Clostridium scindens ATCC35704中的D-塔格糖-3-差向异构酶的克隆表达、纯化及活性研究

1

作者 邢庆超 沐万孟 +2 位作者 江波 周榴明 张涛 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期6-10,共5页

D-阿洛酮糖作为一种新型低热量功能性甜味剂,可以通过D-塔格糖-3-差向异构酶家族,以D-果糖为底物C-3位异构化得到。一个新的来源于微生物Clostridium scindens ATCC 35704中ZP 0243228的D-塔格糖-3-差向异构酶基因(CS-DTE),通过克隆并... D-阿洛酮糖作为一种新型低热量功能性甜味剂,可以通过D-塔格糖-3-差向异构酶家族,以D-果糖为底物C-3位异构化得到。一个新的来源于微生物Clostridium scindens ATCC 35704中ZP 0243228的D-塔格糖-3-差向异构酶基因(CS-DTE),通过克隆并成功导入E.coli BL21(DE3)中,构建了基因重组菌,诱导目的重组基因过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白样品进行SDS-PAGE分析,在约31 ku处出现显著的特征蛋白条带;通过对其活性检测表明,该重组酶分别以D-塔格糖和D-果糖为底物,可以生成D-山梨糖和D-阿洛酮糖,转化率分别为8.6%和27.9%。 展开更多

关键词 d-阿洛酮糖 d-山梨糖 d-塔格糖-3-差向异构酶 基因重组 亲和层析

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D-塔格糖3-差向异构酶的理性设计与机制解析

2

作者 郭丁钰 魏婉清 +4 位作者 宋伟 吴静 闻建 胡贵鹏 刘立明 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第4期58-64,共7页

D-阿洛酮糖是一种在自然界中存在极少的酮糖,因其具有与蔗糖相近的甜度但热量更低而备受关注。然而,D-阿洛酮糖的高效生物合成仍然面临挑战,是由于用于生产的酮糖3-差向异构酶的热稳定性较差。该研究通过理性设计,引入二硫键和属性嫁接... D-阿洛酮糖是一种在自然界中存在极少的酮糖,因其具有与蔗糖相近的甜度但热量更低而备受关注。然而,D-阿洛酮糖的高效生物合成仍然面临挑战,是由于用于生产的酮糖3-差向异构酶的热稳定性较差。该研究通过理性设计,引入二硫键和属性嫁接策略,成功获得了热稳定性更高的最佳突变体M03。最佳突变体M03的T m值从52.7℃提高到69.4℃;在无需外源添加金属离子的条件下,55℃时半衰期延长至254.3 min,是野生型的54.1倍;通过分子动力学模拟和结构分析揭示了性能提升的详细机制。该研究为工业化生产D-阿洛酮糖提供了一个有潜力的突变菌株。 展开更多

关键词 d-阿洛酮糖 d-塔格糖3-差向异构酶 热稳定性 蛋白质工程改造 分子动力学模拟

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基于超高通量筛选的D-阿洛酮糖3-差向异构酶定向进化

3

作者 赵添龙 刘展志 +2 位作者 张凤山 吴敬 宿玲恰 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第2期105-109,共5页

D-阿洛酮糖是一种低热量的甜味剂,具有多种生理功能,如维持血糖平衡和调节脂质代谢等。目前,D-阿洛酮糖工业生产主要通过D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose-3-epimerase,DAEase)催化D-果糖的差向异构反应实现,但DAEase的应用性能仍需... D-阿洛酮糖是一种低热量的甜味剂,具有多种生理功能,如维持血糖平衡和调节脂质代谢等。目前,D-阿洛酮糖工业生产主要通过D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose-3-epimerase,DAEase)催化D-果糖的差向异构反应实现,但DAEase的应用性能仍需进一步提升以满足日益增长的市场需求。定向进化作为一种有效的分子改造策略,其筛选方法是限制效率的关键因素之一。通过构建并优化D-阿洛酮糖特异型生物传感器,结合微孔板筛选,对来自Clostridium cellulolyticum H10的DAEase(Cc DAEase)突变体文库进行超高通量筛选,最终获得了比活提高14.6%的优势突变体H209Q,其最适温度为60℃,最适pH值为7.5,并进一步解析了该突变体的构效关系。该研究证明了转录因子型生物传感器可以作为一种有效的定向进化筛选工具,为进一步优化DAEase的性能提供了可能性,亦为D-阿洛酮糖的工业制备提供了理论依据和技术支撑。 展开更多

