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溶血性曼氏杆菌OmpA的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
1
作者 尚珂 高远集 +9 位作者 刘畅 代静蕾 丁梦豪 聂孟川 王怡轩 陈松彪 贾艳艳 郭荣显 丁轲 余祖华 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第4期376-383,共8页
为建立一种快速、高效、准确的溶血性曼氏杆菌(MH)抗体的检测方法,本研究采用生物信息学软件对MH外膜蛋白A(OmpA)的理化性质和亲/疏水性、跨膜结构和信号肽进行分析后,利用PCR扩增MH OmpA基因,构建重组表达质粒pET-32a-OmpA,经生物公司... 为建立一种快速、高效、准确的溶血性曼氏杆菌(MH)抗体的检测方法,本研究采用生物信息学软件对MH外膜蛋白A(OmpA)的理化性质和亲/疏水性、跨膜结构和信号肽进行分析后,利用PCR扩增MH OmpA基因,构建重组表达质粒pET-32a-OmpA,经生物公司测序及酶切鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞,经IPTG诱导重组OmpA蛋白(r OmpA)的表达,SDS-PAGE检测结果显示,在约57 ku处出现目的条带,且rOmpA主要以为包涵体形式表达。rOmpA表达产物经镍柱亲和层析法纯化后利用western blot鉴定,结果显示,在57.03 ku处出现特异性条带,表明r OmpA可与MH阳性血清产生良好的反应原性。以rOmpA作为包被抗原,采用方阵法通过对各反应条件的优化,初步建立MH抗体的间接ELISA检测方法。利用该方法检测多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、MH-1、MH CVCC4091(A5型)以及MH-2(A1型)阳性血清,结果显示,除MH-1、CVCC4091以及MH-2检测为阳性外,其他细菌阳性血清均为阴性结果,特异性较强。利用该间接ELISA方法检测2倍倍比稀释的待检阳性血清(1:8000~1:512000),结果显示,阳性血清稀释至1:512000时仍为阳性,敏感性较高。将同一批次和不同批次纯化的r OmpA包被ELISA板,按照该ELISA方法检测5份MH阳性血清,分析该方法的重复性。结果显示,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明该方法重复性好。采用建立的间接ELISA方法和间接血凝试验(IHA),对82份临床动物(羊、兔、鼠)血清样品检测,结果显示,间接ELISA检测方法的阳性率为47.6%,阴性率为52.4%;IHA检测方法的阳性率为45.1%,阴性率为54.9%。二者的阳性符合率为94.9%,阴性符合率为95.6%,总符合率为99.3%。另外,从鼠体内检出MH阳性率最高为75.0%,表明本研究建立的间接ELISA方法可以用于临床样品的检测。该检测方法的建立为临床MH抗体的检测提供可靠的技术手段,为MH的流行病学调查等奠定了基础。 展开更多
关键词 溶血性曼氏杆菌5型 外膜蛋白A 原核表达 小鼠 间接elisa
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抗营养因子大豆凝集素夹心ELISA检测方法的建立
2
作者 胡骁飞 杨继飞 +3 位作者 邢云瑞 庞杏豪 孙亚宁 魏凤仙 《西北农业学报》 北大核心 2025年第1期133-139,共7页
为建立灵敏、特异的大豆凝集素(soybean agglutinin,SBA)酶联免疫吸附(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测方法。试验以SBA鼠源单克隆抗体为捕获抗体,SBA兔源多克隆抗血清为检测抗体,羊抗兔酶标抗体为二抗,通过对抗体的工... 为建立灵敏、特异的大豆凝集素(soybean agglutinin,SBA)酶联免疫吸附(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测方法。试验以SBA鼠源单克隆抗体为捕获抗体,SBA兔源多克隆抗血清为检测抗体,羊抗兔酶标抗体为二抗,通过对抗体的工作浓度及反应时间优化,建立SBA的双抗体夹心ELISA检测方法,并用建立的方法检测大豆、大豆粕、膨化大豆粕及酶解大豆粕中SBA含量。结果表明:建立SBA双抗夹心ELISA检测方法的检测范围为39.06~1250 ng/mL,检出限为3.00 ng/mL,样品添加回收率为77.96%~116.15%,变异系数为6.11%~18.34%,与大豆中胰蛋白酶抑制因子BBI、KTI,大豆球蛋白glycinin及大豆伴球蛋白-conglycinin等其他抗营养因子均无交叉反应。大豆中SBA含量显著高于大豆粕、膨化大豆粕及酶解大豆粕(P<0.05);大豆粕中SBA含量显著高于膨化大豆粕及酶解大豆粕(P<0.05);膨化大豆粕显著高于酶解大豆粕中SBA含量(P<0.05)。综上,本研究建立了灵敏度高、特异性好的SBA双抗夹心ELISA检测方法,该方法可用于饲料中大豆凝集素的监控检测。 展开更多
关键词 大豆凝集素 抗营养因子 多克隆抗体 单克隆抗体 夹心elisa
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新城疫病毒HN蛋白的截短表达及间接ELISA方法建立
3
作者 魏玲 王思怡 +4 位作者 熊荣园 梁洪 王怀禹 李彩虹 杨国淋 《家畜生态学报》 北大核心 2025年第3期91-95,共5页
