大肠杆菌中大量表达重组GFP蛋白,经镍柱亲和层析、离子交换层析以及凝胶过滤层析3种常用层析技术逐步纯化,各步纯化样品经SDS-PAGE鉴定分析,最终获得高纯度的GFP蛋白。通过该实验使学生深入、全面、系统地掌握生命科学研究中最新的蛋白质分离纯化技术,提高学生的科研水平和综合能力。 展开更多

关键词 蛋白质层析系统 蛋白质分离纯化 镍柱亲和层析 离子交换层析 凝胶过滤层析

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乳腺珠蛋白基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化研究 被引量：2

8

作者 刘秀娜 王仙园 +3 位作者 周娟 潘自铁 赵力军 胡川闽 《解放军护理杂志》 2005年第11期7-9,44,共4页

目的克隆乳腺珠蛋白(hum an m amm aglob in,hMAM)编码全长cDNA,原核表达并纯化蛋白产物,为后期研制乳腺癌早期诊断试剂盒奠定基础,从而为早期发现乳腺癌提供科学的监测方法。方法自乳腺癌组织提取总RNA,通过RT-PCR克隆hMAM cDNA,构建pQ... 目的克隆乳腺珠蛋白(hum an m amm aglob in,hMAM)编码全长cDNA,原核表达并纯化蛋白产物,为后期研制乳腺癌早期诊断试剂盒奠定基础,从而为早期发现乳腺癌提供科学的监测方法。方法自乳腺癌组织提取总RNA,通过RT-PCR克隆hMAM cDNA,构建pQE40-hMAM表达质粒,在大肠杆菌M15中表达,利用镍-亚硝胺乙酸组氨酸(N i-NTA-H is)亲和层析法对重组蛋白进行纯化。结果表达的融合蛋白以不溶性包涵体形式存在,纯化后得到纯度为97%的目的蛋白。结论成功地纯化出hMAM重组蛋白。 展开更多

关键词 乳腺癌 人乳腺珠蛋白 原核表达系统 蛋白纯化

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PTD-Calbindin D28K融合蛋白的表达、纯化及其穿膜功能的鉴定 被引量：2

9

作者 樊永峰 吕传真 +1 位作者 乔健 任惠民 《复旦学报（医学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2004年第3期231-234,F002,共5页

目的　构建融合蛋白PTD CalbindinD2 8K(CaBP2 8)的表达质粒 ,并进行诱导表达、纯化 ,在体外初步鉴定其跨膜转运功能。方法　提取大鼠脑组织总RNA ,反转录后用聚合酶链反应 (PCR)法扩增编码CaBP2 8的全长cD NA序列 ,重组入 pET 32a及含... 目的　构建融合蛋白PTD CalbindinD2 8K(CaBP2 8)的表达质粒 ,并进行诱导表达、纯化 ,在体外初步鉴定其跨膜转运功能。方法　提取大鼠脑组织总RNA ,反转录后用聚合酶链反应 (PCR)法扩增编码CaBP2 8的全长cD NA序列 ,重组入 pET 32a及含有PTD的pTransVector表达载体中 ,测序鉴定后转化大肠埃希菌BL2 1(DE3) ,构建重组体的表达菌株。IPTG诱导表达后 ,以NTA Ni亲和层析柱进行分离纯化 ,SDS PAGE以及Westernblot鉴定。纯化的CaBP2 8及PTD CaBP2 8用FITC标记 ,分别以一定的浓度孵育体外培养的cos7细胞 ,最后荧光显微镜下观察两者在细胞中的分布情况 ,并用流式细胞仪 (FCM)做定量分析。结果　成功地构建了含有及不含有PTD的CaBP2 8表达载体 ,插入片断 783bp ,表达产物相对分子质量分别约 30 0 0 0、5 0 0 0 0 ,经Weternblot鉴定 ,与抗CaBPD2 8K抗体均有特异性反应。孵育培养的cos7细胞后 ,CaBP2 8 FITC仅少量吸附于细胞膜表面 ,而PTD CaBP2 8 FITC则分布于胞质内 ;FCM定量分析发现 ,细胞荧光强度随着目的蛋白的孵育浓度或孵育时间增加而增加 ,并且孵育时间为 1h时荧光达到最强。结论　重组PTD CaBP2 展开更多

