牛传染性鼻气管炎病毒ERA-LFD检测方法的建立与应用

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作者 郭衍冰 侯绪森 +8 位作者 孙兴忠 王军富 王改丽 郝良玉 董航 王雪磊 刘杰 王楠 曹利利 《动物医学进展》 北大核心 2025年第2期79-85,共7页

为建立可视化检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的酶促恒温扩增-侧向流动试纸(ERA-LFD)方法,根据IBRV gB基因的保守区域设计并筛选最佳引物和探针,通过优化反应条件建立IBRV ERA-LFD方法,并对其特异性、敏感性、重复性和符合性进行评估。... 为建立可视化检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的酶促恒温扩增-侧向流动试纸(ERA-LFD)方法,根据IBRV gB基因的保守区域设计并筛选最佳引物和探针,通过优化反应条件建立IBRV ERA-LFD方法,并对其特异性、敏感性、重复性和符合性进行评估。结果显示,采用建立的方法检测牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、多杀性巴氏杆菌、弓形虫均无交叉反应,特异性强;建立方法最低检出IBRV阳性质粒的量为1.63×10^(1) copies/μL,比PCR方法高100倍,敏感性高;对相同样品进行批间和批内检测,结果均一致,重复性好;ERA-LFD与PCR方法检出的符合率为96%,且测序证实ERA-LFD检测结果无误。IBRV ERA-LFD的临床样本检测结果显示阳性率为2.08%,与PCR方法的结果相一致,说明IBRV ERA-LFD方法适于临床样品检测,为IBRV的临床快速检测和流行病学调查提供了工具。 展开更多

关键词 牛传染性鼻气管炎病毒 酶促恒温扩增 侧向流动试纸 检测方法

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ERA实时荧光法快速检测乙肝病毒的建立与应用

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作者 翁兴墉 邹林涛 +3 位作者 周璇 唐红花 何军 邓仲良 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期112-117,共6页

基于酶促重组等温扩增(ERA)技术构建一种快速检测乙肝病毒的实时荧光检测方法。根据乙肝病毒聚合酶编码区(P区)保守序列设计引物和探针,对引物、温度、荧光探针浓度等反应条件进行优化,建立ERA实时荧光法最佳反应体系,再对其敏感性、特... 基于酶促重组等温扩增(ERA)技术构建一种快速检测乙肝病毒的实时荧光检测方法。根据乙肝病毒聚合酶编码区(P区)保守序列设计引物和探针,对引物、温度、荧光探针浓度等反应条件进行优化,建立ERA实时荧光法最佳反应体系,再对其敏感性、特异性、抗干扰能力、临床样本检出效果进行验证。结果显示:ERA实时荧光法在42℃、20 min内可完成对乙肝病毒的检测,最低检出限为102 copies/μL;除乙肝病毒外,其他4种病毒(甲肝病毒、丙肝病毒、EB病毒、巨细胞病毒)均未产生荧光扩增曲线,具有良好的特异性和抗干扰能力;以实时荧光PCR法检测结果为标准,ERA实时荧光法检测58份乙肝病毒临床样本的灵敏度为97.37%、特异度为100%、阴性预测值为95.24%、阳性预测值为100%、Kappa值为0.96。成功建立了一种简单、快速、灵敏、特异、低成本的乙肝病毒早期检测方法,满足乙肝病毒快速检测的需要。 展开更多

关键词 酶促重组等温扩增技术 快速检测 乙肝病毒 era实时荧光法 早期诊断

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核酸等温扩增方法在食品安全检测中的应用综述 被引量：2

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作者 郭雨湄 贾振军 刘瑞 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第11期435-448,共14页

随着全球食品安全问题日益严重,开发快速且灵敏的检测技术显得尤为重要。核酸等温扩增技术因其高效、快速和操作简便的特点,在食品安全检测领域中的重要性日益凸显。该文系统阐释了环介导等温扩增技术、滚环扩增技术、重组酶聚合酶扩增... 随着全球食品安全问题日益严重,开发快速且灵敏的检测技术显得尤为重要。核酸等温扩增技术因其高效、快速和操作简便的特点,在食品安全检测领域中的重要性日益凸显。该文系统阐释了环介导等温扩增技术、滚环扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术、酶促重组等温扩增技术、等温链置换技术、核酸多臂引物和环优化技术等核酸等温扩增技术在食品安全检测领域的应用现状,涵盖主要类型、基本原理、具体应用、与其他技术结合的优势以及未来发展趋势。通过分析近年来的研究成果,旨在为食品安全检测领域提供新的思路和参考,进一步促进相关技术的发展与应用。 展开更多

