CHO细胞基因组内稳定表达位点NW_003624203.1的鉴定

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作者 谢润锋 朱梦娟 +2 位作者 石宇 陈东锋 徐庆刚 《四川动物》 北大核心 2025年第4期384-394,共11页

通过慢病毒感染CHO-K1细胞,以随机整合方法将ZsGreen1报告基因整合到CHO-K1基因组。经过连续多代的筛选,获得稳定表达ZsGreen1蛋白的重组CHO-K1细胞株。利用TAIL-PCR技术分离ZsGreen1报告基因在CHO-K1基因组内的整合位点,并利用CRISPR/C... 通过慢病毒感染CHO-K1细胞,以随机整合方法将ZsGreen1报告基因整合到CHO-K1基因组。经过连续多代的筛选,获得稳定表达ZsGreen1蛋白的重组CHO-K1细胞株。利用TAIL-PCR技术分离ZsGreen1报告基因在CHO-K1基因组内的整合位点,并利用CRISPR/Cas9技术和Bxb1整合酶系统在该位点定点整合了橙色荧光蛋白mOrange2基因和抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体基因,以验证该位点稳定表达外源蛋白的能力。结果表明,分离的稳定表达位点在CHO-K1细胞基因组NW_003624203.1上,位于616 bp处。定点整合构建的重组细胞在连续60代无血清悬浮培养过程中,能够稳定表达橙色荧光蛋白,并能稳定分泌表达单克隆抗体,培养上清中单克隆抗体含量可达14.9~21.6 mg·L-1。证实NW_003624203.1位点是CHO细胞基因组内的稳定表达位点,为使用位点特异性整合技术构建重组CHO细胞株提供了一种可行的方法。 展开更多

关键词 中国仓鼠卵巢(cho) 稳定表达位点 位点特异性整合 CRISPR/Cas9 Bxb1整合酶

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定点整合β1,4半乳糖基转移酶、α-2,6-唾液酸转移酶1和N-乙酰氨基糖基转移酶Ⅲ的CHO工程细胞株构建

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作者 李仙红 贾润清 +4 位作者 王友亮 漫未玲 朱天昊 阎新龙 林艳丽 《中国生物化学与分子生物学报》 北大核心 2025年第4期576-585,共10页

对哺乳动物细胞CHO进行糖基化改造,用于生产蛋白质类药物。首先测定CHO细胞Rosa26位点的基因组序列,设计gRNA序列,利用规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)技术,将着陆架整合到CHO细胞的Rosa26位点处。通过重叠PCR及无缝连接技术构建... 对哺乳动物细胞CHO进行糖基化改造,用于生产蛋白质类药物。首先测定CHO细胞Rosa26位点的基因组序列,设计gRNA序列,利用规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)技术,将着陆架整合到CHO细胞的Rosa26位点处。通过重叠PCR及无缝连接技术构建3个糖基转移酶共同表达的打靶载体,分别是β1,4半乳糖基转移酶(B4GALT1)、α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6GAL1)和N-乙酰氨基糖基转移酶Ⅲ(GnTⅢ),并利用重组酶介导的盒式交换技术(recombinase-mediated cassette exchange,RMCE)将3个糖基转基因酶基因定点整合到CHO Rosa26位点中。PCR证实了3个糖基转移酶成功定点整合Rosa26位点,qRT-PCR证实3个糖基转移酶的mRNA表达水平均在50000倍以上,蛋白质免疫印迹法证实3个糖基转移酶的蛋白质表达水平均在4倍以上(P<0.001)。成功构建了Rosa26位点定点整合3个糖基转移酶的CHO工程细胞株。 展开更多

关键词 β-1 4半乳糖基转移酶 α-2 6-唾液酸转移酶1 N-乙酰氨基糖基转移酶Ⅲ 规律成簇的间隔短回文重复技术 重组酶介导的盒式交换技术 中国仓鼠卵巢细胞

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基于位点特异性整合评价CHO细胞表达系统启动子活性的研究

3

作者 鲁晨 王子玉 +4 位作者 蔡燕飞 邓勇强 金坚 丁学峰 陈蕴 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期1400-1408,共9页