为了建立一种快速的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)抗体检测方法,试验采用原核表达技术表达HN蛋白,以HN蛋白为检测抗原建立酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法。结果表明,获得了以包涵体形式表... 为了建立一种快速的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)抗体检测方法,试验采用原核表达技术表达HN蛋白,以HN蛋白为检测抗原建立酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法。结果表明,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,间接ELISA方法检测6种其它鸡病阳性血清均为阴性,其最低抗体检出效价为1∶10240,其与血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition,HI)方法的阳性和阴性符合率分别为98.08%和92.31%,检测临床样品阳性率为91.48%。说明建立的间接ELISA方法可用于NDV免疫抗体检测和疫苗免疫效果评价。 展开更多
关键词 新城疫病毒 HN蛋白 截短表达 间接elisa 抗体检测
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禽白血病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用
4
作者 苏晓月 吕转平 +2 位作者 沈亚安 赵明明 唐思静 《家畜生态学报》 北大核心 2025年第1期64-69,共6页
为了建立一种禽白血病病毒(ALV)抗体检测方法,利用原核表达禽白血病病毒的p27蛋白建立一种检测ALV抗体的间接ELISA方法。结果显示,p27蛋白以包涵体形式表达,Western blot检测显示p27蛋白具有良好的反应活性,以p27蛋白为包被抗原建立的间... 为了建立一种禽白血病病毒(ALV)抗体检测方法,利用原核表达禽白血病病毒的p27蛋白建立一种检测ALV抗体的间接ELISA方法。结果显示,p27蛋白以包涵体形式表达,Western blot检测显示p27蛋白具有良好的反应活性,以p27蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法检测NDV、IBDV、IBV、AIV-H9、ILTV阳性血清均为阴性,最低抗体检出效价为1︰12800,与进口试剂盒的符合率为94.87%,检测临床血清样品的阳性率为14.02%。结果说明该研究建立的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、符合性好,可为ALV的检测和净化等提供一种简单快速的方法。 展开更多
关键词 禽白血病病毒 间接elisa方法 抗体检测 净化
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鸡传染性喉气管炎病毒抗原双抗夹心ELISA方法的建立
5
作者 谢晶 于吉锋 +12 位作者 肖璐 吴学婧 叶勇刚 魏勇 李兴玉 曹冶 潘梦 毛从剑 杨竣雁 叶健强 曾子轩 康玮笠 康润敏 《中国动物检疫》 2025年第6期99-105,127,共8页
为建立鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)抗原的检测方法,利用ILTV gJ蛋白的2株单克隆抗体,1株用作捕获抗体,另1株经辣根过氧化物酶(HRP)标记后用作检测抗体,采用棋盘法优化反应条件,建立了一种检测ILTV抗原的双抗夹心ELISA方法,并对其进行了... 为建立鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)抗原的检测方法,利用ILTV gJ蛋白的2株单克隆抗体,1株用作捕获抗体,另1株经辣根过氧化物酶(HRP)标记后用作检测抗体,采用棋盘法优化反应条件,建立了一种检测ILTV抗原的双抗夹心ELISA方法,并对其进行了性能评估。结果显示:捕获抗体的最佳包被质量浓度为2μg/m L,酶标单克隆抗体的最适稀释度为1:4 000;临界值为0.295 6,当待测样品OD_(450 nm)值大于0.295 6且P/N值大于2时,判为阳性;建立的双抗夹心ELISA方法可特异性检测ILTV抗原,而对其他禽类常见抗原的检测结果均为阴性;最低检测限为49.4 ELD_(50)/0.1 mL,批内和批间变异系数均小于10%。48份临床样品的检测结果显示,该方法与行业标准中PCR方法的符合率为93.75%。结果表明,本研究建立的ILTV双抗夹心ELISA方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于ILTV抗原检测。该方法的建立为该病的检测、监测以及防控提供了技术支撑。 展开更多
关键词 鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV) 单克隆抗体 双抗夹心elisa
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非洲猪瘟病毒抗体阻断ELISA法测量不确定度评估
6
作者 柴娟 张璐 +10 位作者 董建斐 周丰超 王雅婷 孙仁杰 陈文静 黄晓兵 冯肖肖 黄靖 郑方宇 谢荣辉 张传亮 《中国动物检疫》 2025年第5期120-124,共5页
为了评估阻断ELISA方法检测结果的可靠性,使用阻断ELISA方法检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体,并分别使用“影响因素分析”法和“对照样品”法对试验进行测量不确定度评估。“影响因素分析”法和“对照样品”法评估的扩展不确定度(U)分别为0.... 为了评估阻断ELISA方法检测结果的可靠性,使用阻断ELISA方法检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体,并分别使用“影响因素分析”法和“对照样品”法对试验进行测量不确定度评估。“影响因素分析”法和“对照样品”法评估的扩展不确定度(U)分别为0.053 0和0.044 2 (k=2),表明在控制好移液器、培养箱和酶标仪等仪器引入的不确定度基础上,ELISA方法检测ASFV抗体的整体不确定度相对较低。两种方法评估的不确定度值差异不显著,使用“影响因素分析”法可以通过分析各分量在测量结果中的相对贡献,得到影响结果的关键因素,并进行改进;使用“对照样品”法可减少大量计算过程,操作更简单。ASFV抗体ELISA试验判定引入不确定度,可以提高结果的准确性,有利于进一步完善兽医检测领域不确定度评估体系。 展开更多