关键词 环介导等温扩增技术 滚环扩增技术 重组酶聚合酶扩增技术 酶促重组等温扩增技术 等温链置换技术 核酸多臂引物和环优化技术 食品安全检测

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婴儿配方乳粉中食源性致病菌双重ERA快速检测方法的建立 被引量：8

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作者 林志伟 王帅 +5 位作者 王迎春 吴占文 李涛 李红娜 杨艳歌 袁飞 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2023年第18期347-354,共8页

为快速多重筛查婴儿配方乳粉中食源性致病菌的污染情况,建立克罗诺杆菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌及金黄色葡萄球菌双重酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)快速检测方法。首先,通过筛选确定对4种食源性... 为快速多重筛查婴儿配方乳粉中食源性致病菌的污染情况,建立克罗诺杆菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌及金黄色葡萄球菌双重酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)快速检测方法。首先,通过筛选确定对4种食源性致病菌特异性好、扩增效率高的引物探针。经过优化建立两组双重ERA检测体系可快速筛查4种食源性致病菌。该方法对沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌及金黄色葡萄球菌的检出限均为10^(-2) ng/μL;对克罗诺杆菌的检出限为1 ng/μL。模拟污染实验显示,污染量为1 CFU/mL的样品增菌培养6 h后,可检出4种致病菌。应用该方法对市售婴儿配方乳粉样品进行检测,检测结果与行业标准规定的实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法一致,证实了本研究建立的双重ERA检测方法的准确性和可靠性。采用本方法仅需20 min左右即可一次性检出4种致病菌,相较于传统的“金标准”方法以及实时荧光PCR法显著提高了检测效率,对于推进食源性致病菌的快速筛查具有重要意义。 展开更多

关键词 酶促等温扩增技术 克罗诺杆菌 沙门氏菌 单核细胞增生李斯特菌 金黄色葡萄球菌

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GI和GII诺如病毒ERA的可视化快速检测 被引量：1

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作者 杨艳歌 吴占文 +4 位作者 李涛 王帅 李红娜 孙冬梅 袁飞 《华南理工大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2023年第12期140-151,共12页

诺如病毒(NoV)是常见的食源性病毒之一,只要极少数量的NoV就可以导致机体感染发病,但目前还没有特效的治疗药物和疫苗,因此建立快速检测方法对食品中的NoV进行早期筛查至关重要。本研究首先通过装甲RNA技术将GB 4789.42规定的GI和GII No... 诺如病毒(NoV)是常见的食源性病毒之一,只要极少数量的NoV就可以导致机体感染发病,但目前还没有特效的治疗药物和疫苗,因此建立快速检测方法对食品中的NoV进行早期筛查至关重要。本研究首先通过装甲RNA技术将GB 4789.42规定的GI和GII NoV的靶标基因包裹到MS2噬菌体的衣壳蛋白中,制成内含GI和GII NoV两联检测靶标的重组质粒参考样品,其次基于酶促等温扩增(ERA)技术,分别设计了GI和GII NoV基础型ERA和荧光型ERA检测的引物和探针,并通过试验筛选确定了最佳的引物探针组合。从而建立了GI和GII NoV检测ERA显色法和荧光法两种可视化方法,通过肉眼可直接观测结果。进一步对反应程序进行了优化,将ERA显色法和荧光法的扩增时间分别缩短至5min和8min。并通过对反应体系的优化,将体系减半,从而降低了检测成本。在此情况下,对核酸参考样品检测的最低灵敏度分别可达10^(-2)、10^(-3)ng/μL。最后将本研究建立的可视化快速检测方法应用于真实的GI和GIINoV粪便样本检测,并对方法的性能参数进行分析,结果显示:建立的GI和GII NoV ERA可视化快速检测方法特异性良好,对其他食源性病毒无交叉扩增,最低可检出10拷贝/μL的NoV,可以满足GI和GII NoV可视化快速筛查的需求。本研究方法的建立为NoV的快速筛查和风险监测提供了良好的技术支撑,对于控制NoV爆发、保障人民健康具有重要意义。 展开更多