关键词 PTD-Calbindin D28K融合蛋白 表达 纯化 穿膜功能 鉴定 蛋白质治疗 神经系统疾病

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黄粉虫β-1，3-葡聚糖识别蛋白的分离纯化及部分生物学功能 被引量：3

10

作者 张嵘 张景海 +2 位作者 LEE Bok Luel 赵明沂 王金春 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期27-32,共6页

采用中性盐沉淀、凝胶层析等常规方法纯化黄粉虫Tenebrio molitor血淋巴中的β-1,3-葡聚糖识别蛋白,并对其在酚氧化酶原激活系统中的作用进行了初步的研究。结果表明:黄粉虫血淋巴的β-1,3-葡聚糖识别蛋白的分子量约为70kDa,主要分布于... 采用中性盐沉淀、凝胶层析等常规方法纯化黄粉虫Tenebrio molitor血淋巴中的β-1,3-葡聚糖识别蛋白,并对其在酚氧化酶原激活系统中的作用进行了初步的研究。结果表明:黄粉虫血淋巴的β-1,3-葡聚糖识别蛋白的分子量约为70kDa,主要分布于血浆中。纯化的β-1,3-葡聚糖识别蛋白只能特异性地识别β-1,3-葡聚糖而不能识别肽聚糖。在β-1,3-葡聚糖所诱导的酚氧化酶原的激活过程中,随着酚氧化酶原激活程度的提高,内源性β-1,3-葡聚糖识别蛋白的含量逐渐减少。抗β-1,3-葡聚糖识别蛋白多克隆抗体对黄粉虫血淋巴中由β-1,3-葡聚糖所诱导的酚氧化酶活性起抑制作用,且该抑制作用呈现一种剂量依赖性的趋势。上述结果有助于深入了解β-1,3-葡聚糖对黄粉虫血淋巴酚氧化酶原激活系统的激活作用。 展开更多

关键词 黄粉虫 β-1 3-葡聚糖识别蛋白 分离纯化 生物学功能 酚氧化酶原激活系统 先天性免疫

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猪圆环病毒H株cap基因原核表达蛋白的纯化和复性 被引量：1

11

作者 乔宏兴 边传周 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2008年第11期24-25,共2页

关键词 猪圆环病毒 CAP蛋白 p基因 原核表达 猪断奶后多系统衰竭综合征 PCV-2 复性 纯化

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人脑星形细胞瘤中热休克蛋白70肽复合物的分离纯化

12

作者 方伯言 王大江 +2 位作者 方伟 许德顺 贾建平 《中国现代神经疾病杂志》 CAS 2005年第4期262-263,共2页

关键词 人脑星形细胞瘤 热休克蛋白70 肽复合物 分离纯化 神经系统疾病 肿瘤 蛋白提取

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人体c-Mpl分子配体蛋白XP1的表达、纯化及活性初步鉴定

13

作者 张擎 葛怡琛 +1 位作者 潘瑞敏 徐培林 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 2003年第7期25-28,共4页

TPO是近年发现的血小板生成素 ,它通过与其受体c Mpl的结合刺激巨核细胞的发生 ,调节动物或人体血小板的生成。利用酵母双杂交系统 ,以人体c Mpl受体作为诱饵蛋白 ,我们从人体肝脏cDNA文库筛选到另一与c Mpl相结合的新配体 ,命名为XP1。... TPO是近年发现的血小板生成素 ,它通过与其受体c Mpl的结合刺激巨核细胞的发生 ,调节动物或人体血小板的生成。利用酵母双杂交系统 ,以人体c Mpl受体作为诱饵蛋白 ,我们从人体肝脏cDNA文库筛选到另一与c Mpl相结合的新配体 ,命名为XP1。将xp1 cDNA构建到 pET 2 8b大肠杆菌融合表达载体 ,经金属离子亲和层析柱和DEAE阴离子层析柱分离纯化 ,获得纯度为 99%的His XPI水溶性融合蛋白。表达产物利用小鼠巨核细胞集落形成单位测定活性。结果表明 :xp1基因在大肠杆菌中获得高效水溶性表达 ; 展开更多