工业生产上中国仓鼠卵巢细胞(CHO)药物蛋白质的表达水平受多种因素影响:调控元件对转录翻译的影响、基因组整合位点的影响以及表达系统的影响等。转录作为基因表达第一步,较大程度影响蛋白质的表达,其中启动子在转录起始发挥至关重要的... 工业生产上中国仓鼠卵巢细胞(CHO)药物蛋白质的表达水平受多种因素影响:调控元件对转录翻译的影响、基因组整合位点的影响以及表达系统的影响等。转录作为基因表达第一步,较大程度影响蛋白质的表达,其中启动子在转录起始发挥至关重要的作用。启动子筛选大部分通过瞬时转染或随机整合,但存在拷贝数不明确或整合位点随机等而无法准确评价启动子活性。位点特异性整合在一定程度上降低位置效应对外源基因造成的影响,并有可能提高外源基因的表达水平。本课题组前期在CHO细胞基因组中发现并验证了多个可稳定表达外源蛋白质的位点,本研究选择其中1个位点(2c6)用于启动子活性的评价。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别将猿猴病毒早期启动子(SV40)、小鼠延伸因子-1α(mEF-1α)、鸡β-肌动蛋白(cACTB)启动子和人磷酸甘油酸激酶启动子(hPGK)调控的报告基因(EGFP)表达盒定点整合至2c6位点上。通过流式分选仪分析细胞平均荧光强度,qPCR检测EGFP的mRNA水平,综合评价启动子的活性。结果表明,mEF-1α和cACTB启动子的活性优于SV40和hPGK。2次流式分选结果表明,位点特异性整合可以更为精确评价CHO细胞表达系统启动子活性。 展开更多

关键词 启动子评价 定点整合 中国仓鼠卵巢细胞 CRISPR/Cas9

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转基因下游MAR在稳定转化的CHO细胞中对基因表达的调控作用 被引量：4

4

作者 张俊河 张艳芳 +2 位作者 王芳 杨献军 王天云 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2009年第18期8359-8361,共3页

[目的]探讨转基因下游MAR在稳定转化的CHO细胞中对基因表达的调控作用。[方法]将PCR扩增得到的人β-珠蛋白MAR插入到真核表达载体pCATG的下游,构建转基因表达盒3′端含MAR的表达载体。酶切鉴定正确后,转染CHO细胞,G418筛选出稳定转化的... [目的]探讨转基因下游MAR在稳定转化的CHO细胞中对基因表达的调控作用。[方法]将PCR扩增得到的人β-珠蛋白MAR插入到真核表达载体pCATG的下游,构建转基因表达盒3′端含MAR的表达载体。酶切鉴定正确后,转染CHO细胞,G418筛选出稳定转化的细胞株,ELISA分析转基因的表达水平,半定量PCR分析转基因相对拷贝数。[结果]结果表明,表达盒3′端含MAR序列能使转基因表达水平降低,其基因拷贝数则有一定程度的增加。转基因下游β-珠蛋白MAR在一定程度上能抑制外源基因的表达水平;外源基因表达量与基因拷贝数不成正比,未呈现出"拷贝数依赖性"。[结论]该研究结果为进一步研究MAR的调控机制奠定基础。 展开更多

关键词 核基质结合区 cho细胞 转基因 报告基因

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PcDNA4/His C-MBL表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达 被引量：11

5

作者 白志军 张丽芸 +2 位作者 林佐贤 卢晓 陈政良 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2004年第8期859-863,共5页