关键词 d-阿洛酮糖3-差向异构酶 转录因子型生物传感器 超高通量筛选

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基于沸石咪唑骨架材料的产D-阿洛酮糖3-差向异构酶重组枯草芽孢杆菌固定化研究

4

作者 张晗 尹子璐 +4 位作者 王雅珣 李飞胜 郭庆彬 丁文涛 王昌禄 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第8期284-292,共9页

为提高产D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose 3-epimerase,DAE)工程菌在全细胞催化生产D-阿洛酮糖中的稳定性和重复利用性,降低D-阿洛酮糖生产成本,以沸石咪唑骨架-8(zeolitic imidazolate framework-8,ZIF-8)为材料对产DAE重组枯草芽... 为提高产D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose 3-epimerase,DAE)工程菌在全细胞催化生产D-阿洛酮糖中的稳定性和重复利用性,降低D-阿洛酮糖生产成本,以沸石咪唑骨架-8(zeolitic imidazolate framework-8,ZIF-8)为材料对产DAE重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行固定化研究。通过乙酸锌、2-甲基咪唑与菌体共沉淀制备固定化细胞,利用扫描电子显微镜、傅里叶红外光谱和X射线衍射等手段进行表征,证明成功制备了ZIF-8包覆的固定化重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis-DAE@ZIF-8。利用正交试验优化制备条件,当Zn^(2+)与2-甲基咪唑摩尔浓度比为1∶4,菌体添加量15 g/L,低温静置1 h时,复合材料比酶活最高,达344.81 U/g,活性回收率为77.75%。B.subtilis-DAE@ZIF-8在60℃、pH值7.5下表现最佳,60℃下半衰期为10.75 h,为游离细胞的1.46倍。B.subtilis-DAE@ZIF-8具有较好的重复使用性,重复催化10批次后,酶活力残留45.67%,转化率达20.08%,研究结果为D-阿洛酮糖的高效生物转化提供了参考。 展开更多

关键词 d-阿洛酮糖3-差向异构酶 枯草芽孢杆菌 细胞固定化 沸石咪唑骨架 d-阿洛酮糖

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超嗜热D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化及固定化酶性能研究

5

作者 沈骥冬 徐宝萍 +2 位作者 黄良刚 柳志强 郑裕国 《食品科学技术学报》 北大核心 2025年第2期42-50,共9页

D-阿洛酮糖是一种应用前景广阔的低热量天然甜味剂,其作为稀有糖家族的重要成员具有抑制多种疾病的生理益处。D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3位差向异构体,由D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose 3-epimerase,DAE)催化合成。工业生产中的糖差... D-阿洛酮糖是一种应用前景广阔的低热量天然甜味剂,其作为稀有糖家族的重要成员具有抑制多种疾病的生理益处。D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3位差向异构体,由D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose 3-epimerase,DAE)催化合成。工业生产中的糖差向异构化反应需要高温条件(大于65℃),现有的DAE难以满足工业化生产需求。为了突破这一瓶颈,以硅藻土(diatomite)为固体核心、聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)为保护壳、戊二醛(glutaraldehyde,GA)为交联剂,负载超嗜热DAE(T I-DAE),制备了具有“核壳”结构的固定化酶(T I-DAE@Diatomite-PE I-GA),并对其结构和性能进行了表征。相关结果表明,固定化酶T I-DAE@Diatomite-PE I-GA相比游离酶表现出较好的pH稳定性和热稳定性。在90℃条件下,T I-DAE@Diatomite-PE I-GA的半衰期大于24 h,相比游离酶提高了11倍。T I-DAE@Diatomite-PE I-GA可以重复催化500 g/L D-果糖生成D-阿洛酮糖20批次,且仍保持70%以上的相对酶活。研究结果证明基于硅藻土共价交联的酶固定化技术能大幅提高DAE的热稳定性,降低D-阿洛酮糖的工业生产成本,可突破目前工业化生产的技术瓶颈,为推进酶法合成D-阿洛酮糖的产业化奠定基础。 展开更多

