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Cas9和PE介导湖羊骨骼肌卫星细胞MSTN基因敲除的研究 被引量：4
1
作者 周磊 李东旭 +3 位作者 冒魏佳 刘孜斐 高雪 万永杰 《南京农业大学学报》 北大核心 2025年第2期419-426,共8页
[目的]本文利用CRISPR/Cas9系统和先导编辑(prime editor, PE)对湖羊骨骼肌卫星细胞中的肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因外显子进行敲除,旨在比较2种技术敲除MSTN基因的效率,以验证新型基因编辑工具PE用于湖羊骨骼肌卫星细胞上的可... [目的]本文利用CRISPR/Cas9系统和先导编辑(prime editor, PE)对湖羊骨骼肌卫星细胞中的肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因外显子进行敲除,旨在比较2种技术敲除MSTN基因的效率,以验证新型基因编辑工具PE用于湖羊骨骼肌卫星细胞上的可行性。[方法]针对湖羊MSTN基因的3个外显子分别设计向导RNA(single guide RNA,sgRNA)以及引导RNA(prime editing guide RNA,pegRNA),构建相应的质粒后将含有Cas9/sgRNA或PE/pegRNA的质粒共同转染湖羊骨骼肌卫星细胞。24 h后观察细胞荧光,48 h后再将细胞消化,使用流式细胞分选仪根据荧光强度筛选出转染成功的强阳性细胞,收集细胞,获得基因组DNA后进行桑格测序,检测2种基因编辑工具对MSTN基因的打靶效率。[结果]成功构建了分别针对湖羊骨骼肌卫星细胞MSTN基因3个外显子敲除的基因编辑工具,质粒测序结果显示序列插入正确;CRISPR/Cas9的编辑效率(65%、88%、91%)显著高于PE的编辑效率(57%、29%、33%),而PE的插入缺失率显著低于CRISPR/Cas9。[结论]在转染效率相近的情况下,CRISPR/Cas9相比于PE对于湖羊骨骼肌卫星细胞MSTN基因的敲除有更高的编辑效率。 展开更多
关键词 基因编辑 CRISPR/cas9 先导编辑(PE) MSTN 湖羊 骨骼肌卫星细胞
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基于CRISPR-Cas系统的多重耐药菌防治技术研究进展 被引量：1
2
作者 周倩 唐梦君 +4 位作者 张小燕 陆俊贤 唐修君 杨星星 高玉时 《生物技术通报》 北大核心 2025年第5期42-51,共10页
动物源细菌耐药性影响动物养殖安全,同时对人类公共卫生和食品安全产生重要威胁。抗生素的滥用加剧了耐药细菌的传播,而新型抗菌药物研发日益困难,动物源细菌耐药污染已成为全球范围内的公共危机,一旦耐药菌从动物向人类扩散,将极大地... 动物源细菌耐药性影响动物养殖安全,同时对人类公共卫生和食品安全产生重要威胁。抗生素的滥用加剧了耐药细菌的传播,而新型抗菌药物研发日益困难,动物源细菌耐药污染已成为全球范围内的公共危机,一旦耐药菌从动物向人类扩散,将极大地威胁人类健康,亟须新的方法和策略应对细菌耐药。CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR-associated)是第三代“基因组定点编辑技术”,该技术能够靶向剪切外源性核酸,保护微生物遗传物质遗传稳定性。与传统的多重耐药菌防治策略相比,CRISPR-Cas系统具备独特的DNA序列的靶向性和灵敏度,通过精准、简便和高效的基因编辑技术,与核酸扩增技术、比色技术等相结合,可以提高灵敏度和检测时效性等性能指标。本文介绍了CRISPR-Cas系统的由来、系统分类、基因编辑的作用机理,在此基础之上,聚焦于该系统在多重耐药菌防治领域的研究进展和应用,在耐药致病菌消除、耐药基因消除以及致病菌诊断检测方面给出案例分析以及目前存在的挑战。总的来说,基于CRISPR-Cas系统的序列特异性抗菌剂能够降低细菌多重耐药性,结合核酸扩增技术和实时监控设备提升检测的精准性和效率,为动物源细菌耐药防控和监测研究提供了新思路。 展开更多
关键词 CRISPR-cas系统 基因编辑 多重耐药菌 耐药基因 防治技术
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基于CRISPR/Cas9基因编辑系统建立WIP 1基因g.37536832 C>A位点突变的ST细胞系
3
作者 王楠 杜伟伟 +7 位作者 王婉洁 王悦 袁茂莎 聂雨欣 孙亚茹 刘志国 吴添文 牟玉莲 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第5期1966-1976,共11页