关键词 elisa 非洲猪瘟病毒抗体 测量不确定度 “影响因素分析”法 “对照样品”法
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一种快速精准检测各种乳品中牛乳铁蛋白含量的广适性ELISA方法
7
作者 张婧 朱孔迪 +3 位作者 刘传铭 刘长振 王鹏杰 黄家强 《中国乳业》 2025年第3期91-99,共9页
[目的]验证夹心法ELISA技术是否可成为包括风味发酵乳在内的各种乳制品中牛乳铁蛋白含量的精准检测方法。[方法]利用优化的夹心法ELISA检测试剂分别检测牛乳铁蛋白(LTF)标准品溶液、巴氏杀菌乳样本、加标巴氏杀菌乳样本、12种北京地区... [目的]验证夹心法ELISA技术是否可成为包括风味发酵乳在内的各种乳制品中牛乳铁蛋白含量的精准检测方法。[方法]利用优化的夹心法ELISA检测试剂分别检测牛乳铁蛋白(LTF)标准品溶液、巴氏杀菌乳样本、加标巴氏杀菌乳样本、12种北京地区市场常见的风味发酵乳、7种加标风味发酵乳、7种混合巴氏杀菌乳的风味发酵乳中牛乳铁蛋白含量,计算加标回收率及CV值。用该检测试剂检测3种加标风味发酵乳中牛乳铁蛋白对72℃热处理的敏感度;并与牛乳铁蛋白国标检测(高效液相色谱法)方法对比检测生乳和巴氏灭菌乳。[结果]该检测试剂可检测牛乳铁蛋白(LTF)标准品溶液和巴氏杀菌乳样本中牛乳铁蛋白,且加标回收率91.7%~106.4%。经检测,12种风味发酵乳中牛乳铁蛋白含量为无;7种加标风味发酵乳的加标回收率86.3%~109.1%,且检测CV值远低于12%;7种风味发酵乳与巴氏杀菌乳混合乳中牛乳铁蛋白含量与对照组比值在92.3%~110.5%,且大多数检测CV值远低于12%;3种加标风味发酵乳中牛乳铁蛋白含量随72℃加热时间延长而降低,且下降曲线相似。与国家标准方法对比分析,夹心法ELISA方法检测生乳和巴氏杀菌乳乳铁蛋白含量的符合率分别为97.54%、111.2%,说明该检测方法的准确性达到国标标准。[结论]夹心法ELISA检测试剂可精准检测风味发酵乳中牛乳铁蛋白含量。 展开更多
关键词 牛乳铁蛋白 风味发酵乳 夹心法elisa
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施马伦贝格病毒N蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
8
作者 李阳 孙睿雪 +3 位作者 陈天杰 刘思彤 曹家慧 赵建军 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第8期3877-3887,共11页
[目的]建立一种具有良好特异性和敏感性的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)抗体间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)检测方法。[方法]将SBV N蛋白编码基因全长序列克隆至pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET-28a-SBV,利用大肠杆菌... [目的]建立一种具有良好特异性和敏感性的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)抗体间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)检测方法。[方法]将SBV N蛋白编码基因全长序列克隆至pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET-28a-SBV,利用大肠杆菌表达系统表达目的蛋白并用His镍柱进行纯化,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,以纯化的SBV N蛋白作为检测抗原进行包被,建立一种iELISA方法,并对其包被条件、封闭液、封闭时间和血清孵育时间等反应条件进行优化,检测其阴阳性临界值、特异性、灵敏性和重复性。[结果]SDS-PAGE结果显示,SBV N蛋白分子质量为30 ku;Western blotting结果显示,纯化后SBV N蛋白与SBV阳性血清能产生特异性反应。本研究建立的SBV iELISA检测方法最佳条件为:SBV N抗原包被浓度4μg/mL、4℃包被12 h、1%明胶37℃封闭1 h、血清稀释度为1:200、37℃孵育1 h、1:6 000稀释的酶标二抗37℃孵育1 h,其阴阳性临界值为0.371。该iELISA检测方法仅与SBV阳性血清产生特异性反应,与牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和阿卡斑病毒(AKAV)阳性血清均无明显交叉反应,灵敏性较高,SBV阳性血清稀释度为1:1280时仍有明显反应。批间重复试验和批内重复试验变异系数均<10%;与商品化试剂盒相比,其总符合率为94.57%。[结论]本研究建立了一种以SBV N蛋白为检测抗原的SBV iELISA方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,能运用于SBV血清学检测,试验结果为SBV的快速诊断提供更多选择。 展开更多
关键词 施马伦贝格病毒(SBV) N蛋白 间接elisa(ielisa) 原核表达
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绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白原核表达及ELISA方法建立 被引量：1