关键词 d-阿洛酮糖 d-阿洛酮糖3-差向异构酶 酶固定化 高温催化 稀有糖

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Clostridium cellulolyticum D-塔格糖3-差向异构酶基因的克隆、表达及酶活性 被引量：7

6

作者 储菲菲 邢庆超 +4 位作者 沐万孟 张涛 缪铭 江波 周榴明 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期283-286,共4页

D-塔格糖3-差向异构酶是生物法生产新型功能性因子D-阿洛酮糖最为有效的酶。作者克隆到一种新型的D-塔格糖3-差向异构酶基因,来源于微生物Clostridium cellulolyticumH10。以pET-22b(+)为载体质粒,E.coliBL21(DE3)为宿主细胞,构建了基... D-塔格糖3-差向异构酶是生物法生产新型功能性因子D-阿洛酮糖最为有效的酶。作者克隆到一种新型的D-塔格糖3-差向异构酶基因,来源于微生物Clostridium cellulolyticumH10。以pET-22b(+)为载体质粒,E.coliBL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组菌,IPTG可诱导目的蛋白质的过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白质样品进行SDS-PAGE分析,在约31 000处出现显著的特征蛋白质条带;活性检测结果表明:该重组酶具有较高的转化活性。 展开更多

关键词 d-塔格糖3-差向异构酶 d-阿洛酮糖 克隆 表达 亲和层析

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祖先序列重建增强D-阿洛酮糖3-差向异构酶的热稳定性

7

作者 管立军 朱玲 +7 位作者 王崑仑 李家磊 高扬 严松 张馨笛 陈晴 季妮娜 李波 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2024年第21期121-128,共8页

为解决现有D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DAEase)热稳定性差的产业问题,本文采用系统发育指导的大数据挖掘、合理修饰和祖先序列重建策略(ASR),重建了具有不同催化结构域DAEase的祖先序列,构建了表达载体,通过重组表达与分子对接筛选出了DAEa... 为解决现有D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DAEase)热稳定性差的产业问题,本文采用系统发育指导的大数据挖掘、合理修饰和祖先序列重建策略(ASR),重建了具有不同催化结构域DAEase的祖先序列,构建了表达载体,通过重组表达与分子对接筛选出了DAEase A13并进行酶学性质表征,此外,还基于结构分析与分子动力学模拟揭示了DAEase A13热稳定性增强的分子机制。结果表明,基于ASR策略所构建的A13 70℃时半衰期可达8.4 h,其热稳定性较野生(WT)酶显著增强,最大转化率为31%,催化活性也略高于WT酶。立体结构模拟与分子动力学模拟揭示了ASR A13中大量氢键和疏水作用的增加维持了高温下酶分子结构的稳定性,是其热稳定性增强的主要因素。研究结果证实了ASR策略可以改造DAEase使其稳定性、活性和混杂性增强,可以为D-阿洛酮糖工业生产提供良好的生物催化剂。 展开更多

关键词 祖先序列重建 d-阿洛酮糖 d-阿洛酮糖3-差向异构酶 热稳定性

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D-塔格糖3-差向异构酶家族蛋白的研究进展 被引量：5

8

作者 沐万孟 张涛 +1 位作者 江波 张龙涛 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2007年第9期127-131,共5页