【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得野生型p53诱导磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatase 1,WIP1)基因与精子活力显著相关的位点g.37536832 C>A突变的猪睾丸(swine testis,ST)细胞系,为在细胞层面上进一步探讨WIP 1基因... 【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得野生型p53诱导磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatase 1,WIP1)基因与精子活力显著相关的位点g.37536832 C>A突变的猪睾丸(swine testis,ST)细胞系,为在细胞层面上进一步探讨WIP 1基因与公猪精液品质性状之间的关系奠定基础。【方法】利用CRISPOR在线网站在猪WIP 1基因g.37536832 C>A位点附近区域设计3条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接至pX458-GFP载体;通过T7E1酶切试验检测3条sgRNA活性,选择效率较高的sgRNA。构建Donor载体,并将其与sgRNA载体共同转染至ST细胞,采用流式细胞术将表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的阳性细胞进行富集和单克隆细胞筛选,并对筛选出的单克隆细胞进行基因型鉴定。【结果】质粒测序结果表明,成功将3条sgRNA连接至pX458-GFP载体上;T7E1酶切结果显示,转染pX458-GFP-sgRNA1和pX458-GFP-sgRNA2质粒组产生了切割,效率分别为24%和27%,而转染pX458-GFP-sgRNA3质粒组未检测到切割,因此选择pX458-GFP-sgRNA2质粒进行试验。成功构建Donor载体,并将pX458-GFP-sgRNA2和Donor载体共转染至ST细胞。基因型鉴定结果显示,获得的269株单克隆中有205株细胞发生了基因编辑,基因编辑效率为76%,其中9株为WIP 1基因g.37536832 C>A位点纯合突变的ST细胞,精确突变效率为3%。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得了WIP 1基因g.37536832 C>A位点突变的ST细胞系,为深入研究WIP 1基因对公猪精液品质的影响提供了良好的细胞模型。 展开更多
关键词 CRISPR/cas9 WIP 1基因 ST细胞系
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应用CRISPR/Cas9技术对五指山猪GHRHR基因的编辑
4
作者 王文涛 张思佳 +9 位作者 何鑫淼 陈诗怡 吴赛辉 张冬杰 陈瑶生 丛佩清 亓美玉 田明 刘娣 何祖勇 《东北农业大学学报》 北大核心 2025年第2期44-52,共9页
生长激素释放激素受体(GHRHR)表达于垂体细胞表面,调节垂体生长激素合成与分泌,对动物生长发育发挥重要调控作用。为深入了解GHRHR对五指山猪生长发育的影响,通过CRISPR-ctRNP体外酶切试验,筛选出切割效率达27.3%的1条gRNA用于构建CRISP... 生长激素释放激素受体(GHRHR)表达于垂体细胞表面,调节垂体生长激素合成与分泌,对动物生长发育发挥重要调控作用。为深入了解GHRHR对五指山猪生长发育的影响,通过CRISPR-ctRNP体外酶切试验,筛选出切割效率达27.3%的1条gRNA用于构建CRISPR/Cas9表达载体。转染五指山猪肾细胞后,经流式分选富集到编辑效率高达100%的细胞群体作为供体细胞,进行体细胞核移植;再将250枚克隆胚胎转移至5头代孕母猪输卵管中,最终1头代孕母猪成功妊娠,分娩3头克隆仔猪均为GHRHR双等位基因编辑个体;编辑均导致GHRHR基因产生移码突变,可导致蛋白翻译提前终止,丧失生物学功能。最终仅有1头GHRHR编辑五指山猪存活,该个体60日龄时,体质量较野生型个体平均体质量下降23.4%。研究结果在五指山猪中实现GHRHR基因高效编辑,为培养微型宠物猪及解析GHRHR的调控功能提供理论依据。 展开更多
关键词 五指山猪 生长激素释放激素受体 基因编辑猪 CRISPR/cas9
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基于RTCPA-CRISPR/Cas12a的牛病毒性腹泻病毒检测方法的建立及应用
5
作者 蒙琦 常亮 +2 位作者 杨明 曹映辉 贺泂杰 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第2期80-88,共9页
本研究旨在建立一种检测牛病毒性腹泻病毒的RT-CPA-CRISPR/Cas12a方法。选取BVDV的E0蛋白基因序列为基础,设计CPA特异性引物。同时,依据CRISPR/Cas12a的设计原则,设计了crRNA靶向RT-RAA扩增产物,并优化了RT-CPA-CRISPR/Cas12a反应体系,... 本研究旨在建立一种检测牛病毒性腹泻病毒的RT-CPA-CRISPR/Cas12a方法。选取BVDV的E0蛋白基因序列为基础,设计CPA特异性引物。同时,依据CRISPR/Cas12a的设计原则,设计了crRNA靶向RT-RAA扩增产物,并优化了RT-CPA-CRISPR/Cas12a反应体系,此外,借助建立的该方法,开展了临床样品的检测。结果显示:所建立的检测方法对BVDV的最低检出限为8.0 copies/μL,并具有高度特异性,对42份临床样品检测显示,该方法与传统PCR方法的一致性好,符合率能达到92.86%。该研究建立了牛病毒性腹泻病毒的RT-CPA-CRISPR/Cas12a检测方法,为该病的诊断提供了技术手段。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 交叉引物恒温扩增技术 CRISPR/cas12a 灵敏度 特异性
