牛轮状病毒RAA-CRISPR/Cas13a快速检测方法的建立

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作者 袁炫帅 赵琳琳 龙淼 《中国兽医杂志》 北大核心 2025年第11期70-76,共7页

为建立一种快速检测牛轮状病毒(BRV)的方法,本试验结合重组酶介导等温扩增(RAA)技术和簇状规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白13a(CRISPR/Cas13a)系统,以BRV保守基因序列VP6设计Target RNA、RAA扩增引物和crRNA,并筛选最佳RAA引物和... 为建立一种快速检测牛轮状病毒(BRV)的方法,本试验结合重组酶介导等温扩增(RAA)技术和簇状规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白13a(CRISPR/Cas13a)系统,以BRV保守基因序列VP6设计Target RNA、RAA扩增引物和crRNA,并筛选最佳RAA引物和反应条件,建立BRV的RAA-CRISPR/Cas13a检测方法,同时验证该方法的特异性、敏感性和重复性,并与逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)方法进行临床样本检测对比。结果显示,RAA-CRISPR/Cas13a检测方法与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛星状病毒(BoAstV)和大肠杆菌(Escherichia coli)未发生交叉反应,特异性强;最低检测限为1.9×10^(2) copies/μL,敏感性强;组内、组间变异系数分别为3.9%和7.4%,分别小于5%和10%,重复性良好。检测108份牛粪样本,RAA-CRISPR/Cas13a与RT-qPCR检测的阳性检出率均为44%(47/108),符合率为100%。结果表明,本试验建立的BRV RAA-CRISPR/Cas13a快速检测方法灵敏度高、特异性强,可为BRV临床快速检测提供有力技术支撑。 展开更多

关键词 牛轮状病毒(BRV) 重组酶介导等温扩增(RAA) CRISPR/cas13a 实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR) 病毒检测

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猪流行性腹泻病毒RAA-CRISPR/Cas13a检测方法的建立与初步应用 被引量：6

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作者 刘华 殷冬冬 +7 位作者 邵颖 宋祥军 王振宇 潘孝成 涂健 何长生 朱良强 祁克宗 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期3991-3997,共7页

将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a)技术相结合,即RAA-Cas13a,建议建立高效、灵敏、特异的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PE... 将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a)技术相结合,即RAA-Cas13a,建议建立高效、灵敏、特异的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)检测方法。针对PEDV N基因保守区设计RAA特异性引物和CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸,并进行CRISPR-Cas13a荧光检测,以RT-qPCR为对照方法,评价该方法的灵敏度、特异性及与RT-qPCR法的一致性。结果表明,该方法最低可检测至101 copies·μL^(-1),且与猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒及猪伪狂犬病病毒等常见猪源病原核酸检测无交叉反应。采用RAA-Cas13a检测40份临床样本与RT-qPCR方法阳性符合率为100%,阴性符合率为84.6%,总符合率为95%,Kappa值为0.881。本研究建立的RAA-Cas13a方法灵敏度高、特异性强,为PEDV的临床诊断和流行病学监测提供了可靠的技术手段。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 CRISPR/cas13a 重组酶辅助扩增 N基因 检测

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与众不同的核酸酶Cas13a:编辑RNA的新CRISPR平台及其进展 被引量：2

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作者 刘贵生 MEKCNAY Supamit +3 位作者 吴俊静 乔木 彭先文 梅书棋 《湖北农业科学》 2018年第2期5-8,共4页

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,规律成簇的间隔短回文重复)平台是出色的基因组编辑工具,其中新型核酸酶Cas13a(CRISPR-associated protein 13a)既可编辑DNA,也可编辑RNA,这一新平台可实现DNA或RNA... CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,规律成簇的间隔短回文重复)平台是出色的基因组编辑工具,其中新型核酸酶Cas13a(CRISPR-associated protein 13a)既可编辑DNA,也可编辑RNA,这一新平台可实现DNA或RNA的摩尔灵敏度以及单碱基错配的特异性检测,同时拓展用于病毒与细菌的精细检测(甚至是寨卡与登革热的近亲病毒株)、癌症早期监测和遗传性疾病等治疗;其需要设计少,技术操作简单,具有广泛的应用潜力,是基因组编辑的又一项卓越成果。综述了Cas13a系统的最新进展。 展开更多

关键词 基因组编辑 CRISPR cas13a RNA 基因网络调控

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CRISPR/Cas13a在肺结核诊断中的效能研究

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作者 聂晓平 韩梅 +4 位作者 杨松 王乐乐 李同心 黄正谷 高雯琬 《中国防痨杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第S02期35-37,共3页