稀有糖是在自然界中存在但含量极少的一类单糖及衍生物,其在膳食、保健、医药等领域中发挥着重要的功能。D-塔格糖3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimerase,缩写为DTE)家族蛋白在稀有糖生物转化中占有重要地位。文中对DTE家族蛋白的最新进... 稀有糖是在自然界中存在但含量极少的一类单糖及衍生物,其在膳食、保健、医药等领域中发挥着重要的功能。D-塔格糖3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimerase,缩写为DTE)家族蛋白在稀有糖生物转化中占有重要地位。文中对DTE家族蛋白的最新进展进行了综述;同时,展望了DTE家族蛋白的研究趋势。 展开更多

关键词 稀有糖 d-塔格糖3-差向异构酶 生物转化

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Clostridium bolteae ATCC BAA-613 D-塔格糖3-差向异构酶的诱导表达、纯化及活性研究 被引量：2

9

作者 储菲菲 沐万孟 +3 位作者 邢庆超 周榴明 张涛 江波 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期198-201,392,共5页

D-塔格糖3-差向异构酶是生物法生产新型功能性因子D-阿洛酮糖最为有效的酶。一种新型的能够编码D-塔格糖3-差向异构酶的基因CLOBOL_00069被克隆,它来源于Clostridium bolteae ATCC BAA-613。以pUC57为克隆载体,以pET-22b(+)为载体质粒,E... D-塔格糖3-差向异构酶是生物法生产新型功能性因子D-阿洛酮糖最为有效的酶。一种新型的能够编码D-塔格糖3-差向异构酶的基因CLOBOL_00069被克隆,它来源于Clostridium bolteae ATCC BAA-613。以pUC57为克隆载体,以pET-22b(+)为载体质粒,E.coli BL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组工程菌。IPTG诱导剂诱导目的蛋白的表达;通过镍柱亲和层析,杂蛋白与目的蛋白得到了很好的分离。对纯化的重组蛋白样品进行SDS-PAGE分析,在约32ku处出现明显的特征条带。通过活性研究表明,Clostridium bolteae ATCC BAA-613 DTEase属于DTEase家族,并具有较高的生物转化率,反应10h后转化率达到20%。 展开更多

关键词 d-塔格糖3-差向异构酶 d-阿洛酮糖 基因重组 亲和层析

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D-塔格糖3-差向异构酶的固定化研究

10

作者 周林芳 储菲菲 +1 位作者 张涛 江波 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2012年第19期197-200,共4页

从14种离子交换树脂和吸附树脂中,筛选出固定化效果较好的大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂D301-Ⅲ为载体,以戊二醛为交联剂,通过先吸附后交联的方法对D-塔格糖3-差向异构酶的固定化进行研究。结果表明,最佳固定化条件为:加酶量为2.00m... 从14种离子交换树脂和吸附树脂中,筛选出固定化效果较好的大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂D301-Ⅲ为载体,以戊二醛为交联剂,通过先吸附后交联的方法对D-塔格糖3-差向异构酶的固定化进行研究。结果表明,最佳固定化条件为:加酶量为2.00mL/g(粗酶液/树脂),吸附pH7.5,吸附时间为8h,吸附温度为30℃,戊二醛浓度为0.05%,交联时间为3h,固定化酶活回收率可达50%以上。固定化酶重复使用10次,酶活仍能稳定保持在初始酶活的65%以上,具有良好的操作稳定性。 展开更多

关键词 d-塔格糖3-差向异构酶 树脂 固定化

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重组大肠杆菌发酵条件优化提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性的研究 被引量：1

11

作者 刘微微 常楚婷 +4 位作者 冯敬杰 张家赫 李飞胜 丁文涛 王昌禄 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期253-259,共7页