目的构建PcDNA4/HisC-MBL表达载体,在哺乳细胞中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)。方法应用PCR从含有中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM-MBL中扩增目的基因片段,将其克隆至PcDNA4/HisC真核表达载体。经酶切及测序鉴定后,以电穿孔法转染CHO细... 目的构建PcDNA4/HisC-MBL表达载体,在哺乳细胞中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)。方法应用PCR从含有中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM-MBL中扩增目的基因片段,将其克隆至PcDNA4/HisC真核表达载体。经酶切及测序鉴定后,以电穿孔法转染CHO细胞,以RT-PCR分析其mRNA表达,通过Ni-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白并以SDS-PAGE和Western-blotting鉴定,以其为免疫原免疫小鼠后取鼠血清进行ELISA检测分析目的蛋白的免疫活性。结果从pGEM-MBL中扩增得到约750bp的cDNA片段,构建成重组载体经酶切出现约5100和750bp片段,测序鉴定与预期的完全一致。RT-PCR证实转染细胞有MBLmRNA表达,纯化蛋白经SDS-PAGE电泳可见约29000、58000和87000条带,其中29000蛋白带可与6-His抗体反应。纯化蛋白免疫小鼠所获抗血清ELISA效价是1∶819200,与天然人MBL和重组MBL三聚体糖识别域反应的ELISA效价均为1∶25600。结论获得了表达中国人MBL的CHO细胞株和重组人MBL,为MBL分子的进一步研究提供了条件。 展开更多

关键词 甘露聚糖结合凝集素 表达载体 cho细胞

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重组血小板糖蛋白Ibα活性片段在CHO细胞中表达及其功能研究 被引量：3

6

作者 赵益明 邵波静 +2 位作者 董宁征 沈飞 阮长耿 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期108-111,共4页

目的:建立表达重组糖蛋白Ibα活性片段(rGPIbαH1-V289)细胞株,并且纯化其表达产物,研究其生物学功能。方法:利用脂质体将含有编码GPIbαH1-V289的DNA质粒pCMV3转染CHO细胞。用亲和层析法纯化重组片段。用SDS-PAGE和Western blot鉴定纯... 目的:建立表达重组糖蛋白Ibα活性片段(rGPIbαH1-V289)细胞株,并且纯化其表达产物,研究其生物学功能。方法:利用脂质体将含有编码GPIbαH1-V289的DNA质粒pCMV3转染CHO细胞。用亲和层析法纯化重组片段。用SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化产品的纯度和免疫学活性。用血小板聚集法检测纯化产品对瑞斯托霉素诱导血小板聚集功能的影响。用ELISA测定纯化产品对vWF与血小板结合能力的影响。结果:每1L培养上清液可纯化到6.15mgrGPIbαH1-V289重组产品。SDS-PAGE显示,纯化的重组片段主要在42kD处显一蛋白区带,Western blot显示,抗GPIbα单抗SZ-2能与重组片段在42kD处显单一蛋白区带。纯化重组片段能抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集功能。ELISA测定显示纯化产品抑制血浆vWF与血小板的结合能力。结论:CHO细胞株A1能恒定表达rGPIbαH1-V289,重组片段具有较高的纯度、免疫学活性和生物学活性,有可能开发为有效的抗血栓药物。 展开更多

关键词 cho细胞 重组糖蛋白Ibα 表达 纯化

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Bcl-2蛋白对环匹阿尼酸诱导CHO细胞凋亡的保护作用 被引量：3

7

作者 黎明涛 苏兴文 +3 位作者 孙娟 邱鹏新 伍宇平 颜光美 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 1998年第3期184-187,共4页

Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色和ＤＮＡ电泳分析揭示了内质网钙泵抑制剂环匹阿尼酸（ＣＰＡ）呈浓度依赖性地诱导ＣＨＯ细胞凋亡，表现出染色体固缩和ＤＮＡ片断形成的典型特征．Ｂｃｌ－２的过度表达对ＣＰＡ诱导的ＣＨＯ细胞凋亡具有... Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色和ＤＮＡ电泳分析揭示了内质网钙泵抑制剂环匹阿尼酸（ＣＰＡ）呈浓度依赖性地诱导ＣＨＯ细胞凋亡，表现出染色体固缩和ＤＮＡ片断形成的典型特征．Ｂｃｌ－２的过度表达对ＣＰＡ诱导的ＣＨＯ细胞凋亡具有保护作用．采用Ｆｕｒａ－２技术测定细胞内游离钙浓度（［Ｃａ２＋］ｉ）变化，观察到Ｂｃｌ－２对ＣＰＡ触发的细胞Ｃａ２＋库Ｃａ２＋释放无任何影响．结果表明Ｂｃｌ－２蛋白对ＣＰＡ诱导的ＣＨＯ细胞凋亡的保护作用不是通过抑制ＣＰＡ诱导的Ｃａ２＋释放。 展开更多

