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流行性出血病病毒(EHDV)血清7型毒株在中国的首次分离与鉴定 被引量：17
1
作者 杨振兴 孟锦昕 +6 位作者 肖雷 朱建波 廖德芳 高林 李占鸿 杨恒 李华春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期602-610,共9页
流行性出血病(EHD)是由流行性出血病病毒(EHDV)感染反刍动物引起的一种虫媒病毒病,为了解中国云南EHDV的感染情况和病毒遗传特征,笔者课题组在云南省师宗县以EHDV血清学和核酸阴性的牛、羊为哨兵动物,拟对流行于云南省的EHDV进行分离与... 流行性出血病(EHD)是由流行性出血病病毒(EHDV)感染反刍动物引起的一种虫媒病毒病,为了解中国云南EHDV的感染情况和病毒遗传特征,笔者课题组在云南省师宗县以EHDV血清学和核酸阴性的牛、羊为哨兵动物,拟对流行于云南省的EHDV进行分离与鉴定。将采集于哨兵动物的EHDV核酸阳性血液接种BHK-21细胞进行病毒分离;通过血清中和试验与病毒Seg-2、Seg-3 ORF区的序列分析,确定病毒的血清型与遗传特征;采用C-ELISA和qRT-PCR方法对EHDV感染动物血液中的抗体水平与病毒核酸进行监测。结果如下:从2013年8月采集自云南师宗县哨兵牛的血样中分离出一株EHDV(毒株号YNSZ/V269/2013),血清中和试验结果表明分离的病毒为血清型7型(EHDV-7);Seg-2、Seg-3序列分析表明分离的病毒属EHDV-7 Eastern型,与日本毒株和澳大利亚EHDV-7型毒株具有最近的亲缘关系。哨兵动物病毒核酸转阳后,血清抗体迅速上升,3周后达最高点并能在该水平持续较长时间,而病毒核酸含量却迅速下降,7周后已经检测不到。本研究首次报道了EHDV-7型毒株在中国的分离、毒株序列特征以及在动物上的感染特性。研究结果可为进一步开展中国EHDV-7型病毒的全基因组测序、流行病学调查、诊断方法的建立和致病性等相关研究提供基础。 展开更多
关键词 流行性出血病病毒 病毒分离鉴定 血清型 序列分析
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鹿流行性出血病病毒VP7基因的克隆及原核表达 被引量：5
2
作者 杨俊兴 花群义 +5 位作者 陈焕春 陈兵 吕建强 曹琛福 阮周曦 张彩红 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第8期5-8,共4页
根据已经扩增的鹿流行性出血病病毒(EHDV)VP7基因序列,设计一对扩增VP7基因特异性引物,用RT-PCR从血清I型EHDV(EHDV-1)总RNA中扩增VP7基因,并将其克隆到原核表达载体pBAD/Thio中,构建了重组原核表达质粒pBAD/Thio-EHDV VP7。将表达载体... 根据已经扩增的鹿流行性出血病病毒(EHDV)VP7基因序列,设计一对扩增VP7基因特异性引物,用RT-PCR从血清I型EHDV(EHDV-1)总RNA中扩增VP7基因,并将其克隆到原核表达载体pBAD/Thio中,构建了重组原核表达质粒pBAD/Thio-EHDV VP7。将表达载体转入大肠埃希菌(E.coliLMG194),用L-阿拉伯糖诱导表达。SDS-PAGE和Western blot试验结果表明,EHDV VP7基因在LMG194中得到了表达,其表达产物可以与EHDV阳性血清特异性反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性。 展开更多
关键词 鹿流行性出血病病毒(ehdv) VP7基因 基因克隆 表达
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2019年云南省景洪市哨兵动物多种虫媒病毒的分离鉴定 被引量：2
3
作者 杨振兴 寇美玲 +6 位作者 廖德芳 高翔 胡忠燕 李占鸿 谢佳芮 李华春 杨恒 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第12期4127-4137,共11页
本研究旨在了解云南省景洪市虫媒病毒的流行情况。2019年在景洪市勐罕镇设立了3头哨兵动物牛,定期采血进行虫媒病毒的分离与鉴定,共获得7株病毒分离物。经病毒核酸的RT-PCR鉴定,分离到2株血清型分别为6型和7型流行性出血热病毒(epizooti... 本研究旨在了解云南省景洪市虫媒病毒的流行情况。2019年在景洪市勐罕镇设立了3头哨兵动物牛,定期采血进行虫媒病毒的分离与鉴定,共获得7株病毒分离物。经病毒核酸的RT-PCR鉴定,分离到2株血清型分别为6型和7型流行性出血热病毒(epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV),2株血清型分别为4型和5型的蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV),1株帕利亚血清群病毒(palyam serogroup virus,PALV)中的D’Aguilar virus(DAV)血清型病毒和2株未鉴定出的环状病毒。经病毒Seg-2、Seg-3序列ORF区的比对和进化分析显示,7株病毒的地域型均为Eastern型,与日本、澳大利亚和印度毒株具有最近的亲缘关系。3头哨兵动物的血液和血清,经病毒核酸及血清中和试验检测,证明3头动物均被相应的病毒感染。动物感染病毒后,血清中的特异性抗体迅速上升,3~4周后达最高点并能够在该水平维持较长时间,而血液中病毒核酸含量2~4周到达最高点后则呈迅速下降趋势。本研究报道了景洪虫媒病毒的分离、毒株序列特征以及在动物上的感染特性,研究结果为进一步了解当地的牛虫媒病毒提供数据支撑,同时3头牛分离获得7株病毒,提示当地可能还存在更多种类的虫媒病毒。 展开更多