关键词 血小板生成素 C-MPL 配体蛋白 融合表达 纯化 活性 巨核细胞 酵母双杂交系统 水溶性 大肠杆菌

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利用自剪切融合蛋白在大肠杆菌中表达并纯化兔防御素

14

作者 李霞 沈昕 +4 位作者 王义琴 张利明 赵世民 李文彬 孙勇如 《高技术通讯》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期67-70,共4页

将源自兔嗜中性细胞的防御素基因NP-1插入原核表达载体pTYB2,并将重组质粒pTYB2-NP1转入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导使防御素以融合蛋白的形式表达.然后,通过亲和层析利用自剪切融合蛋白分离提纯目的蛋白.蛋白电泳检测到以二聚体形式存... 将源自兔嗜中性细胞的防御素基因NP-1插入原核表达载体pTYB2,并将重组质粒pTYB2-NP1转入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导使防御素以融合蛋白的形式表达.然后,通过亲和层析利用自剪切融合蛋白分离提纯目的蛋白.蛋白电泳检测到以二聚体形式存在的防御素,但此蛋白没有对大肠杆菌的抑菌活性.同时,对该表达纯化系统的特点和用原核生物大肠杆菌表达真核生物防御素的问题进行了分析和讨论. 展开更多

关键词 融合蛋白 兔防御素 剪切 原核表达载体 大肠杆菌表达 防御素基因 NP-1 重组质粒 IPTG 目的蛋白 分离提纯 亲和层析 电泳检测 抑菌活性 真核生物 原核生物 纯化系统 性细胞 体形

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SETD4蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒系统的表达 被引量：3

15

作者 雷烨铭 崔航 +6 位作者 钟玙沄 王义乾 黄穗 赵舒祺 蔡军伟 姜勇 刘靖华 《中国临床解剖学杂志》 CSCD 北大核心 2015年第4期426-429,共4页

目的通过昆虫杆状病毒表达系统表达SETD4(SET domain-containing 4)蛋白,并纯化SETD4蛋白,为深入探讨SETD4的功能奠定基础。方法提取小鼠正常肝组织的RNA,通过RT-PCR扩增SETD4基因,并克隆至p Fast Bac-HTB构建重组载体,再转座获得重组杆... 目的通过昆虫杆状病毒表达系统表达SETD4(SET domain-containing 4)蛋白,并纯化SETD4蛋白,为深入探讨SETD4的功能奠定基础。方法提取小鼠正常肝组织的RNA,通过RT-PCR扩增SETD4基因,并克隆至p Fast Bac-HTB构建重组载体,再转座获得重组杆粒;通过脂质体介导将重组杆粒转染SF9细胞产生重组病毒,扩增病毒感染细胞并获得重组蛋白;利用Ni2+亲和柱来纯化蛋白,并通过Western Blot及考马斯亮蓝染色鉴定SETD4蛋白。结果经双酶切鉴定及测序证实SETD4基因插入了供体质粒;经PCR鉴定证实SETD4基因插入了穿梭载体;经考马斯亮蓝染色证实纯化得到重组蛋白,用His-Tag抗体和SETD4特异性抗体在50 k D处可检测到目的条带。结论成功利用昆虫杆状病毒表达系统够表达了SETD4,并纯化了SETD4。 展开更多

关键词 SETD4蛋白 杆状病毒表达系统 表达 纯化

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禽流感病毒NS1蛋白在杆状病毒表达系统中的表达 被引量：3