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作者 陈思宇 张梦洁 +12 位作者 田睿 陈益 刘镝钺 李文良 毛立 程子龙 杨蕾蕾 孙敏 张纹纹 杜改梅 储岳峰 王金泉 刘茂军 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期97-105,共9页
绵羊肺炎支原体(Mo)是引起规模化羊场呼吸道病的主要病原,危害严重;快速特异诊断是防控该病的保障。本文旨在建立一种检测Mo血清抗体的间接ELISA方法,利用大肠杆菌的密码子偏好性优化Mo EF-Tu基因序列进行原核表达,纯化出高纯度重组rEF... 绵羊肺炎支原体(Mo)是引起规模化羊场呼吸道病的主要病原,危害严重;快速特异诊断是防控该病的保障。本文旨在建立一种检测Mo血清抗体的间接ELISA方法,利用大肠杆菌的密码子偏好性优化Mo EF-Tu基因序列进行原核表达,纯化出高纯度重组rEF-Tu蛋白,以纯化的rEF-Tu为包被抗原,建立Mo间接ELISA抗体检测方法。结果显示,原核表达的EF-Tu蛋白分子质量约为45.4 kDa,与预期相符;Western blot证实具有良好的反应原性;建立的间接ELISA方法最佳优化条件显示,包被抗原浓度为1.25 mg/L,37℃孵育2 h;封闭条件为30 g/L BSA,37℃孵育1 h;待检血清1∶100稀释,37℃孵育45 min;酶标二抗1∶20000稀释,37℃孵育30 min;底物TMB 37℃避光反应15 min;样品OD450值≥0.296时判定为阳性,OD450值≤0.265时判定为阴性,OD 450值0.265~0.296则判为可疑;组内和组间变异系数均低于10%;用该方法与实验室所建Mo全菌蛋白间接ELISA检测方法对233份血清进行检测,两者特异性为90.70%,敏感性为82.69%,符合率约为87.12%。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA方法具有良好的敏感性、重复性及特异性,为Mo的临床诊断、抗体监测等提供简单快速的血清学诊断方法,也为Mo抗体检测试剂盒的开发奠定了基础。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 EF-Tu蛋白 原核表达 间接elisa
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猪轮状病毒VP6蛋白截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：1
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作者 潘向英 曾智勇 +7 位作者 梁海英 汤德元 王彬 叶泥 田红利 边孟婷 柳佳佳 黄书 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第3期1231-1240,共10页
【目的】通过构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)VP6截短蛋白(第177—382位氨基酸)的原核表达系统,建立检测PoRV抗体的间接ELISA方法,为PoRV血清学监测提供检测手段。【方法】设计1对针对截短VP 6基因的特异性引物,以pMD19-T-VP6... 【目的】通过构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)VP6截短蛋白(第177—382位氨基酸)的原核表达系统,建立检测PoRV抗体的间接ELISA方法,为PoRV血清学监测提供检测手段。【方法】设计1对针对截短VP 6基因的特异性引物,以pMD19-T-VP6重组质粒为模板扩增VP 6截短基因。利用pET-32a(+)原核表达载体构建pET32a-PoRV-VP6重组质粒。以大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞为宿主菌,对重组质粒进行诱导表达,并优化表达条件。利用His标签镍柱对pET32a-PoRV-VP6重组蛋白进行纯化,以此作为包被抗原,通过单一变量法优化抗原包被浓度、血清稀释度、二抗稀释度及一抗、二抗孵育时间等工作条件。确定间接ELISA方法的阴阳性临界值,检验其特异性、敏感性、重复性及符合性,并对2021—2024年采自贵州地区不同猪场的384份临床猪血清进行检测。【结果】试验成功构建pET32a-PoRV-VP6重组表达载体,实现VP6蛋白的原核截短表达,蛋白分子质量大小约40 ku,具有良好的反应原性。对间接ELISA方法条件进行优化,确定VP6包被抗原最佳浓度为2μg/mL、阳性血清稀释度为1∶100、血清样品和二抗孵育时间均为60 min、TMB反应时间为10 min、阴阳性临界值(D 450 nm)为0.410。建立的间接ELISA方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪冠状病毒(PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒标准阳性血清不发生反应,特异性强;批内和批间重复试验变异系数均<10%,重复性好;与PoRV A型ELISA抗体检测试剂盒的总体符合率为96.80%。间接ELISA方法检测临床384份猪血清样品结果显示,样品总阳性率为28.91%。【结论】本研究成功实现了PoRV VP6蛋白的截短表达,并建立了PoRV间接ELISA抗体检测方法,适用于临床PoRV抗体检测和疫苗免疫效果评价。 展开更多
关键词 猪轮状病毒(PoRV) VP6蛋白 截短表达 间接elisa
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IBDV单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立