目的:分析评价CRISPR/Cas13a对肺结核的检测诊断价值。方法:收集重庆市公共卫生医疗救治中心2023年2月至2023年5月收治住院的45例经病原学确诊(分枝杆菌培养阳性)的肺结核患者痰液标本作为结核病组,并收集同期收治入院的23例非结核病患... 目的:分析评价CRISPR/Cas13a对肺结核的检测诊断价值。方法:收集重庆市公共卫生医疗救治中心2023年2月至2023年5月收治住院的45例经病原学确诊(分枝杆菌培养阳性)的肺结核患者痰液标本作为结核病组,并收集同期收治入院的23例非结核病患者(包括社区获得性肺炎、慢性支气管炎、单纯疱疹病毒感染、细菌性肺炎、支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病)痰液标本作为非结核病组。所有患者的标本均进行CRISPR-Cas13a检测,且至少进行一项分子检测:结核分枝杆菌复合群核酸扩增检测或Gene Xpert MTB/RIF检测。结果:以分枝杆菌培养结果作为参考,在结核病组中TB-DNA/Xpert检测方法检出阳性标本有42例,CRISPR/Cas13a检出阳性标本有43例;在非结核病组中TB-DNA/Xpert方法检出阳性1例,CRISPR/Cas13a检出均为阴性,差异均无统计学意义(P=1.0)。CRISPR/Cas13a检测肺结核的敏感度为95.6%,特异度为100%,阳性预测值为100%,阴性预测值为92.0%,Kappa值为0.94。结论:与传统的分子生物学方法相比,CRISPR/Cas13a在检测肺结核方面具有较高的敏感度和特异度,在实现对肺结核快速、高效检测具有巨大的潜力。 展开更多

关键词 肺结核 Gene Xpert MTB/RIF CRISPR/cas13a

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应用CRISPR/Cas13a快速鉴定布鲁氏菌 被引量：6

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作者 黄明耀 梁文立 +7 位作者 吴婉婷 刘足 谢淑媚 邓颖颖 傅俊方 姜长宏 龙军 江凌晓 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期426-429,共4页

目的建立一种基于CRISPR/Cas13a的布鲁氏菌鉴定方法。方法以布鲁氏菌BCSP31基因的保守区为靶标区域设计特异的引物和crRNA,建立鉴定布鲁氏菌的CRISPR/Cas13a方法。通过对纯菌株以及临床需氧血培养阳性菌液检测评价该方法的特异性和敏感... 目的建立一种基于CRISPR/Cas13a的布鲁氏菌鉴定方法。方法以布鲁氏菌BCSP31基因的保守区为靶标区域设计特异的引物和crRNA,建立鉴定布鲁氏菌的CRISPR/Cas13a方法。通过对纯菌株以及临床需氧血培养阳性菌液检测评价该方法的特异性和敏感性;通过梯度稀释法评估其检测下限。结果建立了基于CRISPR/Cas13a的布鲁氏菌快速鉴定方法,其检测下限可达10 fg/μL。通过鉴定64株布鲁氏菌、56株非布鲁氏菌、人DNA以及57例临床需氧血培养阳性菌液,计算该方法的敏感性、特异性可达100%。结论建立了一种基于CRISPR/Cas13a的布鲁氏菌鉴定方法,可用于临床需氧血培养阳性后快速鉴定布鲁氏菌。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 CRISPR/cas13a 快速诊断

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CRISPR/Cas13a重组蛋白表达纯化及其连带剪切酶活性的鉴定 被引量：4

6

作者 王勋 张雨杭 +6 位作者 孙亚宁 李青梅 李鸽 王丽 郭军庆 邓瑞广 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2021年第4期147-153,共7页

为建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,在大肠杆菌中表达LwaCas13a重组蛋白,并对其连带剪切酶活性进行鉴定。将重组质粒pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a转化至Rosetta(DE3)感受态细胞诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析结... 为建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,在大肠杆菌中表达LwaCas13a重组蛋白,并对其连带剪切酶活性进行鉴定。将重组质粒pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a转化至Rosetta(DE3)感受态细胞诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析结果显示,成功表达了可溶性LwaCas13a重组蛋白。对诱导温度和时间进行优化,结果显示,在16℃条件下诱导培养15 h时,LwaCas13a重组蛋白的可溶性表达量最高。通过镍柱亲和层析法对表达的LwaCas13a重组蛋白进行纯化,得到单一的目的条带,纯化效果较为理想。此外,通过体外转录合成了1对CRISPR RNA及靶标RNA,建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,可在37℃条件下30 min内完成检测,对靶标RNA的检出限为31.2 nmol/L。综上,成功利用大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株可溶性表达了LwaCas13a重组蛋白,且纯化后的LwaCas13a重组蛋白具有良好的连带剪切酶活性,建立了LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法。 展开更多