关键词 蓝舌病病毒(BTV) 流行性出血病病毒(ehdv) 帕利亚血清群病毒(PALV) 病毒分离鉴定
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云南边境地区流行性出血热病毒血清学监测及血清型鉴定 被引量：6
4
作者 寇美玲 杨振兴 +3 位作者 李乐 朱建波 高林 苗海生 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第10期3065-3074,共10页
为了解近几年云南边境地区牛、羊流行性出血热病毒(EHDV)的感染和流行情况,本研究从2014年起连续3年在与老挝、越南接壤的江城县设置EHDV监测点,每年选择投放EHDV抗体阴性的10头牛和5只山羊作为哨兵动物进行跟踪监测。每年5~10月份对哨... 为了解近几年云南边境地区牛、羊流行性出血热病毒(EHDV)的感染和流行情况,本研究从2014年起连续3年在与老挝、越南接壤的江城县设置EHDV监测点,每年选择投放EHDV抗体阴性的10头牛和5只山羊作为哨兵动物进行跟踪监测。每年5~10月份对哨兵动物采血,每周1次,11、12月每月采集一次,进行EHDV抗体、抗原监测和病毒分离。针对致细胞病变的样品,采用EHDV群特异性S 7基因片段引物进行RT-PCR方法检测,同时利用EHDV-1、-5、-6、-7、-10标准阳性血清对分离到的病毒进行中和试验鉴定。结果显示,2014-2016年江城县牛EHDV抗体阳性率分别为41.9%、58.6%和75.4%;3年期间共监测到15头EHDV抗体阳性黄牛,并从中分离到20个可致细胞病变样品,经RT-PCR确认为EHDV,遗传进化分析发现有11个毒株与1997和2003年日本分离的EHDV毒株亲缘关系较近,9个毒株与1977和1981年澳大利亚分离的EHDV毒株亲缘关系较近,5个毒株与2015年广西分离株的亲缘关系较近;3年期间在山羊体内未检测出抗体,未发现抗原阳性动物;经中和试验血清型鉴定,确定20株毒株包括EHDV-5、-6、-7、-10型4种血清型,感染时间均在5~9月之间。本研究发现,江城县长期存在多种血清型EHDV同时流行,2014-2016年EHDV抗体阳性率逐年增加,亟需加强对EHDV感染情况及活动规律的持续研究,提高流行性出血热的防控效率。 展开更多
关键词 流行性出血热病毒(ehdv) 监控动物 感染率 血清型
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流行性出血病病毒VP7蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备 被引量：1
5
作者 李占鸿 宋子昂 +6 位作者 肖雷 朱建波 杨振兴 李卓然 廖德芳 李华春 杨恒 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第4期1405-1413,共9页
研究旨在表达流行性出血病病毒(EHDV)VP7蛋白并制备其多克隆抗体,为EHDV检测方法的建立提供材料。试验通过大肠杆菌进行VP7重组蛋白的诱导表达,通过镍离子亲和层析与透析进行重组蛋白的纯化与复性并免疫家兔制备多克隆抗体,通过间接ELIS... 研究旨在表达流行性出血病病毒(EHDV)VP7蛋白并制备其多克隆抗体,为EHDV检测方法的建立提供材料。试验通过大肠杆菌进行VP7重组蛋白的诱导表达,通过镍离子亲和层析与透析进行重组蛋白的纯化与复性并免疫家兔制备多克隆抗体,通过间接ELISA、Western blotting与间接免疫荧光试验(IFA)分析多克隆抗体的效价与反应原性。结果显示,在37℃与IPTG(0.1 mmol/L)的诱导下,VP7重组蛋白(分子质量46 ku)以包涵体形式高效表达,纯化与复性处理后的重组蛋白纯度达94.52%,可与不同血清型的EHDV阳性血清特异性结合。制备的兔抗VP7蛋白多克隆抗体效价达1∶24000;以制备的多克隆抗体为一抗,通过IFA与Western blotting检测到EHDV感染细胞中VP7蛋白的表达。本研究在大肠杆菌中实现了EHDV VP7蛋白的高效表达,制备的兔抗VP7蛋白多克隆抗体具有良好的反应原性与特异性,为EHDV诊断抗原的制备与血清学检测方法的建立提供了试验材料。 展开更多
关键词 流行性出血病病毒(ehdv) VP7蛋白 原核表达 多克隆抗体
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流行性出血病多克隆抗体C-ELISA检测方法的建立 被引量：15
6
作者 朱建波 杨振兴 +6 位作者 肖雷 高林 苗海生 何于雯 孟锦昕 杨恒 李华春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期1440-1450,共11页