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作者 姜艳平 刘薇 +6 位作者 宫浩阳 蔡李萌 李佳璇 崔文 周晗 韩建春 唐丽杰 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第7期3433-3441,共9页
旨在建立一种快速有效的检测鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的方法,本研究以IBDV全病毒作为免疫原制备单克隆抗体,以获得的单抗6G3作为捕获抗体,单抗4C12作为检测抗体,建立检测IBDV的双抗体夹心ELISA方法。结果表明,该ELISA方法具有良好的... 旨在建立一种快速有效的检测鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的方法,本研究以IBDV全病毒作为免疫原制备单克隆抗体,以获得的单抗6G3作为捕获抗体,单抗4C12作为检测抗体,建立检测IBDV的双抗体夹心ELISA方法。结果表明,该ELISA方法具有良好的特异性,与REV、AEV、ALV和EDSV均无交叉反应;能检测病毒的最小量为1.585×10^(3) ELD50;批间和批内重复性试验显示,该方法具有良好的重复性;通过该方法对49份临床样品进行检测,与商品化的IBDV抗原检测卡进行比较,符合率达94.18%。综上,本研究建立的双抗体夹心ELISA方法,具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于IBDV的快速检测,为制备商品化的IBDV检测试剂盒奠定基础。 展开更多
关键词 传染性法氏囊病毒 单克隆抗体 检测方法 双抗体夹心elisa
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A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体制备与竞争ELISA方法的建立
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作者 何启杰 农作荣 +7 位作者 王豪 牛晨霞 莫勇芳 欧阳康 陈樱 黄伟坚 黄稳妃 韦祖樟 《动物医学进展》 北大核心 2025年第2期23-29,共7页
依据A型塞内卡病毒(SVA)结构蛋白VP2基因序列构建原核表达质粒pET-30a-VP2,经转化和诱导,表达出VP2重组蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔,采集血清获得VP2的多克隆抗体。用间接ELISA方法测定血清中VP2抗体效价,并用Western blot与IFA验证其... 依据A型塞内卡病毒(SVA)结构蛋白VP2基因序列构建原核表达质粒pET-30a-VP2,经转化和诱导,表达出VP2重组蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔,采集血清获得VP2的多克隆抗体。用间接ELISA方法测定血清中VP2抗体效价,并用Western blot与IFA验证其特异性。随后建立竞争ELISA方法,并对实验室收集的2016-2019年广西11个地区64个规模猪场592份猪血清进行SVA抗体检测。结果显示,诱导表达出的重组VP2蛋白主要以可溶性形式表达,血清中VP2抗体效价大于1∶64000,且制备的VP2抗体能特异结合SVA感染细胞中的VP2蛋白。竞争ELISA检测结果显示广西地区猪场SVA血清阳性率高达76.6%,血清样品阳性率高达55.9%,研究结果为SVA的检测和研究奠定了基础。 展开更多
关键词 A型塞内卡 VP2蛋白 原核表达 多克隆抗体 竞争elisa
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基于牛分枝杆菌融合蛋白ESAT6-CFP10-TB27.4间接ELISA检测方法的建立
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作者 姜美奇 赵文娟 +11 位作者 许淑芸 魏京京 黎雪勤 徐雪可 周霞 吴桐忠 王莉莉 韩猛立 张星星 张倩 钟发钢 黄新 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第5期480-486,515,共8页
为建立检测牛分枝杆菌(MB)抗体的间接ELISA方法,本研究选取MB ESAT6、CFP10和TB27.4基因,通过柔性linker(GGGGS)连接,克隆至pET-32a载体,构建重组质粒pET-32a-EC-27.4,经双酶切及测序鉴定正确后,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),并在不同温... 为建立检测牛分枝杆菌(MB)抗体的间接ELISA方法,本研究选取MB ESAT6、CFP10和TB27.4基因,通过柔性linker(GGGGS)连接,克隆至pET-32a载体,构建重组质粒pET-32a-EC-27.4,经双酶切及测序鉴定正确后,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),并在不同温度和时间下经IPTG诱导表达并超声破碎。采用镍亲和层析方法纯化重组EC-27.4蛋白(rEC-27.4)后,通过SDS-PAGE检测rEC-27.4的表达及纯化效果,采用western blot检测其反应原性。SDS-PAGE结果显示,当IPTG浓度为0.3 mmol/L,温度为16℃时,诱导rEC-27.4的表达量最高且其以可溶性形式表达,且纯化后在75 ku处出现单一目的条带。Western blot结果显示在75 ku处出现特异性条带。经BCA试剂盒测定rEC-27.4的浓度为0.852 mg/mL。以纯化的该重组蛋白作为包被抗原,采用棋盘法优化各反应条件,初步建立检测MB抗体的间接ELISA方法。