关键词 CRISPR/cas13a蛋白 原核表达 镍柱亲和层析 连带剪切酶活性 核酸检测

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基于CRISPR-Cas13家族的RNA编辑系统及其最新进展 被引量：6

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作者 陈敏洁 唐桂月 +3 位作者 洪香娜 郝沛 江静 李轩 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期1-8,共8页

存在于细菌和古菌中的获得性免疫系统CRISPR-Cas目前已被广泛应用到生物技术领域,尤其是靶向DNA的CRISPR-Cas9技术。然而CRISPR-Cas系统靶向RNA的技术还处于初步应用阶段。Ⅵ型CRISPR-Cas系统(CRISPR-Cas13)的发现,揭示了RNA引导的RNA... 存在于细菌和古菌中的获得性免疫系统CRISPR-Cas目前已被广泛应用到生物技术领域,尤其是靶向DNA的CRISPR-Cas9技术。然而CRISPR-Cas系统靶向RNA的技术还处于初步应用阶段。Ⅵ型CRISPR-Cas系统(CRISPR-Cas13)的发现,揭示了RNA引导的RNA靶向性。CRISPR-Cas13是目前CRISPR-Cas家族中唯一只靶向ssRNA的系统,为RNA靶向和RNA编辑奠定了基础。根据Cas13系统发育已证明将Ⅵ型CRISPR-Cas系统分为4种亚型(A-D)。主要对目前最新的靶向RNA技术的CRISPR-Cas13家族的分类以及防御机制进行了综述,介绍了CRISPR-Cas13技术的应用以及基于CRISPR-Cas13家族的RNA编辑系统的最新研究进展。最后,对目前CRISPR-Cas13 RNA编辑技术体系存在的问题进行了分析和对未来的发展进行展望。 展开更多

关键词 CRISPR-cas13 RNA编辑 RNA技术 A>I C>U

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重组酶辅助扩增结合CRISPR/Cas13a检测禽腺病毒4型方法的建立 被引量：2

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作者 殷冬冬 郭浩 +5 位作者 兰梦蝶 尹磊 王洁茹 沈学怀 戴银 潘孝成 《云南农业大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2023年第5期803-807,共5页

【目的】建立高效、灵敏、特异的禽腺病毒4型(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)检测方法。【方法】将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(clustered regularly i... 【目的】建立高效、灵敏、特异的禽腺病毒4型(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)检测方法。【方法】将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 13a,CRISPR-Cas13a)技术相结合,针对FAdV-4 Hexon基因保守区设计RAA引物及CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸,并进行CRISPR-Cas13a荧光检测,以qPCR为对照方法,评价所建立方法的灵敏度、特异性以及与qPCR法的一致性。【结果】本研究所建立的方法反应过程均在37℃恒温条件下完成,反应体系可检测的最低扩增拷贝数为101 copies/μL,灵敏度高,且与FAdV-1、FAdV-7、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-10、鸡传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感H9亚型疫苗和新城疫病毒等禽病原核酸检测无交叉反应。该方法检测30份临床样本与qPCR检测的阳性检出率一致。【结论】建立的RAA-Cas13a方法检测FAdV-4具有简便、灵敏、特异等特点,可用于FAdV-4的快速检测和流行病学监测。 展开更多

关键词 禽腺病毒4型 CRISPR/cas13a 重组酶辅助扩增 检测

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应用CRISPR/Cas13b编辑技术治疗TNNT2R141W转基因小鼠的扩张型心肌病 被引量：1

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作者 匡歆 王玉瑶 +6 位作者 聂宇 李昊 陈显达 廉虹 刘立会 李佳成 郭睿 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期49-60,共12页