关键词 诺如病毒 重组质粒 酶促重组等温扩增 可视化 快速检测

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基于CRISPR-Cas12a技术的呼吸道合胞病毒检测方法的建立

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作者 姚雪春 李磊 +3 位作者 王志贤 盛长忠 ZHOU Zeqi TAN Cherie S 《生物技术通报》 北大核心 2025年第1期103-109,共7页

【目的】呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是婴幼儿急性呼吸道感染的最常见原因。基于RT-ERACRISPR/Cas12a技术,建立一种RSV快速特异性的检测方法。【方法】针对RSV N基因保守区域设计合成特异性crRNA及酶促重组等温扩... 【目的】呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是婴幼儿急性呼吸道感染的最常见原因。基于RT-ERACRISPR/Cas12a技术,建立一种RSV快速特异性的检测方法。【方法】针对RSV N基因保守区域设计合成特异性crRNA及酶促重组等温扩增(ERA)引物,筛选最佳扩增引物-crRNA组合建立检测体系;通过荧光法检测RSV核酸,确定检测方法的灵敏度及特异性。【结果】根据Cas12a的激活原理,针对A型及B型RSV分别设计合成RSV-crRNA1及RSV-crRNA2,二者混合加入检测体系,可同时检测到A型及B型RSV,并具有协同作用;实验筛选出一组最佳引物组合(RSV-F+RSV-R3J),最低检出限为5×10^(2) copies/mL,可在39℃恒温条件下,35 min内完成检测;该方法与其他核酸测试样本无交叉反应,只能检测出RSV核酸,具有较高的特异性。【结论】基于RT-ERA-CRISPR/Cas12a技术,成功建立了一种灵敏度高、特异性强、快速、低成本的RSV核酸检测方法,该方法不依赖复杂的检测仪器,任何能够提供恒温环境和检测荧光信号功能的仪器均可适用。因此,该方法适用于RSV即时检测,还可能应用于其他病原体感染的检测。 展开更多

关键词 呼吸道合胞病毒 CRISPR-Cas12a技术 酶促重组等温扩增 即时检测 核酸检测

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双重荧光RT-ERA技术快速检测贝类食品中诺如病毒 被引量：5

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作者 吴占文 王帅 +6 位作者 康婕 李涛 李红娜 蔡杰 张昊 杨艳歌 袁飞 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2023年第18期355-363,共9页

目的:基于逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription-enzymatic recombinase amplification,RTERA)技术,以MS2作为模式过程控制病毒,建立一种贝类食品中GI与GII型诺如病毒(norovirus,NoV)双重荧光RT-ERA快速检测方法。方法:分别... 目的:基于逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription-enzymatic recombinase amplification,RTERA)技术,以MS2作为模式过程控制病毒,建立一种贝类食品中GI与GII型诺如病毒(norovirus,NoV)双重荧光RT-ERA快速检测方法。方法:分别将GI、GII NoV参考靶序列克隆到带有T7启动子的载体中,通过体外转录的方式获得高纯度NoV RNA参考样品。以设计的MS2噬菌体引物探针,与实验室前期筛选的GI、GII NoV引物探针进行双重荧光RT-ERA实验,并对反应体系和反应程序进行优化,分析方法的灵敏度。最后,采用建立的方法开展真实样本检测,以GB 4789.42-2016《食品微生物学检验诺如病毒检验》为参比方法进行检测结果对比,确定方法的准确性和可行性。结果:建立MS2与GI、MS2与GII两组双重荧光RT-ERA检测方法,最佳引物及探针体积分别为4.1μL与1.8μL,检测时间可缩短至10 min左右,且最低可检出102拷贝/μL的NoV核酸样品。应用所建立的方法对29份真实样品进行检测,检测结果与GB 4789.42-2016一致。结论:本研究建立的双重荧光RT-ERA检测方法可实现对MS2、GI和GII NoV的同时检测,且灵敏度高、准确性强,为今后NoV现场快速检测提供一定基础。 展开更多

关键词 诺如病毒 逆转录-酶促重组等温扩增技术 双重荧光 快速检测 贝类

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基于B646L、EP402R、MGF360/505基因的非洲猪瘟病毒ERA检测方法的建立 被引量：14