采用优化后的间接ELISA方法分别检测MB阳性和阴性血清以及沙门氏菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、副结核分枝杆菌、结核分枝杆菌、布鲁氏菌和牛病毒性腹泻病毒等阳性牛血清,评估该方法的特异性;将MB阳性血清2倍倍比稀释(1:50~1:6400)后,采用本研究建立的间接ELISA方法检测,评估该方法的敏感性;以同批次和不同批次表达的rEC-TB27.4分别包被ELISA板,采用优化的间接ELISA方法检测5份MB阳性血清和3份阴性血清,评估该方法的重复性。结果显示,该方法仅能检测到MB阳性血清,其他相关细菌及病毒阳性血清均为阴性结果;牛分枝杆菌阳性血清1:400稀释时仍为阳性结果;该方法对8份血清的批内、批间重复性试验的变异系数均小于7%。采用建立的间接ELISA方法检测377份临床牛血清样品,并同时采用动物结核分枝杆菌夹心ELISA抗体检测试剂盒及PPDB皮肤试验(TST)和BTB IFN-γ释放试验(IGRA)检测,结果显示,该间接ELISA方法的阳性检测率为6.90%(26/377),阴性样品数为351份;夹心ELISA试剂盒的阳性检测率为7.43%(28/377),阴性样品数为349份;TST和IGRA的阳性检测率均为52.52%(198/377),阴性样品数均为179份。本研究建立的间接ELISA与夹心ELISA抗体检测试剂盒的阳性和阴性符合率分别为53.6%和96.8%;与TST和IGRA的阳性和阴性符合率均为11.1%和97.8%。本研究基于MB r EC-27.4建立的间接ELISA抗体检测方法特异性较强、敏感性较高、重复性较好,在MB所致牛结核的早期检测中有一定的优势,为牛结核的检测和早期诊断提供了新的技术手段。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 ESAT6-CFP10-TB27.4融合蛋白 原核表达 间接elisa
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猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用
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作者 曾苗苗 杨小曼 +9 位作者 张鑫 刘大凯 时洪艳 张记宇 张燎原 陈建飞 冯廷帅 李修文 石达 冯力 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第1期319-326,共8页
为建立一种猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)血清抗体的快速检测方法,本研究首先经PCR扩增SADS-CoV N基因,纯化鉴定后克隆至表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-N。重组N蛋白诱导表达并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用... 为建立一种猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)血清抗体的快速检测方法,本研究首先经PCR扩增SADS-CoV N基因,纯化鉴定后克隆至表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-N。重组N蛋白诱导表达并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,以兔抗猪HRP-IgG作为二抗,利用方阵滴定法优化各反应条件,建立了一种以SADS-CoV N蛋白为靶标的检测SADS-CoV血清抗体的间接ELISA方法,并对此方法的敏感性、特异性、重复性及临床应用价值进行鉴定。SDS-PAGE及Western blot结果显示,重组表达的N蛋白约为70 ku,且具有良好的反应原性。采用该方法检测SADS-CoV阳性血清抗体效价可达1∶3 200,并且与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪圆环病毒(PCV)阳性血清均无交叉反应,具有良好的敏感性和特异性。批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,具有较好的重复性。利用该方法和间接免疫荧光方法(IFA)分别对50份猪临床血清样品进行检测,结果显示二者的总符合率为98%。综上,本研究建立了一种基于SADS-CoV N蛋白的间接ELISA抗体检测方法,可用于临床SADS-CoV血清抗体检测以及流行病学的监测,对防控SADS-CoV的流行具有重要意义。 展开更多
关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV) N蛋白 原核表达 间接elisa
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猪IL-15单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立
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作者 王飞燕 刘超凡 +5 位作者 张亚楠 周晓甜 任静 袁晨 李潭清 宋勤叶 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第7期3442-3452,共11页