应用CRISPR/Cas13b系统对TNNT2R141W转基因扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)小鼠进行探索性治疗,尝试发现治疗扩张型心肌病的一种新方式,为CRISPR/Cas13b系统在体内应用提供实验基础。随机设计11种Cas13b-TNNT2 gRNA并成功构... 应用CRISPR/Cas13b系统对TNNT2R141W转基因扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)小鼠进行探索性治疗,尝试发现治疗扩张型心肌病的一种新方式,为CRISPR/Cas13b系统在体内应用提供实验基础。随机设计11种Cas13b-TNNT2 gRNA并成功构建表达质粒,把它和人源TNNT2过表达质粒共同转染到293T细胞中,通过实时定量PCR(Q-PCR)检测人源TNNT2 mRNA的表达水平。结果显示,gRNA2引导Cas13b敲低目标基因的效率最高,达到80%(P<0.0001)。把gRNA2表达质粒包装到慢病毒载体中,转导出生后1 d的DCM小鼠原代心肌细胞。Q-PCR检测结果表明,CRISPR/Cas13b系统对人源TNNT2 mRNA敲低效率达到55%(P<0.01)。把PspCas13b和gRNA2的表达载体分别包装到AAV9病毒载体中,再将200μL约1×1012AAV9病毒颗粒通过尾静脉注射到4月龄DCM小鼠体内,待注射小鼠发育至5月龄时。Q-PCR检测结果显示,AAV9+DCM组TNNT2R141W表达水平较未注射组对照明显下降至40%(P<0.01)。对5月龄野生型(WT)、DCM(未注射病毒组)和AAV9+DCM(基因组编辑工具注射组)三组小鼠的心脏形态、心功能、心肌纤维化和心力衰竭等表型的观察结合显示:DCM小鼠的心血管形态异常,而AAV9+DCM小鼠心血管形态趋于正常。对3组小鼠的心脏进行超声心动图,并对心功能指标进行统计发现,DCM组较WT组小鼠的左心室射血分数(left ventricular percent ejection fraction,LV EF%)、左心室短轴缩短率(left ventricular percent fractional shortening,LV FS%)分别下降50.4%(P<0.0001),55.1%(P<0.0001),而AAV9+DCM组较DCM组小鼠的LV EF%、LV FS%分别上升66.5%(P<0.01),77.0%(P<0.01)。通过Q-PCR和天狼星红染色检测3组小鼠的心肌纤维化程度。结果显示,DCM组较WT组小鼠的Col3a1和Postn两种纤维化基因,分别高表达5.2倍(P<0.001)、4.5倍(P<0.01),而AAV9+DCM组较DCM组小鼠两种基因表达分别下降2.0倍(P<0.05)、1.4倍(NS)。天狼星红染色结果显示,纤维化区域明显下降;通过Q-PCR和蛋白质免疫印迹分别检测3组小鼠的心肌心力衰竭基因Nppb mRNA和Nppa蛋白质的表达水平。结果表明,DCM组较WT组小鼠Nppb mRNA表达上升14.2倍(P<0.01),而AAV9+DCM组较DCM组小鼠Nppb mRNA表达明显下降2.8倍(P<0.05),Nppa蛋白表达趋势与Nppb相同。把gRNA 5和含有R141W突变(gRNA 5T),以及正常的TNNT2 mRNA(gRNA 5V)序列分别组合转染到293T细胞中。通过Q-PCR检测两种序列mRNA的表达水平。结果显示,gRNA 5T序列表达效率为30%(P<0.0001),而并未检测到gRNA 5V mRNA的敲低。本研究通过设计靶向TNNT2R141WmRNA的gRNA,特异性敲低TNNT2R141W转基因小鼠体内突变的mRNA,有效改善了转基因小鼠的心功能,为临床进一步探索扩张型心肌病的治疗奠定了实验室基础。 展开更多

关键词 扩张型心肌病 CRISPR/cas13b RNA编辑技术 TNNT2R141W基因突变

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CRISPR/Cas13b系统对猪流行性腹泻病毒增殖的抑制作用 被引量：1

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作者 梅彦 杨化强 吴珍芳 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1-7,共7页

【目的】猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种对养猪业造成巨大损失的高致死率的传染性疫病。CRISPR/Cas13b系统精准切割和编辑RNA的功能提供了一种靶向抑制RNA病毒的策略。本研究尝试利... 【目的】猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种对养猪业造成巨大损失的高致死率的传染性疫病。CRISPR/Cas13b系统精准切割和编辑RNA的功能提供了一种靶向抑制RNA病毒的策略。本研究尝试利用CRISPR/Cas13b的RNA干扰功能对PEDV的基因组RNA进行切割,以探索一种新型的PEDV病毒抑制策略。【方法】设计了4对靶向PEDV基因组不同区域的CRISPR RNA(crRNA)位点,构建了CRISPR/Cas13b打靶载体,以打靶载体转染Vero细胞,并利用PEDV感染转染细胞,检测PEDV在CRISPR/Cas13b转染细胞内的增殖情况。【结果】CRISPR/Cas13b系统对PEDV在Vero细胞的增殖具有明显的抑制作用。打靶载体U6-crRNA3和U6-crRNA4转染组相较于正常细胞组,病毒免疫荧光试验中荧光团明显减少;定量PCR结果显示,打靶载体转染组在细胞水平抑制50%以上病毒增殖量。【结论】本研究构建的CRISPR/Cas13b系统能有效抑制PEDV增殖,为开发有效的RNA病毒防控手段、建立抗病动物模型提供了新的研究策略。 展开更多