关键词 BCL-2蛋白 环匹阿尼酸 细胞凋亡 钙 保护作用

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表达IFNα2b-HSA融合蛋白的CHO细胞培养基优化及发酵放大 被引量：2

8

作者 蔡燕飞 李成媛 +5 位作者 张晶晶 缪亚娜 刘克东 熊文典 陈蕴 金坚 《化工进展》 EI CAS CSCD 北大核心 2016年第B11期311-314,共4页

毕赤酵母表达的干扰素与白蛋白融合蛋白虽然避开了干扰素单体半衰期短的缺陷,但毕赤酵母对药物的糖基化修饰与人体的糖基化修饰差异性导致了药物的毒副作用。目前药物在CHO系统的表达得到了广泛应用。本研究室首次构建了能表达干扰素α2... 毕赤酵母表达的干扰素与白蛋白融合蛋白虽然避开了干扰素单体半衰期短的缺陷,但毕赤酵母对药物的糖基化修饰与人体的糖基化修饰差异性导致了药物的毒副作用。目前药物在CHO系统的表达得到了广泛应用。本研究室首次构建了能表达干扰素α2b和人血清白蛋白融合蛋白（IFNα2b-HSA）的CHO细胞株。在此基础上,本研究通过对12种国产商业化基础无血清培养基和5种流加培养基进行优化筛选,获得最适培养方案：基础培养基选择最适于生长的5号培养基（M2∶M4=1∶1）,流加培养基选择最有适于表达的F4培养基。在此基础上,进行5L生物反应器的发酵放大,pH为6.9-7.4,DO为40%-60%,细胞密度达到7.0×106cells/mL时,温度由37℃降温至34℃,细胞活率降至80%时停止发酵,最终融合蛋白表达量达到137mg/L。初步实现了IFNα2b-HSA融合蛋白在CHO细胞中的高密度发酵。 展开更多

关键词 干扰素Α2B 白蛋白 cho细胞

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用转染m2胆碱受体基因的CHO细胞观察知母皂甙元的作用 被引量：3

9

作者 施菊 胡雅儿 +1 位作者 易宁育 夏宗勤 《上海第二医科大学学报》 CSCD 2000年第6期503-505,共3页

目的观察知母甾体皂甙元 (sarsasapogenin ,SAR)对M2 受体亚型的调节作用。　方法采用转染了m2胆碱受体基因的CHO细胞为模型 ,以非选择性的3H -QNB作单点放射配基结合分析。　结果CHOm2细胞受体密度在培养 48h达顶峰 ,以后呈进行性下降... 目的观察知母甾体皂甙元 (sarsasapogenin ,SAR)对M2 受体亚型的调节作用。　方法采用转染了m2胆碱受体基因的CHO细胞为模型 ,以非选择性的3H -QNB作单点放射配基结合分析。　结果CHOm2细胞受体密度在培养 48h达顶峰 ,以后呈进行性下降。SAR对下降的CHOm2细胞M2 受体密度有明显的上调作用 ,这一作用有一定浓度依赖性。　结论SAR对下降的M2 受体密度具有上调作用。 展开更多

关键词 M2受体亚型 chom2细胞 知母皂甙元 放射配基分析

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t－PA　cDNA基因在CHO细胞中的稳定表达 被引量：1