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CRISPR/Cas9技术:探索lncRNA的自身功能以及在癌症进程中的作用
6
作者 李欣 胡莹 王玉明 《中国生物化学与分子生物学报》 北大核心 2025年第3期364-375,共12页
CRISPR/Cas系统的出现极大推动了基因编辑领域的进步,特别是CRISPR/Cas9系统,已成为生物医学研究的核心工具。长非编码RNA(lncRNA)在基因调控、细胞分化和多种疾病的发展过程中发挥关键作用,尤其在癌症研究中,lncRNA作为癌症生物标志物... CRISPR/Cas系统的出现极大推动了基因编辑领域的进步,特别是CRISPR/Cas9系统,已成为生物医学研究的核心工具。长非编码RNA(lncRNA)在基因调控、细胞分化和多种疾病的发展过程中发挥关键作用,尤其在癌症研究中,lncRNA作为癌症生物标志物和治疗靶点,具有重要的应用前景。然而,由于lncRNA普遍具有低丰度和保守性差等特点,限制了传统手段对其功能的研究。CRISPR/Cas9技术为lncRNA的研究提供了一个高效、灵活且精确的工具,显著加速了该领域的进展。本文首先回顾了CRISPR/Cas9系统的基本原理及其在基因编辑中的广泛应用,包括CRISPR敲除、敲入、干扰和激活等多种功能系统。这些技术不仅可以筛选特定生物过程中的关键lncRNA,还能够用于基因功能研究,探索其在疾病中的作用。本文重点分析了CRISPR/Cas9技术在研究lncRNA功能和调控机制,以及其在肿瘤研究中的关键应用。此外,文章还总结了通过CRISPR/Cas9进行全基因组筛选以识别功能性lncRNA的方法,并探讨了这些lncRNA在癌症细胞增殖、迁移、侵袭以及耐药性中的作用。CRISPR/Cas9敲除系统可以高效敲除lncRNA基因,揭示其在基因调控中的具体功能。同时,CRISPR激活和干扰技术为非编码基因的研究提供了新的思路,通过调控lncRNA的表达水平,进一步探索其在癌症等疾病中的临床应用。文章还探讨了CRISPR技术在未来lncRNA研究中的潜力,尤其是在解决基因组复杂性、靶向效率和脱靶效应等技术难题方面的进展。综上所述,CRISPR/Cas9技术不仅为研究lncRNA提供了强有力的工具,也为未来开发新的癌症诊断和治疗手段提供了新的思路和机会。 展开更多
关键词 成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR/cas9) 长非编码RNA 基因调控 癌症
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CRISPR/Cas9技术(递送)在支气管上皮细胞中的应用和进展
7
作者 张莹莹 王楚雯 钱国清 《中国病理生理杂志》 北大核心 2025年第1期173-180,共8页
规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)技术操作简易、高效,适用性强,在探究呼吸道潜在机制中具有独特优势。支气管上皮细胞是肺部防御的物理屏障,其损伤或功能缺失是慢性气道疾病的发病基础。近年来,慢性气道疾病... 规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)技术操作简易、高效,适用性强,在探究呼吸道潜在机制中具有独特优势。支气管上皮细胞是肺部防御的物理屏障,其损伤或功能缺失是慢性气道疾病的发病基础。近年来,慢性气道疾病发病率升高,但治疗进展相对缓慢,亟需找到治疗的突破口。CRISPR/Cas9系统可以进行精准基因编辑,为慢性气道疾病提供新策略。本文从CRISPR/Cas9的多种递送方式和作用机制出发,对其在原代、永生化支气管上皮细胞和动物体内的应用与进展进行概述,探讨了其发展前景和面临的挑战,以期为未来应用该技术进行气道疾病治疗提供参考。 展开更多
关键词 CRISPR/cas9系统 支气管上皮细胞 基因编辑
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基于CRISPR/Cas系统的生物传感器在环境分析中的应用进展 被引量：2
8
作者 张毅波 马明 +1 位作者 王明仕 常天俊 《环境化学》 北大核心 2025年第3期805-819,共15页
CRISPR/Cas可改造为靶核酸刺激-响应的传感系统,可视为集“分子识别与信号输出”一体的生物传感器,目前在核酸即时诊断中已得到广泛应用.鉴于该系统具有成熟、可靠和可扩展的优点,研究人员尝试将其用于环境分析领域的非核酸分析物检测,... CRISPR/Cas可改造为靶核酸刺激-响应的传感系统,可视为集“分子识别与信号输出”一体的生物传感器,目前在核酸即时诊断中已得到广泛应用.鉴于该系统具有成熟、可靠和可扩展的优点,研究人员尝试将其用于环境分析领域的非核酸分析物检测,已开发了一系列具有应用前景的便携式设备.然而,如何将非核酸靶标信息转换为核酸信息仍存在挑战,这限制了CRISPR/Cas系统在环境分析中的应用推广.为此,本文综述了CRISPR/Cas系统在重金属离子和阴离子、新污染物、农药与真菌毒素以及有害细菌等非核酸靶标检测中的应用进展,重点介绍了构筑非核酸靶标信息转换元件的策略,以期为推进该系统在环境分析中的应用提供支持. 展开更多
关键词 CRISPR/cas 新污染物 核酸适体 RNA-cleaving DNAZYME 生物传感器.