关键词 猪 猪流行性腹泻病毒 CRISPR/cas13b系统 打靶质粒 RNA病毒 基因编辑

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基于CRISPR/Cas13a技术检测肿瘤驱动基因TP53 R248W的研究 被引量：2

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作者 邝振展 肖斌 +3 位作者 孙朝晖 罗镕 何洁雯 李林海 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期1119-1124,共6页

目的:建立一种基于CRISPR/Cas13a的TP53 R248W变异体的快速检测技术。方法:根据Over-lap PCR技术,以TP53野生型质粒为模板构建TP53 R248W变异体质粒;对TP53R248W变异体扩增产物大小,扩增反应条件及crRNA长度和浓度进行优化,初步建立基于... 目的:建立一种基于CRISPR/Cas13a的TP53 R248W变异体的快速检测技术。方法:根据Over-lap PCR技术,以TP53野生型质粒为模板构建TP53 R248W变异体质粒;对TP53R248W变异体扩增产物大小,扩增反应条件及crRNA长度和浓度进行优化,初步建立基于CRISPR/Cas13a的R248W变异体快速检测方法;利用不同突变率TP53 R248W变异体及模拟血浆ctDNA,评价CRISPR/Cas13a方法的检测灵敏度。结果:建立的CRISPR/Cas13a方法成功检测出产物大小为368 bp的TP53R248W片段;在0.05~0.25μmol/L浓度范围内,crRNA浓度越高,检测结果相对荧光值越高;该方法检测TP53 R248W变异体的灵敏度为1×10~4拷贝/μL,最低可以检测出突变率为0.01%的变异体。结论:建立的CRISPR/Cas13a方法具有快速、简便、灵敏、特异等优点,为组织和血浆中的TP53 R248W变异体的检测提供了新的技术手段。 展开更多

关键词 CRISPR/cas13a TP53 R248W crRNA 快速检测

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K亚群禽白血病病毒CRISPR/Cas13a检测方法的建立及初步应用 被引量：1

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作者 徐晴晴 王峰 +2 位作者 王文秀 莫玲 沈志强 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第3期113-119,共7页

为了快速、准确和简便地检测K亚群禽白血病病毒(ALV-K),本研究参照GenBank中ALV-K的gp85基因设计了特异的RPA引物和用于LwCas13a反应系统的crRNA,通过优化反应条件建立了检测ALV-K的CRISPR/Cas13a方法,并验证了该方法的特异性、敏感性... 为了快速、准确和简便地检测K亚群禽白血病病毒(ALV-K),本研究参照GenBank中ALV-K的gp85基因设计了特异的RPA引物和用于LwCas13a反应系统的crRNA,通过优化反应条件建立了检测ALV-K的CRISPR/Cas13a方法,并验证了该方法的特异性、敏感性和符合性。结果显示,该法对感染鸡的其他常见病毒的检测均为阴性,特异性良好无交叉反应;灵敏度为50 copies/μL;与PCR的检测结果有很好的符合性。本研究建立的CRISPR/Cas13a检测方法配合试纸条显色在1.5 h左右可对ALV-K进行快速的鉴别诊断,为该病的诊断及防控净化提供了强有力的技术支撑。 展开更多

关键词 K亚群禽白血病病毒 RPA crRNA CRISPR/cas13a

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CRISPR/Cas13d介导猪胎儿成纤维细胞SUV39H1/SUV39H2基因敲降 被引量：1

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作者 毕登峰 王煜 +1 位作者 姚婧 赵建国 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第6期1957-1966,共10页