10

作者 彭鲁英 涂宣林 +3 位作者 朱慧 张艳玲 陈幼妹 宋后燕 《上海医科大学学报》 CSCD 1996年第3期163-165,共3页

建立稳定表达人组织型纤溶酶原激活剂（ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔ－ＰＡ）的细胞株。将ｔ－ｐＡｃＤＮＡ连接在真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＨｉｎｄⅢ位点，构建成重组质粒ｐｃＤＮＡ３ｔＰ... 建立稳定表达人组织型纤溶酶原激活剂（ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔ－ＰＡ）的细胞株。将ｔ－ｐＡｃＤＮＡ连接在真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＨｉｎｄⅢ位点，构建成重组质粒ｐｃＤＮＡ３ｔＰＡ，用磷酸钙介导的贴壁细胞转染法导入哺乳动物中国仓鼠卵巢（ＣＨＯ）细胞中，Ｇ４１８筛选培养后形成阳性克隆。结果：培养液中重组ｔ－ｐＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔ－ｐＡ，ｒｔ－ｐＡ）活性＞６０００ＩＵ／１０６细胞ｄ－１．Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交证实ｔ－ＰＡｃＤＮＡ基因的转录。高表达细胞连续传代１０次后，培液中ｒｔ－ｐＡ活性未见明显变化。结论：转染ｔ－ＰＡｃＤＮＡ基因的ＣＨＯ细胞已形成稳定的工程细胞。 展开更多

关键词 T-PA cDNAADLD 卵巢细胞 稳定表达 cho

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细胞自噬在多囊卵巢综合征中的作用及中药干预研究进展

11

作者 李鹤 蔺文娟 +5 位作者 袁荣荣 黄灿灿 万文文 芮守月 张舒媛 张小花 《世界中医药》 北大核心 2025年第4期691-695,702,共6页

细胞自噬是一种独特的自我吞噬性细胞死亡方式,直接参与并影响了多囊卵巢综合征(PCOS)的发生、发展与转归,阻止颗粒细胞自噬、促进卵母细胞自噬、抑制卵泡膜细胞自噬可以有效地预防并改善PCOS患者的卵巢损伤。中药单体及中药复方可有效... 细胞自噬是一种独特的自我吞噬性细胞死亡方式,直接参与并影响了多囊卵巢综合征(PCOS)的发生、发展与转归,阻止颗粒细胞自噬、促进卵母细胞自噬、抑制卵泡膜细胞自噬可以有效地预防并改善PCOS患者的卵巢损伤。中药单体及中药复方可有效调控卵巢细胞自噬。 展开更多

关键词 细胞自噬 多囊卵巢综合征 PCOS 中药 研究进展 卵巢颗粒细胞 卵母细胞 卵泡膜细胞

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CD80/IgG融合基因真核表达载体的构建及在CHO细胞中的表达

12

作者 何伟 邹萍 张敏 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期1182-1186,共5页

目的:构建CD80/IgG真核表达载体,使其在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中呈分泌型表达,为白血病免疫基因治疗的研究奠定基础。方法:采用多聚酶链反应(PCR)技术分别从小鼠脾细胞和含小鼠CD80全长互补DNA(cDNA)的质粒pcDNA/B7中扩增出免疫球蛋白I... 目的:构建CD80/IgG真核表达载体,使其在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中呈分泌型表达,为白血病免疫基因治疗的研究奠定基础。方法:采用多聚酶链反应(PCR)技术分别从小鼠脾细胞和含小鼠CD80全长互补DNA(cDNA)的质粒pcDNA/B7中扩增出免疫球蛋白IgG1的Fc段和CD80胞外区,以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.0中,获得重组表达载体pcDNA/CD80-IgG;采用脂质体转染技术转染CHO细胞,G418筛选得到稳定表达细胞株;免疫印迹、斑点ELISA及流式细胞术鉴定融合蛋白的表达,并初步检测其活性。结果:DNA测序证明两段基因正确克隆至pcDNA3.0的多克隆位点,CHO细胞的培养上清中可检测到融合蛋白的表达,其分子量大小和预期的基本一致,该融合蛋白可提高白血病细胞表面CD80的表达。结论:成功构建pcDNA/CD80-IgG真核表达载体,并在CHO细胞中分泌性表达有活性的CD80-IgG融合蛋白。 展开更多

关键词 融合基因蛋白质类 CD80/IgG 免疫逃逸 免疫疗法 中国仓鼠卵巢细胞

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弱化抗性标记筛选高表达CHO细胞株的方法建立 被引量：3

13

作者 刘苏 田浤 +1 位作者 王驰 姚文兵 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期617-622,共6页