功能性稀有糖D-阿洛酮糖主要由基因工程菌株表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose 3-epimerase,DAE)催化果糖生产。该研究以表达DAE的重组大肠杆菌为研究对象,利用单因素试验对发酵培养基的碳源、氮源、金属离子等成分进行优化,获得... 功能性稀有糖D-阿洛酮糖主要由基因工程菌株表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose 3-epimerase,DAE)催化果糖生产。该研究以表达DAE的重组大肠杆菌为研究对象,利用单因素试验对发酵培养基的碳源、氮源、金属离子等成分进行优化,获得了最佳的培养基组合:蔗糖10 g/L、大豆蛋白胨15 g/L、(NH4)2SO_(4)3 g/L、KH2PO_(4)3 g/L、MgSO_(4)0.5 g/L、MnSO_(4)0.025 mmol/L。在此基础上,利用单因素试验对培养条件进行研究,确定了最佳发酵诱导时间(10 h)、接种量(3%,摇瓶)、装液量(30%)以及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)添加浓度(1 mmol/L),使OD_(600)增加了1.46倍,酶活提高了2.57倍。在此基础上,利用5 L发酵罐进行放大发酵实验,确定了最佳诱导时间。在最佳条件下,经过18 h的诱导发酵,菌体OD_(600)最高值达51.8,干重达到21.5 g/L,酶活达到103.8 U/mL。当细胞添加量为0.014 g DCW/L时,以500 g/L D-果糖为底物,pH为7,50℃,1 h转化率达28.76%,D-阿洛酮糖最高生成量可达149.74 g/L。该研究对D-阿洛酮糖3-差向异构酶的发酵生产具有参考价值。 展开更多

关键词 d-阿洛酮糖-3-差向异构酶 重组大肠杆菌 高密度发酵 发酵优化 重组蛋白

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D-塔格糖3-差向异构酶的储存稳定性 被引量：2

12

作者 张巧 帅玉英 +3 位作者 张涛 江波 缪铭 沐万孟 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期1-5,共5页

为提高D-塔格糖3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimeriase,DTE)粗酶液的储存稳定性,在其粗酶液中添加防腐剂以及糖类、盐类、多元醇类与蛋白质等稳定剂。通过单因子研究与正交实验,研究了它们对酶液储存稳定性的影响。结果表明:0.3%尼泊金... 为提高D-塔格糖3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimeriase,DTE)粗酶液的储存稳定性,在其粗酶液中添加防腐剂以及糖类、盐类、多元醇类与蛋白质等稳定剂。通过单因子研究与正交实验,研究了它们对酶液储存稳定性的影响。结果表明:0.3%尼泊金甲酯(methylparaben,Met)有较佳的防腐效果,且能显著降低酶液的失活速率;果糖、肌醇、Mg SO4是DTE良好的稳定剂,其组合2 mmol/L Mg SO4,6%果糖,4%肌醇为最优的复合稳定剂;将加有0.3%Met和复合稳定剂的粗酶液在25℃下保存,粗酶失活半衰期为62 d,而仅加防腐剂Met的半衰期为25 d,空白酶液仅2 d。因此,复合稳定剂与防腐剂Me的联合使用能较好地提高DTE粗酶液的储存稳定性。 展开更多

关键词 d-塔格糖3-差向异构酶 储存稳定性 半衰期 稳定剂

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石油热袍菌来源的塔格糖4-差向异构酶在大肠杆菌中的重组表达及全细胞固定化研究