研究旨在利用CRISPR/Cas13d系统对猪胎儿成纤维细胞(PEF)中的胚胎发育相关基因SUV39H1/SUV39H2进行RNA水平的敲降,从而在猪上建立CRISPR/Cas13d介导的基因敲降系统。根据SUV39H1、SUV39H2基因的编码序列各设计3个靶向编码链的sgRNAs,并... 研究旨在利用CRISPR/Cas13d系统对猪胎儿成纤维细胞(PEF)中的胚胎发育相关基因SUV39H1/SUV39H2进行RNA水平的敲降,从而在猪上建立CRISPR/Cas13d介导的基因敲降系统。根据SUV39H1、SUV39H2基因的编码序列各设计3个靶向编码链的sgRNAs,并以单链寡核苷酸的形式合成,退火后与BspQⅠ线性化的sgRNA表达载体进行连接,构建SUV39H1-sgRNA和SUV39H2-sgRNA表达载体,用Sanger软件进行测序;将Cas13d表达载体和靶向SUV39H1/SUV39H2基因的sgRNA载体按照1∶1、1∶2、1∶4、2∶1和4∶1比例转染猪胎儿成纤维细胞,48 h后收集细胞,用流式细胞术分选检测细胞转染效率,用半定量PCR和实时荧光定量PCR检测敲降效率;用半定量PCR和免疫荧光检测敲降SUV39H1/SUV39H2基因后,靶基因转录水平及组蛋白H3K9me3水平的变化。测序结果表明,针对2个基因设计的各3条sgRNAs均成功连入载体中;流式细胞术分选结果显示,转染效率约70%;半定量PCR结果表明,与对照组相比,3个sgRNAs均极显著降低了SUV39H1和SUV39H2基因的表达(P<0.01),其中SUV39H1-sgRNA-2和SUV39H2-sgRNA-1均可使SUV39H1和SUV39H2的表达降低50%;Cas13d∶sgRNA为1∶1、1∶2和1∶4组细胞的存活率高于2∶1和4∶1组;实时荧光定量PCR结果表明,Cas13d∶sgRNA为1∶2、1∶4、2∶1和4∶1组敲降效率均显著高于1∶1组(P<0.05),且Cas13d∶sgRNA为1∶2组敲降效率最高(70%)。半定量PCR结果显示,转染SUV39H1-sgRNA-2和SUV39H2-sgRNA-1极显著降低SUV39H1和SUV39H2的表达,表达量为对照组的25%~30%(P<0.01)。免疫荧光检测结果表明,敲降SUV39H1和SUV39H2基因后,组蛋白H3K9me3水平显著降低(P<0.05)。因此,本研究利用CRISPR/Cas13d系统在猪胎儿成纤维细胞中成功敲降SUV39H1和SUV39H2,并下调其催化的H3K9me3水平。 展开更多

关键词 CRISPR/cas13d SUV39H1/SUV39H2基因 敲降 猪胎儿成纤维细胞

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基于CRISPR/Cas13的RNA编辑系统及其在核酸检测中的应用 被引量：4

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作者 张爱霞 朱庆锋 +4 位作者 陈沛 于洋 魏文康 晏石娟 刘文华 《广东农业科学》 CAS 2020年第11期243-251,共9页

核酸检测技术在农业、医药、环境等多个领域均有广泛应用,传统的核酸检测技术存在设备昂贵、操作复杂和灵敏度低等诸多局限性。成簇规律间隔短回文重复序列及其相关基因13(CRISPR/Cas13)是一种只靶向RNA的新型CRISPR系统,能在CRISPR RNA... 核酸检测技术在农业、医药、环境等多个领域均有广泛应用,传统的核酸检测技术存在设备昂贵、操作复杂和灵敏度低等诸多局限性。成簇规律间隔短回文重复序列及其相关基因13(CRISPR/Cas13)是一种只靶向RNA的新型CRISPR系统,能在CRISPR RNA(crRNA)引导下特异切割单链靶RNA,并有非特异性的“附带切割”能力。基于CRISPR/Cas13的核酸检测技术具有灵敏度高、特异性强、操作方便、成本低廉等优点,具有广阔的应用前景。阐述了CRISPR/Cas13系统的类别归属及其亚型,组分特征及其分子作用机制,介绍了基于CRISPR/Cas13系统的特异性高灵敏度酶报告解锁(SHERLOCK)技术的产生和发展,综述了CRISPR/Cas13系统在病原体检测、耐药突变检测、物种识别和转基因鉴定方面的应用,同时指出了目前基于CRISPR/Cas13核酸检测技术存在的问题,并对未来应用进行了展望。 展开更多

关键词 CRISPR/cas13 crRNA 核酸检测 SHERLOCK技术 分子机制

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基于RAA-Cas13a的猪瘟病毒检测方法的建立 被引量：2