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作者 曾宇晨 龚浪 +5 位作者 王京煜 潘昊鸣 梁杏玲 马俊 张桂红 王衡 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期33-40,共8页

【目的】建立一种基于酶促重组酶扩增(Enzymatic recombinase amplification,ERA)技术的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)DNA快速检测方法。【方法】参考ASFV B646L基因、EP402R基因和多基因家族成员MGF360/505基因保守序... 【目的】建立一种基于酶促重组酶扩增(Enzymatic recombinase amplification,ERA)技术的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)DNA快速检测方法。【方法】参考ASFV B646L基因、EP402R基因和多基因家族成员MGF360/505基因保守序列,设计特异性的ERA探针和引物,经过反应条件的优化,建立42℃等温条件下检测ASFV DNA的ERA方法。【结果】ERA-ASFV-B646L、ERA-ASFV-EP402R和ERA-ASFV-MGF3个检测方法分别在16、7和13 min内即可得出检测结果;特异性强,对阳性样品拷贝数的检测下限均为102μL-1;与我国非洲猪瘟诊断技术标准中的方法对比,结果符合率为100%。【结论】本研究建立的ERA检测方法可以用于ASFV的快速检测,为流行病学调查和现场检测提供了一种快速有效的检测方法。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 酶促重组酶扩增 等温扩增 快速检测

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基于ERA-CRISPR/Cas12a-LFD的犀牛特异性检测技术 被引量：1

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作者 王瑛 张冲 +4 位作者 蔡一村 王鑫杰 林颖峥 冯之航 潘良文 《野生动物学报》 北大核心 2023年第4期798-806,共9页

野生犀牛(Rhinocerotidae)种群的生存正面临极大威胁,包括栖息地减少、碎片化及偷猎等,在对打击犀牛角等非法贸易的努力中,物种的特异性检测至关重要,为了在现场就可以迅速完成犀牛源性成分鉴定,将酶促重组等温扩增(enzymatic recombina... 野生犀牛(Rhinocerotidae)种群的生存正面临极大威胁,包括栖息地减少、碎片化及偷猎等,在对打击犀牛角等非法贸易的努力中,物种的特异性检测至关重要,为了在现场就可以迅速完成犀牛源性成分鉴定,将酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)、CRISPR/Cas12a和侧向流试纸条(lateral flow dipstick,LFD)技术相结合,研发了一种适于现场使用的犀牛特异性核酸检测方法。结果表明:该方法只能检测出5种现生犀牛特异性核酸,与其他哺乳动物核酸测试样本没有交叉反应,最低检测下限可达100拷贝/孔,具有较好的特异性和灵敏度。该方法可以在36.5~40.0℃条件下,27~30 min完成特异性识别,无需高规格的实验室环境和精密仪器,从而提供更快、更准确和更灵敏的检测方案。 展开更多

关键词 犀牛源性成分 CRISPR/Cas12a 酶促重组等温扩增 侧向流试纸条

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基于体温扩增的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种3种可视化快速检测方法的建立 被引量：1

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作者 林志伟 王帅 +5 位作者 蔡杰 聂丹丹 李涛 李红娜 杨艳歌 袁飞 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第9期219-225,共7页

为实现食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种(Burkholderia gladioli pv. cocovenenans)的快速检测,基于体温扩增技术——酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA),并根据唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种bonM... 为实现食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种(Burkholderia gladioli pv. cocovenenans)的快速检测,基于体温扩增技术——酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA),并根据唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种bonM基因序列设计和筛选了ERA检测引物和探针,分别建立ERA显色法、荧光法、试纸条法3种可视化快速检测方法,并评估其特异性和灵敏度,以及在市售样品检测适用性和准确性。结果显示,建立的方法对3株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株均有扩增,其他常见的食源性致病菌以及其他唐菖蒲伯克霍尔德氏菌均无扩增,说明检测方法的特异性良好。3种方法的检出限均为10^(-2)ng/μL,灵敏度较好。采用建立的3种可视化快速检测方法对15份市售样品进行检测,检出阳性2份,检出率为13.3%。该结果与国标方法的检测结果一致,说明方法具有较好的适用性和准确性。本研究建立的基于体温扩增技术的显色法、荧光法和试纸条法具有较高的特异性及灵敏度,37℃体温扩增15 min左右即可获取检测结果,且裸眼可视,可为食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种的现场可视化快速筛查提供新型简便的策略。 展开更多