16

作者 李东卫 郭莹莹 +5 位作者 刘在斯 王世达 沈楠 文辉强 焦同路 王靖飞 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2012年第6期27-31,共5页

为获得纯化的禽流感病毒(AIV)的NS1蛋白,将A/chicken/Guangxi/10/99(H9N2)(CK/GX/10/99)NS1全长核苷酸克隆至杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,构建了重组转移载体pFastBacHTA-NS1,然后转化入DH10Bac感受态细胞中制备重组杆粒,在脂质体介... 为获得纯化的禽流感病毒(AIV)的NS1蛋白,将A/chicken/Guangxi/10/99(H9N2)(CK/GX/10/99)NS1全长核苷酸克隆至杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,构建了重组转移载体pFastBacHTA-NS1,然后转化入DH10Bac感受态细胞中制备重组杆粒,在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得表达NS1基因的重组杆状病毒。用重组杆状病毒转染昆虫细胞sf9进行NS1蛋白的表达,通过SDS-PAGE电泳、Western blot、间接免疫荧光(IFA)对表达的目标蛋白进行分析。结果表明,构建了含NS1基因的重组杆状病毒,分子质量约30ku的重组蛋白得到了表达,为NS1的相关功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 禽流感病毒 NS1蛋白 杆状病毒表达载体系统 蛋白纯化

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组蛋白去甲基化酶JARID1B的表达纯化及酶活力分析 被引量：1

17

作者 郭雪 刘意 +1 位作者 杨慧蓉 徐彦辉 《复旦学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期342-347,共6页

目的筛选能够大量表达、方便纯化且具有酶活性的组蛋白去甲基化酶JARID1B(jumonji AT-richinteractive domain 1B)的截短体。方法通过Bac-to-Bac系统制备含目的基因的杆粒(bacmid),转染Sf9昆虫细胞获得重组病毒基因组,并感染Hi5昆虫细... 目的筛选能够大量表达、方便纯化且具有酶活性的组蛋白去甲基化酶JARID1B(jumonji AT-richinteractive domain 1B)的截短体。方法通过Bac-to-Bac系统制备含目的基因的杆粒(bacmid),转染Sf9昆虫细胞获得重组病毒基因组,并感染Hi5昆虫细胞表达目的蛋白,用Ni-NTA亲和层析,离子交换层析和分子筛纯化目的蛋白。利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption ionization time offlight mass spectrometer,MALDI-TOF)分析截短体的酶活力。结果去除C-端两个PHD结构域的截短体JARID1B1-825能够在昆虫细胞Hi5中得以大量表达(1L细胞含10mg蛋白),经Ni-NTA亲和层析,阴离子交换层析和分子筛三步纯化,获得纯度大于90%的目的蛋白,MALDI-TOF质谱分析显示JARID1B1-825仍拥有去组蛋白甲基化修饰的酶活性。结论筛选到了能够大量表达、方便纯化且具有酶活性的JARID1B的截短体,对其后续的功能研究和药物开发具有重要的意义。 展开更多

关键词 组蛋白去甲基化酶 JARID1B 昆虫细胞表达系统 蛋白表达纯化

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非洲猪瘟病毒MGF505-5R蛋白表达与纯化 被引量：5