为了优化中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达体系,建立高表达CHO细胞株筛选方法,将外源基因表达载体上抗性筛选基因表达的新霉素磷酸转移酶(NPT)的261位氨基酸天冬氨酸突变成甘氨酸。经G418筛选,转染含突变型NPT表达载体的细胞存活率显著低于转... 为了优化中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达体系,建立高表达CHO细胞株筛选方法,将外源基因表达载体上抗性筛选基因表达的新霉素磷酸转移酶(NPT)的261位氨基酸天冬氨酸突变成甘氨酸。经G418筛选,转染含突变型NPT表达载体的细胞存活率显著低于转染含野生型NPT表达载体的细胞存活率。以绿色荧光蛋白-抗体Ig G1 Fc结构域融合蛋白为报告基因,验证了突变后新霉素磷酸转移酶对抗生素G418抗性减弱。经G418持续加压培养3周后,转染含突变型NPT表达载体的细胞中EGFP的表达量显著高于转染含野生型NPT表达载体的细胞,表明其具有筛选出高表达单克隆细胞株的潜力。 展开更多

关键词 中国仓鼠卵巢细胞 新霉素磷酸转移酶 增强型绿色荧光蛋白 高表达系统

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外源蛋白在CHO细胞染色体上一个新位点的定点整合和稳定表达 被引量：2

14

作者 胡湾湾 丁学峰 +4 位作者 蔡燕飞 陈蕴 段作营 金坚 李华钟 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第4期487-495,共9页

寻找中国仓鼠卵巢(CHO)细胞染色体上稳定表达位点是解决CHO细胞长期培养表达不稳定问题的有效手段。本课题组前期利用慢病毒转染将示踪基因(Zsgreen1)整合CHO细胞染色体上并发现多个潜在稳定表达位点。本研究验证了其中一个位点稳定表... 寻找中国仓鼠卵巢(CHO)细胞染色体上稳定表达位点是解决CHO细胞长期培养表达不稳定问题的有效手段。本课题组前期利用慢病毒转染将示踪基因(Zsgreen1)整合CHO细胞染色体上并发现多个潜在稳定表达位点。本研究验证了其中一个位点稳定表达外源蛋白的能力,该位点位于染色体NW_003614241.1上148052~148157 bp区域。首先观察Zsgreen1基因的表达情况,随后采用CRISPR/Cas9技术将增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因定点整合至该位点,获得3株EGFP基因定点整合的细胞,经60代悬浮培养,细胞荧光强度无明显变化,证明此位点可稳定表达EGFP基因。采用同样方法构建了表达人血清白蛋白(HSA)基因的重组CHO细胞株,经Western blot验证,此位点可分泌表达HSA,表明上述位点可定点整合和稳定表达外源蛋白。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9 定点整合 稳定表达 新位点 中国仓鼠卵巢细胞

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金纳米粒子对CHO-K1细胞毒性的谷胱甘肽作用机制 被引量：2

15

作者 李武珊 陈丽君 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期234-239,共6页

目的探讨金纳米粒子(AuNP)对卵巢细胞CHO-K1的毒性作用及谷胱甘肽(GSH)的对抗作用。方法 AuNP 10～100μmol.L-1作用卵巢细胞CHO-K1 72 h,MTT比色法检测细胞存活。AuNP10μmo.lL-1,丁硫氨酸-亚砜亚胺(BSO)20μmo.lL-1及GSH 1 mmo.l L-... 目的探讨金纳米粒子(AuNP)对卵巢细胞CHO-K1的毒性作用及谷胱甘肽(GSH)的对抗作用。方法 AuNP 10～100μmol.L-1作用卵巢细胞CHO-K1 72 h,MTT比色法检测细胞存活。AuNP10μmo.lL-1,丁硫氨酸-亚砜亚胺(BSO)20μmo.lL-1及GSH 1 mmo.l L-1单独或联合作用细胞72 h,MTT比色法检测细胞增殖,倒置相差显微镜观察细胞形态,AnnexinⅤ-FITC和PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡;AuNP 10μmo.l L-1,BSO 20μmo.l L-1及GSH 1 mmo.l L-1单独或联合作用细胞48 h,共聚焦显微镜检测细胞骨架微丝,JC-1染色流式细胞仪检测线粒体膜电位。结果 AuNP 10～100μmo.lL-1对正常的CHO-K1细胞存活无明显影响。与正常对照组相比,AuNP 10μmol.L-1和BSO 20μmol.L-1联合作用,可明显抑制CHO-K1细胞存活,抑制率为(80±2)%(P<0.01),胞体皱缩、变圆,细胞骨架微丝破坏;凋亡率为(66±6)%(P<0.01);细胞线粒体膜电位显著增加(P<0.01);加入外源性的GSH可逆转AuNP对因细胞GSH水平受抑而产生的细胞毒性。结论 AuNP对CHO-K1细胞损伤可能与GSH水平降低有关。 展开更多