旨在制备猪白细胞介素-15(IL-15)的单克隆抗体(McAb),建立IL-15-ELISA定量检测方法。首先构建猪IL-15原核表达载体pET-28a-IL-15,应用大肠杆菌原核表达系统表达该重组蛋白,随后用其免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠,在加强免疫后第3天,分离小... 旨在制备猪白细胞介素-15(IL-15)的单克隆抗体(McAb),建立IL-15-ELISA定量检测方法。首先构建猪IL-15原核表达载体pET-28a-IL-15,应用大肠杆菌原核表达系统表达该重组蛋白,随后用其免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠,在加强免疫后第3天,分离小鼠脾细胞,将脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞,并对其分泌的IL-15单克隆抗体进行鉴定;然后基于单克隆抗体建立IL-15夹心ELISA方法。结果显示:获得9株分泌抗IL-15 McAb的杂交瘤细胞(1E8、1F4、2D3、2C10、2F3、2D10、3F4、3D4、3D5),分泌的抗体均为IgG2bκ型。以制备的单抗2D10和2C10分别为捕获抗体及酶标抗体建立的夹心ELISA最低可检测31.25 ng·mL^(-1)的IL-15蛋白,与其它细胞因子或蛋白(IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、Gzms-B、IFN-γ、TNF-α)无交叉反应,批内和批间重复的变异系数分别为2.56%和3.39%。该夹心ELISA可定量检测血清、组织液和细胞培养物等样品中的IL-15。综上,成功制备了猪IL-15单克隆抗体,建立了定量检测IL-15的双抗体夹心ELISA方法,为IL-15相关研究提供了重要工具。 展开更多
关键词 猪IL-15 单克隆抗体 双抗体夹心elisa 定量检测
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动物结核分枝杆菌复合群间接ELISA诊断方法的建立
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作者 庄勇 向蒙 +6 位作者 冯桂丹 杨显超 夏炉明 肖文轩 张蒙 王建 张鹭 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期125-133,共9页
本研究通过前期已构建好一些优势抗原的表达载体库,以生物信息学工具分析候选抗原的理化性质、二级结构、B细胞抗原表位,选择优势抗原,以纯化后的融合抗原ECX作为包被抗原,将HRP标记的Protein G作为酶标的二抗,成功建立了一种用于多动... 本研究通过前期已构建好一些优势抗原的表达载体库,以生物信息学工具分析候选抗原的理化性质、二级结构、B细胞抗原表位,选择优势抗原,以纯化后的融合抗原ECX作为包被抗原,将HRP标记的Protein G作为酶标的二抗,成功建立了一种用于多动物结核分枝杆菌复合群间接ELISA诊断的方法。该方法适用于实验室样品批量检测,其敏感性为0.912,特异性为0.949。应用本研究建立的动物结核分枝杆菌间接ELISA法和商品化动物结核分枝杆菌夹心ELISA抗体检测试剂盒共检测犬、猫、野生动物、SPF实验动物血清共552份。其中间接ELISA方法共检出6份血清抗体阳性,阳性检出率为1.09%(6/552);商品化夹心法试剂盒共检出8份血清抗体阳性,阳性检出率为1.45%(8/552);两者之间阳性重合数为6份,阳性重合率为85.72%(6/7);阴性重合数为544份,阴性重合率为99.82%(544/545)。结果表明,两种诊断方法的检测结果具有较高的一致性。本方法的建立,与国外商品化试剂盒比较,不但有望实现这类检测产品的国产替代,同时实现了一种方法对不同物种来源血清的快速检测。 展开更多
关键词 抗原 结核分枝杆菌复合群 ECX 间接elisa
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布鲁氏菌双抗夹心ELISA检测方法的建立与初步验证
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作者 姚梦欣 彭泽宇 +5 位作者 任文浩 徐艺玫 郭伟 陈创夫 马忠臣 王勇 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第3期255-262,共8页
目的 建立灵敏、特异的布鲁氏菌双抗体夹心ELISA检测方法。方法 筛选用于布鲁氏菌检测的单克隆捕获抗体和检测抗体,优化并确定最佳抗体包被时间和浓度,最佳封闭液、封闭时间和阴阳性临界值;通过检验其他易与布鲁氏菌发生交叉反应的细菌... 目的 建立灵敏、特异的布鲁氏菌双抗体夹心ELISA检测方法。方法 筛选用于布鲁氏菌检测的单克隆捕获抗体和检测抗体,优化并确定最佳抗体包被时间和浓度,最佳封闭液、封闭时间和阴阳性临界值;通过检验其他易与布鲁氏菌发生交叉反应的细菌来验证该方法的特异性;通过对灭活布鲁氏菌梯度稀释液的检测,验证该方法的灵敏性;将该夹心ELISA检测结果与试管凝集和qPCR检测结果进行比较。结果 筛选出的捕获抗体为4A12,检测抗体为6C12。试验分析显示,捕获抗体4A12的最佳包被浓度为5μg/mL,检测抗体6C12的最佳稀释比为1∶2 000。该研究的最佳包被条件为4℃过夜、5%脱脂奶粉封闭、封闭时间2 h。该研究建立的双抗体夹心ELISA方法只与布鲁氏菌发生反应,与其他细菌未发生反应;布鲁氏菌灭活菌液浓度稀释到1×10^(5) CFU/mL时仍能检测出。批内、批间变异系数均小于10%。结论 该研究成功建立了布鲁氏菌双抗夹心ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性与灵敏性,为布鲁氏菌病的精确诊断和有效防控提供有效途径。 展开更多
关键词 单克隆抗体 布鲁氏菌 双抗夹心elisa法 诊断
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弓形虫GRA1蛋白表达及间接ELISA检测方法的建立
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作者 张翩 陈晶 +8 位作者 张晓晓 麦小鹏 唐科 向华 王刚 罗胜军 马惠海 袁子国 王晓虎 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第7期3308-3320,共13页