18

作者 张素玲 吴芃 +5 位作者 岳亚男 白晨雨 郝丽影 李向东 逄文强 田克恭 《河南农业科学》 北大核心 2020年第10期130-136,共7页

为了获得具有生物学活性的非洲猪瘟病毒(ASFV)MGF505-5R蛋白及其特异性多克隆抗体,分别将His-SUMO、His-TrxA、His-GST、His-MBP和His-NusA基因片段与MGF505-5R基因连接,构建原核表达载体pET28a-SUMO-MGF505-5R、pET28a-TrxA-MGF505-5R... 为了获得具有生物学活性的非洲猪瘟病毒(ASFV)MGF505-5R蛋白及其特异性多克隆抗体,分别将His-SUMO、His-TrxA、His-GST、His-MBP和His-NusA基因片段与MGF505-5R基因连接,构建原核表达载体pET28a-SUMO-MGF505-5R、pET28a-TrxA-MGF505-5R、pET28a-GST-MGF505-5R、pET28a-MBP-MGF505-5R和pET28a-NusA-MGF505-5R,并分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达;通过对诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间进行优化,研究最佳表达条件;采用麦芽糖亲和层析和Ni2+亲和层析对表达的重组蛋白进行纯化,并将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体;应用Western blot方法对制备的多克隆抗体进行鉴定。结果显示,MBP-MGF505-5R重组蛋白能够在大肠杆菌中可溶性表达,在20℃条件下,IPTG浓度为0.5 mmol/L、诱导12 h时,重组蛋白可溶性表达量最高;纯化后可获得纯度达90%以上的MGF505-5R蛋白。免疫小鼠后制备的多克隆抗体能够与MGF505-5R蛋白发生特异性反应。综上,利用大肠杆菌表达系统实现了ASFV MGF505-5R蛋白的可溶性表达,且纯化后重组蛋白纯度较高,具有生物学活性。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 MGF505-5R蛋白 大肠杆菌表达系统 可溶性表达 纯化

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蜂王浆主蛋白2在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定

19

作者 段香媛 武江利 +1 位作者 魏俏红 冯毛 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第10期3779-3786,共8页

本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达蜂王浆主蛋白2(MRJP2),为后续MRJP2功能的深入研究提供材料。根据GenBank中意大利蜜蜂(Apis mellifera L.)MRJP2基因序列,经PCR扩增、克隆至真核表达载体pFastBac1,构建重组杆状病毒质粒MRJ... 本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达蜂王浆主蛋白2(MRJP2),为后续MRJP2功能的深入研究提供材料。根据GenBank中意大利蜜蜂(Apis mellifera L.)MRJP2基因序列,经PCR扩增、克隆至真核表达载体pFastBac1,构建重组杆状病毒质粒MRJP2-Bacmid并转染至Sf9昆虫细胞,以P2代杆状病毒感染Sf9细胞进行诱导表达,利用层析柱和离子交换柱对表达产物进行纯化,并通过SDS-PAGE、Western blotting及四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪(Q Exactive)对目的蛋白进行分析验证。结果显示,本试验成功构建杆状病毒质粒MRJP2-Bacmid,转染至Sf9昆虫细胞并获得表达产物。SDS-PAGE和Western blotting验证结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为52 ku的MRJP2重组蛋白,且纯度较高;质谱分析结果显示,该重组蛋白匹配到蜜蜂蛋白质数据库中MRJP2的特异性肽段为39个,序列覆盖率为61%,且与MRJP2的匹配得分最高,进一步确认该重组蛋白为MRJP2。本研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统成功表达出MRJP2,为后续该蛋白生物学功能的深入研究奠定了基础。 展开更多

关键词 蜂王浆主蛋白2(MRJP2) 昆虫细胞-杆状病毒表达系统 蛋白纯化

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植物重组蛋白纯化新方法

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《种业导刊》 2011年第6期41-41,共1页

目前人们一致认为植物是一种优质的维生素、抗性等药用蛋白表达平台，其成本低廉且用途广泛。不过转基因植物只能产生少量的外源蛋白，因此有效的纯化系统是必不可少的。加拿大Ontario大学的ReynalTremblay及其他科学家合作，基于蛋白... 目前人们一致认为植物是一种优质的维生素、抗性等药用蛋白表达平台，其成本低廉且用途广泛。不过转基因植物只能产生少量的外源蛋白，因此有效的纯化系统是必不可少的。加拿大Ontario大学的ReynalTremblay及其他科学家合作，基于蛋白与大豆凝集素（SBA）的基因融合开发了一种新颖的植物重组蛋白纯化方法。 展开更多

关键词 转基因植物 蛋白纯化 重组蛋白 大豆凝集素 蛋白表达 外源蛋白 纯化系统 纯化方法

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