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CAS成为“世界体育最高法庭”何以可能?——基于对国际体育仲裁的批判性思考
9
作者 姜熙 《武汉体育学院学报》 北大核心 2025年第5期43-52,共10页
国际体育仲裁院(CAS)作为国际体育领域最为核心的体育纠纷解决机构已经实质上充当着“世界体育最高法庭”的角色,但当前的CAS制度和仲裁机制却无法真正地胜任“世界体育最高法庭”的职能。运用文献资料法、逻辑分析法、比较法等方法,以... 国际体育仲裁院(CAS)作为国际体育领域最为核心的体育纠纷解决机构已经实质上充当着“世界体育最高法庭”的角色,但当前的CAS制度和仲裁机制却无法真正地胜任“世界体育最高法庭”的职能。运用文献资料法、逻辑分析法、比较法等方法,以CAS建立与兴起的深层逻辑为分析起点,探讨了CAS制度传播后导致的全球各国体育仲裁中心主义路径的依赖。文章批判性地思考了CAS存在的问题,并分析了CAS要成为真正的“世界体育最高法庭”的改革路径。研究发现,CAS的建立和兴起源于国际体育组织对国家司法干预的排斥和“体育自由王国”的维护。CAS制度的传播促成了一个无形的“体育仲裁帝国”形成。通过国际体育组织制度性赋权下的强制管辖权制度设计,国家司法权力在体育领域被消解。然而,CAS面临着过度依赖国际体育组织、仲裁员地域与提名失衡、裁决透明度不足等深层困境,导致其还不是真正意义上的“世界体育最高法庭”。CAS需通过制度重构、透明度提升及程序革新,向兼具效率与公正的全球体育司法机构转型,朝着真正的“世界体育最高法庭”发展,成为“全球体育正义的维护者”。中国应警惕体育仲裁的“制度化陷阱”,打破体育纠纷解决仲裁中心主义的“神话”,平衡司法与仲裁的关系,构建多元纠纷解决机制,推行“阳光仲裁”透明机制,优化仲裁员选拔和提名机制,推动中国体育仲裁的国际化发展。 展开更多
关键词 国际体育 国际体育仲裁院 体育仲裁 体育纠纷 司法主权
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基于CRISPR∕Cas9技术创制抗稻瘟病基因pi21突变体
10
作者 谢留杰 段敏 黄善军 《上海农业学报》 2025年第2期8-15,共8页
利用CRISPR∕Cas9技术对台15-7糯的抗稻瘟病基因pi21进行编辑。选择位于pi21基因第一、第二外显子上的2段序列作为靶点构建双元表达载体pHUE411-pi21-Cas9,通过农杆菌侵染法获得21个以台15-7糯为背景的T0代单株。加代后在149个T1代单株... 利用CRISPR∕Cas9技术对台15-7糯的抗稻瘟病基因pi21进行编辑。选择位于pi21基因第一、第二外显子上的2段序列作为靶点构建双元表达载体pHUE411-pi21-Cas9,通过农杆菌侵染法获得21个以台15-7糯为背景的T0代单株。加代后在149个T1代单株中检测出6个不含载体的纯合突变体,包含3种突变类型,分别命名为pi21-t1、pi21-t2、pi21-t3,每种突变分别导致pi21基因编码的蛋白缺失227、239、99个氨基酸。稻瘟病鉴定结果表明:成熟期时,3种突变体中仅pi21-t3的病斑数量和面积较台15-7糯显著降低,其他2种突变体发病水平与台15-7糯基本相同。除抗稻瘟病能力有所提高外,突变体pi21-t3在成熟期的其他农艺性状,如株高、每穗粒数、结实率等,与台15-7糯没有显著差异。本研究可为抗稻瘟病水稻育种提供借鉴。 展开更多
关键词 CRISPR∕cas9技术 pi21基因 稻瘟病 纯合突变体
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CRISPR-Cas系统的小型化研究进展 被引量：1
11
作者 董颖 马孟丹 黄卫人 《合成生物学》 北大核心 2025年第1期105-117,共13页
CRISPR-Cas基因编辑技术由于其简便性和高效性,已被广泛应用于生物学、医学、农学等领域的基础与应用研究。目前广泛使用的Cas核酸酶均具有较大的分子量(通常大于1000个氨基酸),而广泛应用于基因治疗中的腺相关病毒(AAV)载体的承载容量... CRISPR-Cas基因编辑技术由于其简便性和高效性,已被广泛应用于生物学、医学、农学等领域的基础与应用研究。目前广泛使用的Cas核酸酶均具有较大的分子量(通常大于1000个氨基酸),而广泛应用于基因治疗中的腺相关病毒(AAV)载体的承载容量却十分有限,在容纳CRISPR核酸酶与gRNA的编码序列之余往往难以承载更多其他功能元件,如碱基编辑、转录调控、多基因编辑等相应元件,这严重限制了其在基因治疗等领域的应用。使用紧凑型Cas蛋白变体的CRISPR-Cas系统可能有助于用AAV产生和传递基因组编辑和调节工具到人类细胞。因此,小型化的CRISPR-Cas系统开发是解决这一技术难题的重要途径,本文主要概括了基于Cas9、Cas12和Cas13蛋白系统在小型化方面的研究进展,包括筛选新型Cas蛋白、缩减蛋白结构域以及引导RNA的改造等,旨在为开发微型精准基因编辑和调控工具提供新思路。目前小型化的CRISPR-Cas系统的局限性主要体现在蛋白分子量的大小和基因编辑的效率、特异性不可兼得上,在未来的研究中若能解决这一问题,获得更小型化的结构域,相信不仅能够优化该系统在体内的传递,更有望为临床带来高效率且低损害的治疗方法。 展开更多
关键词 CRISPR-cas系统 小型化cas蛋白 cas蛋白工程化改造 紧凑型cas蛋白 基因调控工具