关键词 金纳米粒子 卵巢细胞 cho-K1 细胞毒性 谷胱甘肽

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王浆主蛋白作为胎牛血清替代物培养中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1的效果及作用机制 被引量：1

16

作者 钱浩诚 蒋晨旻 +1 位作者 陈华才 沈立荣 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期1-9,共9页

用王浆主蛋白(major royal jelly proteins,MRJPs)部分代替胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)培养中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO-K1),比较添加不同MRJPs/FBS(M/F)比例的培养基对细胞相对增殖率的影响。四唑盐比色法(... 用王浆主蛋白(major royal jelly proteins,MRJPs)部分代替胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)培养中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO-K1),比较添加不同MRJPs/FBS(M/F)比例的培养基对细胞相对增殖率的影响。四唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)结果显示:当M/F比例为50/50时对细胞的促增殖作用最显著;与完全培养基对照组(M/F 0/100)相比,培养48与72 h时的相对活细胞数分别上升了25.1%和13.6%。细胞成像仪分析表明,M/F 50/50培养基的细胞密度最高,其细胞直径显著大于完全培养基对照组。流式细胞仪结果显示,与完全培养基对照组相比,M/F 50/50培养基中的细胞增殖指数(proliferation index,PI)提高了19.4%,推测MRJPs的促细胞增殖作用可能与DNA、蛋白质及酶的合成有关。拉曼光谱检测结果显示,各处理组培养基的细胞光谱图之间没有显著差异,说明MRJPs在促进细胞增殖的同时维持了细胞的稳定性。以上结果证明,MRJPs可以部分替代FBS培养生物医药产业中应用广泛的CHO-K1细胞,降低细胞培养成本,具有产业化前景,并为蜂王浆深加工提供新的用途。 展开更多

关键词 王浆主蛋白 中国仓鼠卵巢细胞 胎牛血清 促增殖 细胞周期 拉曼光谱

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人血清白蛋白-白介素-2融合蛋白在CHO细胞中的表达

17

作者 卢慧惠 彭林 +3 位作者 段作营 蔡燕飞 金坚 李华钟 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期456-460,共5页

白细胞介素-2在人体免疫应答中具有重要作用,常用于治疗肿瘤、肝炎和免疫缺陷性疾病等多种疾病,但因其体内半衰期短而限制了其临床应用。文中构建了含有融合蛋白基因HSA-IL-2的p MH3质粒,并通过电转染的方法转入中国仓鼠卵巢细胞(Chines... 白细胞介素-2在人体免疫应答中具有重要作用,常用于治疗肿瘤、肝炎和免疫缺陷性疾病等多种疾病,但因其体内半衰期短而限制了其临床应用。文中构建了含有融合蛋白基因HSA-IL-2的p MH3质粒,并通过电转染的方法转入中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO细胞)中,利用p MH3质粒所携带的neo基因进行筛选,经96孔板培养并筛选得到稳定表达目的蛋白质的重组细胞,融合蛋白HSA-IL-2表达量达到2.26 mg/L。利用反转录PCR和Western blot对重组细胞鉴定后发现,融合蛋白编码基因整合入重组CHO细胞基因组中,而且融合蛋白同时具有HSA和IL-2双重免疫原性。利用对IL-2具有依赖性的CTLL-2细胞进行活性分析后发现,筛选得到的表达细胞分泌得到的融合蛋白具有较高的生物活性,表明成功构建具有表达IL-2生物活性能力的CHO细胞。 展开更多

关键词 人白介素-2 人血清白蛋白 融合蛋白 中国仓鼠卵巢细胞

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泛染色体开放元件对CHO细胞株中抗体表达量的影响

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作者 王驰 田浤 +1 位作者 高向东 姚文兵 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期96-101,共6页

