规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)主要元件Cas9蛋白一般采用大肠杆菌表达,但在表达纯化过程中易出现形成包涵体形...规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)主要元件Cas9蛋白一般采用大肠杆菌表达,但在表达纯化过程中易出现形成包涵体形式的不溶解性蛋白,内毒素含量高、蛋白过大导致蛋白折叠不正确、产量低等问题。为实现化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9蛋白(SpCas9)在大肠杆菌中的高效可溶表达,进一步促进其应用及编辑技术的推广,本研究应用GB1促溶标签提高Cas9蛋白表达量及溶解度,同时通过使用多重启动子策略进一步提高了Cas9蛋白表达量。两种策略的组合使Cas9蛋白表达量提升了2.52倍。体外酶切分析显示融合GB1标签的Cas9蛋白功能活性不受影响。进一步组装RNP复合物转化黑曲霉宿主成功破坏了pyrG基因。展开更多
目的验证TIDE(Track of Indels by Decomposition)和TIDER(Tracking of Insertion,DEletions and Recombination events)分析绵羊囊胚基因组编辑结果的可靠性,为检测基因组编辑绵羊胚胎突变效率提供精准、及时的分析方法。方法TIDE是1...目的验证TIDE(Track of Indels by Decomposition)和TIDER(Tracking of Insertion,DEletions and Recombination events)分析绵羊囊胚基因组编辑结果的可靠性,为检测基因组编辑绵羊胚胎突变效率提供精准、及时的分析方法。方法TIDE是1种简便精准的检测方法,能精确测定CRISPR/Cas9在细胞群体中引发的靶向突变谱型和频率。利用TIDE平台对绵羊囊胚的基因组诱导突变进行表征分析与量化。结果以MSTN基因突变绵羊的基因组样本为材料,进行PCR扩增并构建T载体,随机选取单克隆测序。测序结果证实了TIDE分析基因组编辑结果的准确性。通过将TIDER分析单链寡核苷酸模板整合产生的编辑结果与DNA限制性酶切图谱对比,验证了TIDER分析外源DNA短片段导入的准确性。结论TIDE和TIDER工具可有效量化绵羊囊胚突变率,识别主要的插入和缺失类型,是高效经济的基因突变分析方法。展开更多
文摘规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)主要元件Cas9蛋白一般采用大肠杆菌表达,但在表达纯化过程中易出现形成包涵体形式的不溶解性蛋白,内毒素含量高、蛋白过大导致蛋白折叠不正确、产量低等问题。为实现化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9蛋白(SpCas9)在大肠杆菌中的高效可溶表达,进一步促进其应用及编辑技术的推广,本研究应用GB1促溶标签提高Cas9蛋白表达量及溶解度,同时通过使用多重启动子策略进一步提高了Cas9蛋白表达量。两种策略的组合使Cas9蛋白表达量提升了2.52倍。体外酶切分析显示融合GB1标签的Cas9蛋白功能活性不受影响。进一步组装RNP复合物转化黑曲霉宿主成功破坏了pyrG基因。
文摘目的验证TIDE(Track of Indels by Decomposition)和TIDER(Tracking of Insertion,DEletions and Recombination events)分析绵羊囊胚基因组编辑结果的可靠性,为检测基因组编辑绵羊胚胎突变效率提供精准、及时的分析方法。方法TIDE是1种简便精准的检测方法,能精确测定CRISPR/Cas9在细胞群体中引发的靶向突变谱型和频率。利用TIDE平台对绵羊囊胚的基因组诱导突变进行表征分析与量化。结果以MSTN基因突变绵羊的基因组样本为材料,进行PCR扩增并构建T载体,随机选取单克隆测序。测序结果证实了TIDE分析基因组编辑结果的准确性。通过将TIDER分析单链寡核苷酸模板整合产生的编辑结果与DNA限制性酶切图谱对比,验证了TIDER分析外源DNA短片段导入的准确性。结论TIDE和TIDER工具可有效量化绵羊囊胚突变率,识别主要的插入和缺失类型,是高效经济的基因突变分析方法。