关键词 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种 酶促等温扩增技术 可视化 快速检测

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重组酶聚合酶扩增、重组酶介导等温扩增及酶促重组等温扩增技术在食源性致病菌快速检测中的研究进展 被引量：38

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作者 王帅 杨艳歌 +4 位作者 吴占文 李红娜 李涛 孙冬梅 袁飞 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2023年第9期297-305,共9页

随着人民生活水平的提高,食品安全问题也越来越受到社会关注,其中生物(微生物)因子是影响食品安全的最主要因素。食品安全研究领域针对生物(微生物)因子的检测技术众多,其中等温扩增技术因不需依赖复杂的仪器设备,能够快速、准确地进行... 随着人民生活水平的提高,食品安全问题也越来越受到社会关注,其中生物(微生物)因子是影响食品安全的最主要因素。食品安全研究领域针对生物(微生物)因子的检测技术众多,其中等温扩增技术因不需依赖复杂的仪器设备,能够快速、准确地进行生物成分检测而被广泛应用,尤其是新发展起来的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)、重组酶介导等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术。这3种等温扩增技术相对于其他等温扩增技术具有反应条件更温和、引物设计更简单等优点,且检测原理相似,本文对这3种技术进行对比研究,从原理、概念以及近年来在食源性致病菌快速检测方面的研究应用情况进行综述,概括其在食品检测中的优势和面临的实际问题,并对未来的发展前景进行展望。 展开更多

关键词 重组酶聚合酶扩增 重组酶介导等温扩增 酶促重组等温扩增 食源性致病菌 快速检测

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重组酶扩增技术概述及应用研究进展 被引量：2

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作者 陈兴浩 李鑫 +10 位作者 沈海潇 张校培 徐丽娜 张鹤平 葛菲菲 杨显超 刘健 白艺兰 王建 杨德全 赵洪进 《中国动物检疫》 CAS 2023年第11期76-81,共6页

重组酶扩增技术是近几年快速发展起来的一类等温扩增技术,相对于传统的核酸检测方法,具有设备要求低、操作简单等优势,在现场快速检测方面有着广阔的应用前景。本文简要介绍了重组酶扩增技术的技术原理、优点和难点,重点阐述了其在病毒... 重组酶扩增技术是近几年快速发展起来的一类等温扩增技术,相对于传统的核酸检测方法,具有设备要求低、操作简单等优势,在现场快速检测方面有着广阔的应用前景。本文简要介绍了重组酶扩增技术的技术原理、优点和难点,重点阐述了其在病毒、细菌、寄生虫及其他微生物检测领域的应用研究进展,旨在为重组酶扩增技术的进一步发展与应用提供参考。 展开更多

关键词 重组酶聚合酶扩增技术 酶促重组等温扩增技术 重组酶介导等温扩增技术 多酶恒温核酸快速扩增技术

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酶促重组等温扩增实时荧光法快速检测肺炎支原体方法的建立及应用 被引量：7

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作者 胡海洋 应婉琴 +3 位作者 何军 吕芷贤 谢小平 邓仲良 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期264-270,共7页

利用酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术建立快速检测肺炎支原体的实时荧光检测方法。针对肺炎支原体P1基因设计特异性引物和探针,优化反应条件,分析其敏感性和特异性,并对临床样本进行验证。ERA实时荧光法... 利用酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术建立快速检测肺炎支原体的实时荧光检测方法。针对肺炎支原体P1基因设计特异性引物和探针,优化反应条件,分析其敏感性和特异性,并对临床样本进行验证。ERA实时荧光法在25-40℃均具有扩增能力,在35℃条件下对肺炎支原体的扩增效果最好,20 min内可完成扩增;该法对肺炎支原体的检出限为10^(3) copies/μL;并对其他6种呼吸道病原体进行检测,均无扩增曲线产生,有较好的特异性;以荧光定量PCR法检测结果为标准,ERA实时荧光法对34份临床样本的检测结果的诊断敏感度为96.15%、特异度为100%、阳性预测值为100%、阴性预测值为88.89%。本研究构建的ERA实时荧光法可以快速简单、灵敏和特异地检测出肺炎支原体,满足现场检测的需求。 展开更多

关键词 酶促重组等温扩增技术 实时荧光检测 肺炎支原体

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