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作者 薛俊欣 韩伟 +7 位作者 朱忠武 熊炜 黄忠荣 李春阳 赵新宇 孔祥翔 李健 蒋原 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第6期78-84,共7页

灵敏、准确、多样的检测方法对有效防控猪瘟疫情极其重要,为了丰富现有的猪瘟病毒(CSFV)检测技术,本研究拟建立基于RAA-Cas13a的检测方法。基于全序列比对的基础上分别设计1对引物和两条cr RNA,对不同浓度的阳性质粒、阳性样品和7种其... 灵敏、准确、多样的检测方法对有效防控猪瘟疫情极其重要,为了丰富现有的猪瘟病毒(CSFV)检测技术,本研究拟建立基于RAA-Cas13a的检测方法。基于全序列比对的基础上分别设计1对引物和两条cr RNA,对不同浓度的阳性质粒、阳性样品和7种其他猪病病毒样品进行RAA扩增,扩增产物以Cas13a酶切体系进行荧光检测;结果显示,Cas13a酶切体系可以放大普通RAA的检测信号,RAA-Cas13a可以将检测的灵敏度提高至102copies/μL,不能检出其他7种猪病病毒,检测变异系数小于5%,临床样本检测结果与荧光RT-PCR一致性高。结果表明,本研究建立CSFV的RAA-Cas13a灵敏度较高、特异性和重复性好,具有推广应用的潜力。 展开更多

关键词 猪瘟病毒 检测 RAA cas13a

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CRISPR/Cas系统在寄生虫病诊断领域的研究进展

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作者 刘浩 张昊 +2 位作者 张艳敏 张丽丽 王文龙 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第6期2809-2817,共9页

多年来动物寄生虫病主要依靠传统镜检与PCR技术结合的方式进行诊断,在临床中确实起到了明显的防治效果,也控制了一些寄生虫病的流行。但寄生虫病多是慢性消耗性疾病,早期诊断尤为重要,而传统方法的灵敏度、简便性不能满足彻底控制寄生... 多年来动物寄生虫病主要依靠传统镜检与PCR技术结合的方式进行诊断,在临床中确实起到了明显的防治效果,也控制了一些寄生虫病的流行。但寄生虫病多是慢性消耗性疾病,早期诊断尤为重要,而传统方法的灵敏度、简便性不能满足彻底控制寄生虫病的需求。因此,亟需灵敏度更高、便捷性更强的检测方法。近年来,CRISPR/Cas系统不断发展,已发现了多种Cas蛋白的功能,并广泛应用于寄生虫病原的核酸检测。研究人员针对第2类CRISPR/Cas系统中的Cas13与Cas12蛋白与重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)或PCR联用,筛选特异性靶标序列并设计crRNA,之后与Cas12、Cas13蛋白和荧光报告基团组成CRISPR/Cas核酸检测系统,可用于多种寄生虫病的诊断,具有快速、精准、便捷和廉价等特点,适用于现场检测,具有巨大的市场应用潜力。笔者就CRISPR/Cas系统的作用机制和分类,以及近年来其在寄生虫病核酸检测领域的研究进展进行综述,以期为寄生虫病的早期诊断提供参考依据。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas系统 cas13 Cas12 crRNA 核酸检测

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CRISPR/Cas系统在植物抗病毒中的应用 被引量：2

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作者 闫洪波 高艳丽 +2 位作者 孙世卫 窦炎丹 吴志明 《草业科学》 CAS CSCD 2019年第5期1405-1414,共10页

近年来,CRISPR/Cas系统因其简易性和有效性不仅在植物基因组编辑中得到广泛应用,而且开始应用于植物抗病毒研究。本文介绍了CRISPR/Cas系统的研究进展,详述了CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas13a在抗植物病毒中的应用,以及靶向病毒基因组和靶向... 近年来,CRISPR/Cas系统因其简易性和有效性不仅在植物基因组编辑中得到广泛应用,而且开始应用于植物抗病毒研究。本文介绍了CRISPR/Cas系统的研究进展,详述了CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas13a在抗植物病毒中的应用,以及靶向病毒基因组和靶向宿主植物基因组两种抗病毒基本策略;同时讨论了CRISPR/Cas12a和相关原核Ago系统在抗植物病毒上的潜在应用前景,并指出CRISPR/Cas在应用中存在的挑战。由于CRISPR/Cas系统在抗植物病毒研究中的优势,可能给植物抗病毒育种带来革命性变化。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9 CRISPR/cas13a 植物病毒 病毒基因组 宿主植物基因组 抗病毒策略 Ago系统