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靶向RNA的CRISPR/Cas系统及衍生技术 被引量：1
12
作者 周迅 周世杰 +1 位作者 刘捷 王宇祥 《遗传》 北大核心 2025年第8期842-860,共19页
RNA编辑是表观遗传学领域重要的研究方向之一。随着研究的深入,科学家们发现CRISPR/Cas系统不仅可以靶向DNA,也可以靶向RNA,从而实现转录水平的基因精准编辑;同时,使用CRISPR/Cas系统进行RNA编辑也可以避免对基因组的破坏。目前,基于靶... RNA编辑是表观遗传学领域重要的研究方向之一。随着研究的深入,科学家们发现CRISPR/Cas系统不仅可以靶向DNA,也可以靶向RNA,从而实现转录水平的基因精准编辑;同时,使用CRISPR/Cas系统进行RNA编辑也可以避免对基因组的破坏。目前,基于靶向RNA的CRISPR系统已开发出多种衍生技术,如RNA敲低和编辑、核酸检测和成像、RNA示踪等。这些衍生技术的出现,为生物遗传机制解析和疾病治疗提供了有利工具。本文归纳总结了靶向RNA的CRISPR/Cas系统的结构、功能、机制以及开发的衍生技术,以期丰富人们对CRISPR/Cas系统编辑RNA的认知。 展开更多
关键词 基因编辑 CRISPR/cas系统 RNA 功能及应用
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一种基于HDR-CRISPR/Cas9技术快速构建重组鸭肠炎病毒的方法的建立 被引量：1
13
作者 贾文凤 蒋香香 +3 位作者 陶慧丽 王安平 吴植 朱善元 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第1期298-309,共12页
[目的]本研究通过优化试验条件,建立基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速、准确地将外源基因定向插入鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV)基因组的方法,为以DEV为载体的重组疫苗的研制奠定基础。[方法]分离并扩繁DEV疫苗株,测定其... [目的]本研究通过优化试验条件,建立基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速、准确地将外源基因定向插入鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV)基因组的方法,为以DEV为载体的重组疫苗的研制奠定基础。[方法]分离并扩繁DEV疫苗株,测定其病毒滴度。根据DEV疫苗株UL26、UL27基因间非编码区序列,设计合成向导RNA(gRNA),经双链退火获得目的片段,通过基因克隆技术将其插入PX459-V2.0载体获得gRNA-Cas9质粒。同时,通过常规基因克隆技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因插入PVAX-1载体,构建含有真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA的重组表达质粒。以DEV疫苗株基因组为模板,扩增gRNA上、下游同源臂序列,通过融合PCR将同源臂序列与真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA进行连接并克隆至PUC19载体获得供体质粒PUC19-UP-EGFP-DOWN。采用先转染质粒后感染亲本DEV的策略构建重组病毒rDEV-EGFP,通过控制单一变量法优化重组病毒构建的试验条件,根据不同条件下绿色荧光蚀斑数量确定最佳条件。利用有限稀释法筛选并纯化表达绿色荧光的蚀斑,获得重组病毒rDEV-EGFP,并对其进行遗传稳定性及体外复制能力的评估。[结果]PCR扩增及测序结果显示,成功构建靶向DEV基因组UL27与UL26基因间非编码区序列的gRNA-Cas9质粒及包含EGFP真核表达盒的供体质粒。鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast, CEF)中转染gRNA-Cas9及供体质粒后感染DEV,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蚀斑,表明成功利用HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术将EGFP报告基因敲入DEV基因组。优化后的最佳试验条件为:DEV感染复数(MOI)为0.2、gRNA-Cas9质粒与供体DNA转染比例为1∶2、供体DNA的转染形式为DNA片段、转染与感染时间间隔为6 h、重组病毒收取时间为DEV感染后48 h,优化后EGFP报告基因的敲入效率显著提高(P<0.05)。重组病毒rDEV-EGFP在CEF中连续传代15次,EGFP真核表达盒仍稳定整合在UL26与UL27基因之间的非编码区,具有良好的遗传稳定性。生长曲线结果显示,重组病毒rDEV-EGFP在CEF中的复制能力与DEV疫苗株无明显差异,生长趋势一致,具有良好的体外复制能力。[结论]本研究建立了一种基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速构建重组DEV的方法,成功构建了具有良好遗传稳定性及体外复制能力的重组病毒rDEV-EGFP,为重组DEV载体疫苗候选株的研制提供了理论依据及技术平台。 展开更多