13

作者 郭雪红 刘展志 +1 位作者 许滢 吴敬 《食品与生物技术学报》 CSCD 北大核心 2024年第11期106-114,共9页

D-塔格糖是一种具有多种生理功能的稀少糖,但其现有生物制备方法存在底物成本高、供应不稳定等缺陷。来源于石油热袍菌(Thermotoga petrophila)的塔格糖酮酸3-差向异构酶(tagaturonate 3-epimerase)经过分子改造后,能够以D-果糖为底物... D-塔格糖是一种具有多种生理功能的稀少糖,但其现有生物制备方法存在底物成本高、供应不稳定等缺陷。来源于石油热袍菌(Thermotoga petrophila)的塔格糖酮酸3-差向异构酶(tagaturonate 3-epimerase)经过分子改造后,能够以D-果糖为底物经差向异构反应合成D-塔格糖,该突变体被命名为塔格糖4-差向异构酶(tagatose 4-epimerase,T4E)。作者通过在T4E的N端添加T7 tag,使其在大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli)BL21 (DE3)中成功表达并测定了T4E的酶学性质,优化了T4E催化D-果糖合成D-塔格糖的生物转化条件,同时对异源表达T4E的E. coli BL21 (DE3)重组细胞进行硅藻土-海藻酸钠固定化研究。结果表明,在最适条件下,以300 g/L的D-果糖为底物,反应4 h后其平衡转化率可达25%。与游离细胞中的T4E相比,经全细胞固定化后的T4E热稳定性显著提高,可连续反应7个批次,具有较高的工业应用价值。 展开更多

关键词 d-塔格糖 塔格糖4-差向异构酶 大肠杆菌 全细胞固定化

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D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达 被引量：11

14

作者 贾敏 沐万孟 +1 位作者 张涛 江波 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期1129-1135,共7页

将D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)基因利用PCR进行扩增,与枯草芽孢杆菌载体p MA5连接,构建重组质粒p MA5-cbdpe。重组质粒转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800感受态细胞,利用卡那霉素筛选和PCR鉴定,获得一株DPE重组枯草芽孢杆菌菌... 将D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)基因利用PCR进行扩增,与枯草芽孢杆菌载体p MA5连接,构建重组质粒p MA5-cbdpe。重组质粒转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800感受态细胞,利用卡那霉素筛选和PCR鉴定,获得一株DPE重组枯草芽孢杆菌菌株。该重组菌株无需诱导即可产生DPE酶,18 h时酶活可达6.8 U/m L。该酶最适p H为7.0,最适温度为55℃,与大肠杆菌表达的DPE酶酶学性质相似。结果表明,DPE酶可在枯草芽孢杆菌中表达。 展开更多

关键词 d-阿洛酮糖3-差向异构酶 d-阿洛酮糖 枯草芽孢杆菌 酶学性质

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壳聚糖固定D-阿洛酮糖3-差向异构酶转化D-阿洛酮糖 被引量：6

15

作者 李晓波 朱癑明 +3 位作者 柏玮 张同存 何森健 孙媛霞 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2013年第17期158-162,共5页

D-阿洛酮糖3-差向异构酶是一种能催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖的异构酶。本实验采用壳聚糖作为载体制备固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶,考察了固定化酶的制备条件和酶学性质,并研究在填充床中利用固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶持续转化D-... D-阿洛酮糖3-差向异构酶是一种能催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖的异构酶。本实验采用壳聚糖作为载体制备固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶,考察了固定化酶的制备条件和酶学性质,并研究在填充床中利用固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶持续转化D-果糖。实验结果表明:固定时间为3h,酶∶载体=15∶1(U/g),其酶活回收率达到45%。相比游离酶,固定化酶具有更高的温度稳定性以及在较宽的pH范围内保持较高酶活,其最适温度和pH分别为60℃与8.5。固定化酶在填充床中反应的最高转化率为24%,在最佳流速2.5mL/min下其转化率为19%,相关产率为6.7g/L·h,经过168h的反应,其转化率仍然保持在13%以上。 展开更多

关键词 壳聚糖 d-阿洛酮糖3-差向异构酶 固定化酶 填充床 d-阿洛酮糖

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D-阿洛酮糖3-差向异构酶的异源表达和酶学性质 被引量：6

16

作者 温宇威 张涛 +1 位作者 沐万孟 江波 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第3期289-296,共8页