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CRISPR-Cas系统在病原核酸检测中的研究进展 被引量：4

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作者 杜瑶 高宏丹 +4 位作者 刘家坤 刘孝荣 邢志浩 张涛 马东礼 《合成生物学》 CSCD 北大核心 2024年第1期202-216,共15页

CRISPR-Cas系统作为原核生物获得性免疫系统,由簇状规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)构成,因其识别和切割特定DNA或RNA序... CRISPR-Cas系统作为原核生物获得性免疫系统,由簇状规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)构成,因其识别和切割特定DNA或RNA序列,而成为分子诊断领域研究的热点。研究人员利用Cas蛋白(Cas12、Cas13、Cas14、Cas3等)结合信号放大和转化技术(荧光法、电位法、比色法、侧向流动技术等),开发了许多高灵敏度、高特异性、低成本的诊断平台,为病原核酸检测提供了新途径。本文介绍了CRISPR-Cas系统的生物学机制及分类,总结现有的基于Cas蛋白反式切割活性开发的病原核酸检测技术,描述其特点、功能和应用场景,并对该系统的未来应用前景进行展望,期望CRISPR-Cas系统成为包括核酸检测在内的多靶标的理想检测平台。 展开更多

关键词 CRISPR-Cas系统 Cas12和cas13 病原体 核酸检测 生物传感

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等温扩增联合CRISPR系统检测人副流感病毒方法的建立 被引量：1

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作者 张政涛 郑达锋 +2 位作者 刘子榕 游丽斌 翁育伟 《中国人兽共患病学报》 CSCD 北大核心 2024年第12期1122-1127,共6页

目的应用反转录重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aid amplification,RT-RAA)联合CRISPR体系,建立人副流感病毒(human parainfluenza virus,HPIV)核酸检测方法。方法根据HPIV-1核衣壳蛋白(nucleocapsid,N)基因保... 目的应用反转录重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aid amplification,RT-RAA)联合CRISPR体系,建立人副流感病毒(human parainfluenza virus,HPIV)核酸检测方法。方法根据HPIV-1核衣壳蛋白(nucleocapsid,N)基因保守区序列,设计RT-RAA所需型特异性引物及crRNA(CRISPR RNA),应用Cas13a切割荧光标记探针产生的荧光强度优化crRNA和Cas13a浓度。利用体外转录RNA及临床样本,评价RT-RAA联合CRISPR/Cas13a检测方法的检测下限、敏感性和特异性。结果RT-RAA联合CRISPR/Cas13a方法对HPIV-1的检测下限可达到1拷贝/反应,该方法检测HPIV-2~4及8种其他呼吸道病毒感染的临床样本,均未显示有交叉反应;该检测方法的灵敏度(100%)和特异度(97.8%)高,与商业化试剂盒比较,具有较高的检测一致率(Kappa=0.88)。结论联合应用RT-RAA和CRISPR/Cas13a技术,成功建立HPIV-1核酸检测方法,该方法具有快速、灵敏和特异的特点,且无需专业核酸检测设备。 展开更多

关键词 人副流感病毒 RT-RAA CRISPR Cas12a cas13a

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CRISPR系统用于昆虫基因表达调控的研究进展与展望 被引量：1

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作者 刘素宁 李胜 任充华 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第12期1481-1487,共7页

昆虫基因功能研究因缺少相应的工具而受到明显限制,但CRISPR/Cas9系统的出现为昆虫基因编辑及转录调控研究提供巨大助力。将Cas9核酸酶的RuvC和HNH剪切结构域失活改造得到的dCas9系统近年来在基因转录调控方面得到了广泛应用,同时CRISPR... 昆虫基因功能研究因缺少相应的工具而受到明显限制,但CRISPR/Cas9系统的出现为昆虫基因编辑及转录调控研究提供巨大助力。将Cas9核酸酶的RuvC和HNH剪切结构域失活改造得到的dCas9系统近年来在基因转录调控方面得到了广泛应用,同时CRISPR/dCpf1和最新发现的CRISPR/Cas13(a/b)系统为基因功能研究提供更多选择。本文综述了dCas9, dCpf1及Cas13(a/b)系统作用机理及在果蝇中的转录调控研究进展,以期为相关昆虫研究提供参考。 展开更多

关键词 CRISPR 导向RNA dCas9 dCpf1 cas13(a/b) 转录调控

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