关键词 鸭肠炎病毒 CRISPR/cas9基因编辑 重组载体
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Ⅱ类CRISPR/Cas系统及其在细菌合成生物学中的应用
14
作者 李晓晗 李桂萍 +3 位作者 霍彩云 张启龙 孙英健 孙惠玲 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第4期1608-1620,共13页
CRISPR/Cas系统是一种广泛存在于细菌和古细菌中的适应性免疫系统,通过RNA介导的核酸内切酶靶向识别并切割特定的核酸片段,以抵御外来核酸入侵。根据效应蛋白复合物的组成不同,CRISPR/Cas系统可分为两大类:Ⅰ类CRISPR/Cas系统利用多个Ca... CRISPR/Cas系统是一种广泛存在于细菌和古细菌中的适应性免疫系统,通过RNA介导的核酸内切酶靶向识别并切割特定的核酸片段,以抵御外来核酸入侵。根据效应蛋白复合物的组成不同,CRISPR/Cas系统可分为两大类:Ⅰ类CRISPR/Cas系统利用多个Cas蛋白组成的效应复合物与crRNA共同作用来发挥靶链切割功能,而Ⅱ类CRISPR/Cas系统则由单个多结构域蛋白组成效应子模块。其中,单一组分效应蛋白介导的Ⅱ类CRISPR基因编辑技术相对简便,近年来已被广泛应用于细菌基因表达调控、遗传修饰、代谢途径优化以及病原微生物检测等合成生物学相关领域。根据Cas效应蛋白核酸酶结构域的差异,Ⅱ类系统又可进一步分为Ⅱ型、V型和VI型三个亚型,不同亚型的系统在细菌合成生物学中的应用也存在差异。本文综述了Ⅱ类CRISPR-Cas系统的免疫学机制、分类与特点,及其在工业细菌中的应用现状与最新进展,旨在为未来细菌合成生物学研究中选择、优化和探索更多的CRISPR/Cas系统提供参考。 展开更多
关键词 CRISPR/cas系统 细菌 基因编辑 合成生物学 效应蛋白
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CRISPR/Cas12a基因编辑技术在植物中的研究进展 被引量：2
15
作者 霍贯中 张欣濡 +1 位作者 田士军 李君 《生物技术通报》 北大核心 2025年第6期1-11,共11页
CRISPR/Cas系统是细菌和古生菌长期进化形成的适应性免疫系统,科研人员对其进行开发和优化,建立了CRISPR/Cas9基因编辑技术、CRISPR/Cas12a基因编辑技术、单碱基编辑技术和引导编辑技术,为生命科学研究提供了众多基因编辑工具。这些基... CRISPR/Cas系统是细菌和古生菌长期进化形成的适应性免疫系统,科研人员对其进行开发和优化,建立了CRISPR/Cas9基因编辑技术、CRISPR/Cas12a基因编辑技术、单碱基编辑技术和引导编辑技术,为生命科学研究提供了众多基因编辑工具。这些基因编辑工具能够高效精准地编辑目的基因组,产生各种类型的突变体,在基因功能研究、疾病模型构建、基因治疗以及作物育种等领域展现出巨大的应用潜力。CRISPR/Cas12a作为Ⅱ类Ⅴ型成员,Cas12a(Cpf1)核酸酶分子量较小,识别TTTV PAM序列,仅依赖单个crRNA结构,且无需tracrRNA的加工,操作简单以及具有多基因编辑等优点备受关注。CRISPR/Cas12a基因编辑技术自开发以来,已经成功应用在各种动植物基因组编辑中,为基因治疗及作物育种等提供重要技术支撑。本文详细介绍了CRISPR/Cas12a基因编辑技术的原理及基于CRISPR/Cas12a开发的碱基编辑和引导编辑技术,重点阐述了通过提高基因编辑效率、扩展靶向编辑范围和提高特异性等方面对CRISPR/Cas12a进行优化的策略,着重总结了该技术在植物遗传改良方面的应用,以期为CRISPR/Cas12a在植物中的进一步应用提供参考。 展开更多
关键词 CRISPR/cas12a 基因组编辑 优化 遗传改良
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CRISPR/Cas系统在寄生虫病诊断领域的研究进展
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作者 刘浩 张昊 +2 位作者 张艳敏 张丽丽 王文龙 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第6期2809-2817,共9页
多年来动物寄生虫病主要依靠传统镜检与PCR技术结合的方式进行诊断,在临床中确实起到了明显的防治效果,也控制了一些寄生虫病的流行。但寄生虫病多是慢性消耗性疾病,早期诊断尤为重要,而传统方法的灵敏度、简便性不能满足彻底控制寄生... 多年来动物寄生虫病主要依靠传统镜检与PCR技术结合的方式进行诊断,在临床中确实起到了明显的防治效果,也控制了一些寄生虫病的流行。但寄生虫病多是慢性消耗性疾病,早期诊断尤为重要,而传统方法的灵敏度、简便性不能满足彻底控制寄生虫病的需求。因此,亟需灵敏度更高、便捷性更强的检测方法。近年来,CRISPR/Cas系统不断发展,已发现了多种Cas蛋白的功能,并广泛应用于寄生虫病原的核酸检测。研究人员针对第2类CRISPR/Cas系统中的Cas13与Cas12蛋白与重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)或PCR联用,筛选特异性靶标序列并设计crRNA,之后与Cas12、Cas13蛋白和荧光报告基团组成CRISPR/Cas核酸检测系统,可用于多种寄生虫病的诊断,具有快速、精准、便捷和廉价等特点,适用于现场检测,具有巨大的市场应用潜力。笔者就CRISPR/Cas系统的作用机制和分类,以及近年来其在寄生虫病核酸检测领域的研究进展进行综述,以期为寄生虫病的早期诊断提供参考依据。 展开更多