克隆了来源于Clostridium bolteae ATCC BAA-613的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因,利用重叠延伸PCR技术在Cb-dpe基因的上游加入了P43启动子,形成P43-Cb-dpe,再将P43-Cb-dpe连接到p MA5载体上构建出双启动子表达载体,并导入到Bacillus subti... 克隆了来源于Clostridium bolteae ATCC BAA-613的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因,利用重叠延伸PCR技术在Cb-dpe基因的上游加入了P43启动子,形成P43-Cb-dpe,再将P43-Cb-dpe连接到p MA5载体上构建出双启动子表达载体,并导入到Bacillus subtilis WB800中进行表达;与单启动子表达系统相比,双启动子表达载体能够显著提高Cb-dpe的表达量。对重组Cb-DPE酶进行了分离纯化和酶学性质的研究,结果表明:重组Cb-DPE的最适温度为55℃,最适pH为7.0,在温度30~40℃范围内和pH 6.5~7.5之间有良好的稳定性;Co^(2+)、Mn^(2+)可显著增强酶活;D-阿洛酮糖为底物时,K_m为26.68 mmol/L,小于果糖的61.80 mmol/L,说明该酶对D-阿洛酮糖的亲和性比对D-果糖的高。而在动力学参数方面,以D-阿洛酮糖为底物对应的催化效率K_(cat)/K_m为95.8 L/(mmol·min),大于以果糖作为底物时的54.1 L/(mmol·min)。 展开更多

关键词 d-阿洛酮糖3-差向异构酶 d-阿洛酮糖 双启动子 酶学性质

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枯草芽孢杆菌产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的发酵优化 被引量：1

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作者 卜一凡 张涛 +1 位作者 陈静静 江波 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期74-80,共7页

D-阿洛酮糖是D-果糖在C-3位的差向异构体,由于较低的热量和与蔗糖相似的甜度,D-阿洛酮糖成为一个具有发展前景的功能性甜味剂。D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,EC 5.1.3.30,DPEase)能够催化D-果糖生产D-阿洛酮糖,这种生... D-阿洛酮糖是D-果糖在C-3位的差向异构体,由于较低的热量和与蔗糖相似的甜度,D-阿洛酮糖成为一个具有发展前景的功能性甜味剂。D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,EC 5.1.3.30,DPEase)能够催化D-果糖生产D-阿洛酮糖,这种生物酶法制备的功能性甜味剂D-阿洛酮糖由于简单的纯化步骤和高产物浓度等优点受到关注。该研究对1株前期构建的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal产DPEase进行了3 L发酵罐水平培养,通过优化溶解氧(DO)、pH、温度、初始碳源质量浓度确定最适发酵条件为:DO为30%、pH 6.0、温度37℃、初始葡萄糖质量浓度15 g/L,最高发酵酶活达78.3 U/mL。在此基础上进行补料发酵优化,得到最适补料条件为:在发酵5 h进行补料,碳源补料速率8.0 g/(L·h),在此条件下,发酵9 h全细胞酶活高达123.0 U/mL。此发酵策略为扩大工业化生产提供了参考。 展开更多

关键词 d-阿洛酮糖 d-阿洛酮糖3-差向异构酶 枯草芽孢杆菌 发酵优化 酶活

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工程大肠杆菌异源表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的诱导工艺研究 被引量：5

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作者 周卫强 何太波 +9 位作者 唐堂 汤维涛 吕哲 郭元亨 王靖 王小艳 彭超 陈博 李义 佟毅 《发酵科技通讯》 CAS 2019年第4期192-196,共5页