【目的】通过原核系统表达弓形虫GRA1蛋白,并建立其抗体间接ELISA(iELISA)检测方法,为猪弓形虫抗体检测提供材料。【方法】构建重组质粒pET-28a-GRA1,利用大肠杆菌表达系统表达GRA1蛋白,并用His镍柱进行GRA1蛋白纯化,经Western blottin... 【目的】通过原核系统表达弓形虫GRA1蛋白,并建立其抗体间接ELISA(iELISA)检测方法,为猪弓形虫抗体检测提供材料。【方法】构建重组质粒pET-28a-GRA1,利用大肠杆菌表达系统表达GRA1蛋白,并用His镍柱进行GRA1蛋白纯化,经Western blotting鉴定其免疫原性。以纯化的GRA1蛋白作为抗原包被于固相载体,并用棋盘法确定抗原最佳包被浓度和待测血清稀释度。在此基础上,优化抗原包被条件、封闭条件、待测血清稀释度和酶标二抗稀释度。通过测定阴性血清D450 nm值确定所建立方法的临界值,并进行特异性、敏感性和重复性试验,同时测定该方法与改良凝集试验(MAT)对实际样品检测的符合率。【结果】SDS-PAGE结果显示,GRA1蛋白以可溶性形式表达,蛋白分子质量约为25 ku。Western blotting显示GRA1蛋白与猪弓形虫阳性血清发生特异性反应。优化后的ELISA反应条件为:抗原最佳包被浓度为5μg/mL,血清稀释度为1∶100,抗原最佳包被条件为37℃包被2 h,最佳封闭条件为5%脱脂奶粉37℃作用2 h,待检血清作用时间为60 min,酶标二抗稀释度为1∶20000,TMB作用时间为15 min。该检测方法的临界值为0.277。该方法敏感性良好,血清按1∶6400稀释后仍可检测到阳性;批内和批间重复性变异系数均<10%,重复性好;与猪带绦虫、旋毛虫、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。利用该方法和MAT方法对100份临床猪血清进行检测,总符合率为94.0%。【结论】本研究建立了一种快速有效的检测猪弓形虫抗体的间接ELISA方法,有助于猪感染弓形虫病的诊断和预防。 展开更多
关键词 猪 弓形虫 GRA1 原核表达 间接elisa
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猪捷申病毒5型VP1蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立
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作者 邵永恒 倪民婷 +6 位作者 高梦玲 汤娇 张耕馨 林圣宇 刘光亮 陈佳宁 王雯慧 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第2期883-889,共7页
旨在建立针对猪捷申病毒(porcine teschovirus,PTV)5型的间接ELISA检测方法,为其防控提供物质储备。PTV是猪的一种急性、烈性病原,以高发病率和高致死率为主要特征。其临床表现包括脑炎、肺炎、繁殖障碍、心肌炎及腹泻等多种症状。但该... 旨在建立针对猪捷申病毒(porcine teschovirus,PTV)5型的间接ELISA检测方法,为其防控提供物质储备。PTV是猪的一种急性、烈性病原,以高发病率和高致死率为主要特征。其临床表现包括脑炎、肺炎、繁殖障碍、心肌炎及腹泻等多种症状。但该病原亚型众多,不同亚型间临床表现差异较大,且缺乏高效、特异的血清学检测方法,阻碍了对PTV-5的防治。本研究针对危害较大的PTV-5构建了pET-30a-VP1重组质粒,通过原核表达获得了VP1蛋白,以纯化的VP1为包被抗原,经条件优化成功建立了针对PTV-5的间接ELISA方法。该方法与常见猪源病毒标准阳性血清无交叉反应,最低检测稀释度为1∶3200,批内与批间变异系数均低于10%,具有良好的特异性、敏感性和重复性。利用该方法对东北地区279份临床样本进行检测,其阳性率为67.74%,与报道的流行情况相符。本研究建立的间接ELISA检测方法综合评价良好,为PTV-5的临床检测提供技术支持。 展开更多
关键词 猪捷申病毒 VP1蛋白 原核表达 间接elisa
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猪副流感病毒5型HN蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立
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作者 倪民婷 张耕馨 +3 位作者 孙普 刘光亮 陈佳宁 王金涛 《动物医学进展》 北大核心 2025年第3期52-57,共6页
为建立5型猪副流感病毒(Porcine parainfluenza virus 5,PPIV5)的血清学检测方法,用原核表达系统对PPIV5 HN蛋白进行重组表达,并用该重组蛋白进行PPIV5 ELISA检测方法的建立。结果显示,重组HN蛋白大小约为60 ku,反应性良好,以200 ng/孔... 为建立5型猪副流感病毒(Porcine parainfluenza virus 5,PPIV5)的血清学检测方法,用原核表达系统对PPIV5 HN蛋白进行重组表达,并用该重组蛋白进行PPIV5 ELISA检测方法的建立。结果显示,重组HN蛋白大小约为60 ku,反应性良好,以200 ng/孔包被抗原,10%BSA封闭30 min,1∶400稀释待检血清,1∶10000稀释二抗孵育30 min,显色5 min为最佳反应条件,该方法与猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒等阳性血清均无交叉反应,特异性好,PPIV5阳性血清最低检测稀释度为1∶800,敏感性高,批内和批间的变异系数均小于5%,重复性好。表明建立的ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为PPIV5的血清学诊断奠定了基础。 展开更多
关键词 猪副流感病毒5型 HN蛋白 原核表达 间接elisa
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