关键词 CRISPR/cas系统 cas13 cas12 crRNA 核酸检测
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CRISPR/Cas9介导的doublesex基因敲除导致草地贪夜蛾雄成虫翅发育畸形 被引量：1
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作者 张浩楠 顾俊文 +3 位作者 张昕达 魏巍 康秋阁 张琪 《昆虫学报》 北大核心 2025年第6期720-727,共8页
【目的】通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda双性基因doublesex(Sfdsx)单靶点敲除,旨在探究Sfdsx对草地贪夜蛾雄成虫翅发育的影响。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对草地贪夜蛾胚胎Sfdsx雌雄共有区域... 【目的】通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda双性基因doublesex(Sfdsx)单靶点敲除,旨在探究Sfdsx对草地贪夜蛾雄成虫翅发育的影响。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对草地贪夜蛾胚胎Sfdsx雌雄共有区域进行敲除,构建Sfdsx突变体;待化蛹后,在显微镜下观察草地贪夜蛾Sfdsx突变体蛹及成虫翅的形态特征差异。【结果】草地贪夜蛾Sfdsx突变体出现显著的性别比趋于雄性(雌∶雄=0∶14),位于腹部第8-9节的雄蛹生殖孔两侧发生严重扭曲;雄成虫突变体的翅性状趋向性别中间态,其中,前翅中央的肾形斑变形、翅末端黑斑消失、翅鳞片排列错乱。后翅翅展畸形,翅鳞片排列发生改变,着生小黑斑。【结论】CRISPR/Cas9介导的Sfdsx基因公共区域的敲除导致草地贪夜蛾雄成虫翅发育畸形。本研究的结果为利用昆虫不育技术(sterile insect technology,SIT)调控草地贪夜蛾的发育提供了理想的基因靶标和理论依据。 展开更多
关键词 草地贪夜蛾 基因敲除 CRISPR/cas9 DOUBLESEX 翅发育
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基于RPA-CRISPR/Cas12a的杰克贝尔氏粉蚧可视化快速检测体系建立 被引量：1
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作者 陈燕婷 史梦竹 +4 位作者 胡美玲 陈彦 杨秀娟 赵建伟 李建宇 《昆虫学报》 北大核心 2025年第6期830-839,共10页
【目的】本研究旨在利用重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)-CRISPR/Cas12a技术建立一套对杰克贝尔氏粉蚧Pseudococcus jackbeardsleyi进行快速、灵敏、便捷和可视化的荧光检测和侧向流层析检测(lateral f... 【目的】本研究旨在利用重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)-CRISPR/Cas12a技术建立一套对杰克贝尔氏粉蚧Pseudococcus jackbeardsleyi进行快速、灵敏、便捷和可视化的荧光检测和侧向流层析检测(lateral flow assay)体系,以实现在田间或者口岸等资源受限场所的现场实时检测。【方法】基于杰克贝尔氏粉蚧28S rDNA基因序列设计RPA特异性引物和crRNA,分别对杰克贝尔氏粉蚧与其他9种粉蚧(木瓜秀粉蚧Paracoccus marginatus、石蒜绵粉蚧Phenacoccus solani、扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis、柑橘臀纹粉蚧Planococcus citri、南洋臀纹粉蚧Planococcus lilacinus、新菠萝灰粉蚧Dysmicoccus neobrevipes、大洋臀纹粉蚧Planococcus minor、柑橘棘粉蚧Pseudococcus cryptus和奥德曼粉蚧Pseudococcus odermatti)进行RPA和CRISPR/Cas12a检测,验证该体系的特异性。对RPA-CRISPR/Cas12a检测体系进行条件优化,包括RPA反应时间、Cas12a和crRNA的浓度比及其浓度、荧光报告分子FQ Reporter的浓度、试纸条报告分子LF Reporter的浓度以及CRISPR/Cas12a体系反应时间,筛选获得最佳检测体系。【结果】利用设计的RPA特异性引物的RPA体系可扩增出一条201 bp的杰克贝尔氏粉蚧28S rDNA基因片段,结合CRISPR/Cas12a反应体系,可特异性地将杰克贝尔氏粉蚧与其他9种粉蚧区分开,并呈现可视化结果。通过条件优化建立的对杰克贝尔氏粉蚧的最适RPA-CRISPR/Cas12a检测体系中,RPA反应时间为20 min,Cas12a和crRNA浓度比为1∶1且在体系中的浓度均为50 nmol/L,LF Reporter浓度为500 nmol/L,LF Reporter浓度为800 nmol/L,荧光检测体系和侧向流层析检测体系的反应时间分别为5和20 min。【结论】本研究建立了一套杰克贝尔氏粉蚧RPA-CRISPR/Cas12a检测体系,具有高特异性、快速(25~40 min)、不依赖仪器设备且结果可视化的优点。该检测体系在入侵粉蚧的早期识别和现场检测具有重要的应用价值,为制定合理的管理策略提供了指导。 展开更多