以异源表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,缩写为DPEase)的工程大肠杆菌为出发菌株,在5L发酵罐培养的基础上,系统研究了大肠杆菌异源表达DPEase酶的诱导工艺。通过依次考察诱导时间点、诱导温度、诱导pH和诱导剂用量对... 以异源表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,缩写为DPEase)的工程大肠杆菌为出发菌株,在5L发酵罐培养的基础上,系统研究了大肠杆菌异源表达DPEase酶的诱导工艺。通过依次考察诱导时间点、诱导温度、诱导pH和诱导剂用量对工程大肠杆菌生长和DPEase酶活(单位时间内的转化率)的影响,综合考虑能耗和发酵周期,确定相应的最佳控制点,系统优化诱导条件。结果表明:指数生长期进行诱导,诱导前培养温度由37℃降至25℃、pH恒定7.0、IPTG诱导剂添加终浓度为0.5 mmol/L,可以理想平衡菌体生长和蛋白酶表达,反应30 min的DPEase酶平衡转化率达到28%左右,达到已公开报道的平均水平,为后续的生物转化工艺摸索提供原料供应。 展开更多

关键词 大肠杆菌 d-阿洛酮糖3-差向异构酶 d-阿洛酮糖 诱导工艺

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D-阿洛酮糖3-差向异构酶在大肠杆菌内的高效可溶性表达及发酵条件研究 被引量：5

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作者 李秋凤 陈静 +3 位作者 赵婧邑 韦欣 王志琦 刘继栋 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2022年第22期136-143,共8页

将来源于Clostridium bolteae ATCCBAA-613的DAEase基因序列经密码子优化合成,以pCold TF为表达载体,冷休克启动子CspA低温诱导DAEase基因在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达,得到高效可溶性的重组Cb-DAEase并利用镍柱亲和层... 将来源于Clostridium bolteae ATCCBAA-613的DAEase基因序列经密码子优化合成,以pCold TF为表达载体,冷休克启动子CspA低温诱导DAEase基因在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达,得到高效可溶性的重组Cb-DAEase并利用镍柱亲和层析分离纯化。结果表明,Cb-DAEase最适pH和温度为7.0和55℃,Co^(2+)能够显著(P<0.05)增强酶活力。对培养条件进行优化得到,在7 g/L甘油、10 g/L酵母膏、1%接种量、0.25 mmol/L IPTG、诱导前培养5 h的条件下,Cb-DAEase活力达到(10.11±0.02)U/g,比优化前(1.38±0.01)U/g提高了7.33倍;以120 g/L的D-果糖为底物全细胞催化0.5 h后,D-阿洛酮糖产量为(11.47±0.04)g/L,比优化前(1.03±0.02)g/L提高了11.14倍。基于冷休克表达策略构建的重组菌经发酵优化后Cb-DAEase活力显著(P<0.05)提高,为高效制备D-阿洛酮糖提供了理论支持。 展开更多

关键词 d-阿洛酮糖3-差向异构酶 大肠杆菌 冷休克 可溶性表达 酶学性质 发酵优化

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D-阿洛酮糖3-差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的表达 被引量：1

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作者 胡梦莹 李梦丽 +1 位作者 江波 张涛 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2022年第18期42-47,共6页

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)可以催化D-果糖转化为稀有糖D-阿洛酮糖,是生产D-阿洛酮糖过程中的关键酶。为了提高DPE的表达水平,该研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800为宿主菌,异源表达Clostridium scin... D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)可以催化D-果糖转化为稀有糖D-阿洛酮糖,是生产D-阿洛酮糖过程中的关键酶。为了提高DPE的表达水平,该研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800为宿主菌,异源表达Clostridium scindens ATCC 35704来源的DPE。首先,构建不同单启动子和串联启动子介导DPE表达的重组菌,通过摇瓶培养,发现由单启动子P_(hag)介导的重组菌株经发酵后酶活力最高,最高酶活力为19.62 U/mL,是P_(43)介导的原始菌株酶活力的1.3倍。最后对P_(hag)的核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)序列进行突变,突变后的菌株酶活力再次提高了29.4%,是原始菌株酶活力的1.69倍。该研究结果为工业化生产DPE提供了方法学参考。 展开更多

关键词 d-阿洛酮糖3-差向异构酶 枯草芽孢杆菌 启动子 核糖体结合位点 发酵产酶

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