为能简便、快速地进行流行性出血病病毒(epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)抗体监测,采用纯化的6型EHDV抗原包被ELISA板,以豚鼠抗EHDV-2型多克隆抗体作为竞争抗体,建立了检测EHDV群特异性抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法。结果... 为能简便、快速地进行流行性出血病病毒(epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)抗体监测,采用纯化的6型EHDV抗原包被ELISA板,以豚鼠抗EHDV-2型多克隆抗体作为竞争抗体,建立了检测EHDV群特异性抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法。结果显示:抗原最佳包被浓度为5.12μg·mL-1(1∶10 000),竞争抗体最佳稀释倍数为1∶10 000;通过对各270份阴性和阳性的牛、羊血清检测,确定该检测方法临界值为50%;特异性试验表明该ELISA方法仅能检测出不同血清型EHDV抗体,具有较好的群特异性;对已知抗体效价的阳性血清检测表明,建立的C-ELISA方法敏感性好于血清中和试验(SNT)和琼脂扩散试验(AGID);分别用C-ELISA、SNT、RTPCR和病毒分离试验对监控动物采集的血清和抗凝血样品进行检测,ELISA结果与其他3种方法检测结果对应一致。结果表明本研究建立的C-ELISA为EHDV抗体的检测提供了一种快速、敏感、稳定的方法。 展开更多
关键词 流行性出血病病毒 多克隆抗体 竞争ELISA
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4种动物虫媒病病毒多重RT-PCR检测方法的建立 被引量：5
7
作者 阮周曦 花群义 +6 位作者 杨俊兴 曾少灵 曹琛福 秦智锋 吕建强 林庆燕 周晓黎 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第2期25-31,共7页
分别设计和合成4对特异性引物,通过对反应条件的优化,初步建立了鉴别蓝舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血病病毒(EHDV)、水疱性口炎病毒(VSV)和赤羽病病毒(AKV)的多重RT-PCR检测方法,并对其特异性和敏感性进行了检测。结果表明,所设计的4对... 分别设计和合成4对特异性引物,通过对反应条件的优化,初步建立了鉴别蓝舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血病病毒(EHDV)、水疱性口炎病毒(VSV)和赤羽病病毒(AKV)的多重RT-PCR检测方法,并对其特异性和敏感性进行了检测。结果表明,所设计的4对引物可对同一样品中的VSV、BTV、EHDV和AKV进行特异性扩增,所扩增的目的片段的长度分别为301、351、537、250bp。建立的四重RT-PCR检测方法能够检测出10-7稀释的细胞培养病毒液,4种病毒之间没有发生交叉反应,说明该检测方法特异性强,敏感性较高。所建立的多重RT-PCR方法可用于上述4种动物虫媒病病毒的快速鉴别诊断,在动物检疫、临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。 展开更多
关键词 蓝舌病病毒 鹿流行性出血病病毒 水疱性口炎病毒 赤羽病病毒 多重RT-PCR
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流行性出血病病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒的研制
8
作者 董仙兰 王琼 +10 位作者 韩佃刚 董俊 杨云庆 祝贺 叶玲玲 张冲 尹尚莲 李瑶瑶 何昌霖 罗倩敏 艾军 《中国动物检疫》 CAS 2021年第10期92-97,共6页
为研制流行性出血病病毒(epidemic hemorrhagic disease virus,EHDV)ELISA抗体检测试剂盒,用饱和硫酸铵浓缩EHDV灭活病毒作为包被抗原,以EHDV鼠源单克隆抗体作为阻断抗体,商品化的IgG-HRP羊抗鼠二抗作为检测抗体,通过优化检测试剂中各... 为研制流行性出血病病毒(epidemic hemorrhagic disease virus,EHDV)ELISA抗体检测试剂盒,用饱和硫酸铵浓缩EHDV灭活病毒作为包被抗原,以EHDV鼠源单克隆抗体作为阻断抗体,商品化的IgG-HRP羊抗鼠二抗作为检测抗体,通过优化检测试剂中各组分含量和反应程序,建立了一种EHDV阻断ELISA抗体检测方法。用研制的试剂盒与ID Screen参考试剂盒分别检测实验室保存的血清样本,结果发现该方法的特异性、敏感性与ID Screen参考试剂盒一致,二者符合率为97.00%。结果表明,研制的EHDV阻断ELISA抗体检测试剂盒可作为EHDV抗体检测的候选试剂盒,代替国外试剂盒使用,从而降低EHDV检测成本,这对该病防控具有重要意义。 展开更多
关键词 流行性出血病病毒 单克隆抗体 阻断ELISA
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