关键词 杰克贝尔氏粉蚧 重组酶聚合酶扩增 CRISPR/cas12a检测 荧光检测 侧向流层析检测
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基于CRISPR-Cas9的黄瓜Csago1c突变体创制及其种子萌发分析 被引量：1
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作者 况勇 肖逸 +3 位作者 管丽丽 孙照龙 李俊 甘德芳 《核农学报》 北大核心 2025年第8期1617-1629,I0002-I0004,共16页
Argonaute(AGO)蛋白是RNA诱导的基因沉默复合体的核心组分,参与调控植物生长发育及逆境胁迫响应等生物学过程。为探讨黄瓜Cs AGO1c基因的功能,利用CRISPR/Cas9技术构建黄瓜Cs AGO1c基因编辑载体,农杆菌介导法转化新泰密刺自交系,经筛选... Argonaute(AGO)蛋白是RNA诱导的基因沉默复合体的核心组分,参与调控植物生长发育及逆境胁迫响应等生物学过程。为探讨黄瓜Cs AGO1c基因的功能,利用CRISPR/Cas9技术构建黄瓜Cs AGO1c基因编辑载体,农杆菌介导法转化新泰密刺自交系,经筛选和分子检测获得CsAGO1c基因突变植株,分析Csago1c突变体的编辑情况、突变体植株的表型以及种子萌发情况。结果表明,试验获得4株转基因抗性苗(T_(0)),其中#4和#12为编辑植株,#7和#11未发生编辑;但#7植株在T1代出现了大片段碱基缺失、少数碱基缺失、单碱基插入以及碱基替换等多种编辑情况。突变体植株在叶片形状、节间长、卷须、侧枝、雄花和雌花着生节位等与对照均无明显差异,但突变体种子萌发率降低,推测Cs AGO1c可能参与调控黄瓜种子的萌发过程。该研究结果对探明黄瓜Cs AGO1c基因功能以及对黄瓜遗传改良和新品种选育具有重要理论指导意义。 展开更多
关键词 黄瓜 Argonaute(AGO)蛋白 CRISPR/cas9 基因编辑 种子萌发
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基于CRISPR/Cas系统的免扩增核酸检测技术研究进展
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作者 沈兴 李妍 +5 位作者 张旭 盖作启 刘艳 黄颖茵 雷红涛 陈佳虹 《华南理工大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第1期136-146,共11页
成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)是来源于古细菌的一种免疫系统,可在特定向导RNA的引领下对外来核酸进行识别与切割。由于具有高特异性靶标识别能力以及靶激活的核酸酶活性,近年来该系统被广泛应用于核酸检测领域。为实现高灵敏检测... 成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)是来源于古细菌的一种免疫系统,可在特定向导RNA的引领下对外来核酸进行识别与切割。由于具有高特异性靶标识别能力以及靶激活的核酸酶活性,近年来该系统被广泛应用于核酸检测领域。为实现高灵敏检测,成簇规则间隔短回文重复序列及相关基因编码的系统(CRISPR/Cas)通常需与预扩增技术相结合,但这同时带来了扩增子气溶胶污染、依赖专有设备、检测时间延长等问题。因此,许多研究人员致力于开发免扩增CRISPR核酸检测技术以解决上述限制。CRISPR/Cas靶向激活的高周转率非特异性切割活性为这种技术的开发提供了可能性,利用各种提高系统反式切割效率或者增强信号的策略,许多免扩增CRISPR核酸检测技术被成功开发出来。该文综述了近年开发的基于CRISPR的免扩增核酸检测技术,依据策略不同将这些技术分为Cas效应器的联用或构筑生化回路、电化学传感、微体积CRISPR/Cas系统、优化信号报告物等4个方面,并从策略的角度分析了这些技术实现免扩增核酸检测的原理,即通过累积多个蛋白复合物传导的信号、增强信号传感能力、提高反应体系浓度、放大报告底物信号等原理实现灵敏度提升。基于已有的技术原理,该文对几种策略的优缺点进行讨论。此外,该文进一步展望免扩增CRISPR核酸检测技术的发展趋势并提出未来可能的研究方向,为开发更快速、灵敏、简便的分子检测技术以促进其更深入的应用提供参考。 展开更多
关键词 CRISPR/cas 核酸检测 免扩增 信号放大
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