泛染色体开放元件(UCOE)来自于人类看家基因启动子基因序列,能阻止基因转录沉默,使转录的目的基因不受"位置效应"的影响,从而使目的蛋白在细胞中高表达。本研究考察了不同片段大小的UCOE元件对稳转细胞株中抗体表达量的影响。... 泛染色体开放元件(UCOE)来自于人类看家基因启动子基因序列,能阻止基因转录沉默,使转录的目的基因不受"位置效应"的影响,从而使目的蛋白在细胞中高表达。本研究考察了不同片段大小的UCOE元件对稳转细胞株中抗体表达量的影响。将UCOE元件中来自于CBX3基因的1.5 kb片段和来自于HNRPA2B1基因的2.5 kb片段及完整UCOE 4.0 kb片段分别插入到含有抗体轻、重链的质粒载体中,转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,加压筛选获得4组单克隆细胞株。比较不同组的单克隆细胞株抗体表达量,结果显示,转染UCOE 1.5 kb、2.5 kb的单克隆细胞株抗体表达量是对照组的1.5~2倍,转染UCOE 4.0 kb的单克隆细胞株抗体表达量是对照组的3~4倍;两个看家基因启动子基因序列对目的基因表达的增强作用可相互叠加。 展开更多

关键词 泛染色体开放元件 中国仓鼠卵巢细胞 抗体 表达 看家基因

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CHO细胞表达系统启动子 被引量：4

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作者 王稳 王天云 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期1175-1182,共8页

中国仓鼠卵巢(Chinese hamsters ovary,CHO)细胞是目前重组蛋白质生产的首选宿主细胞。利用CHO细胞生产重组蛋白质,启动子是启动转基因转录的关键。核心启动子是RNA聚合酶与转录起始复合物集合的部位,分为集中型和分散型两种类型。目前,... 中国仓鼠卵巢(Chinese hamsters ovary,CHO)细胞是目前重组蛋白质生产的首选宿主细胞。利用CHO细胞生产重组蛋白质,启动子是启动转基因转录的关键。核心启动子是RNA聚合酶与转录起始复合物集合的部位,分为集中型和分散型两种类型。目前,CHO细胞常用的启动子为病毒启动子、异源启动子、内源性和诱导性启动子等。也可以利用合成生物学及相关的数据库,人工设计合成启动子及鉴定新型启动子。本文综述了CHO细胞常用的启动子以及人工设计的合成启动子在CHO细胞中重组蛋白质表达方面的进展,为哺乳动物细胞选择合适的启动子,保证蛋白质表达量最大化,并确保长时间表达稳定性提供参考。 展开更多

关键词 中国仓鼠卵巢细胞 重组蛋白质 启动子

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hMDHⅡ过表达抑制过氧化氢压力下的CHO细胞凋亡

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作者 靖钰 张存超 +3 位作者 付托 蒋成 张学光 寇庚 《化学与生物工程》 CAS 2014年第7期9-12,共4页

构建人苹果酸脱氢酶Ⅱ(hMDHⅡ)过表达的重组CHO细胞,并研究hMDHⅡ过表达对过氧化氢压力下CHO细胞凋亡的影响。结果显示,在0.1mmol·L-1过氧化氢压力下,hMDHⅡ过表达明显提高了补料分批培养后期细胞活率。线粒体膜电位及活性氧检测显... 构建人苹果酸脱氢酶Ⅱ(hMDHⅡ)过表达的重组CHO细胞,并研究hMDHⅡ过表达对过氧化氢压力下CHO细胞凋亡的影响。结果显示,在0.1mmol·L-1过氧化氢压力下,hMDHⅡ过表达明显提高了补料分批培养后期细胞活率。线粒体膜电位及活性氧检测显示,hMDHⅡ过表达后线粒体膜电位显著提高、活性氧显著降低,表明hMDHⅡ过表达抑制细胞凋亡可能是通过减少细胞内活性氧而实现的。 展开更多

关键词 cho细胞 人苹果酸脱氢酶Ⅱ 补料分批培养 凋亡 活性氧

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