旨在构建ALV-J受体分子chNHE1精准基因编辑细胞系,本研究利用荧光标记的CRISPR/Cas9系统,在DF-1细胞中将chNHE1介导ALV-J进入宿主细胞的关键氨基酸V33进行突变,W38进行缺失,同时将编码第34-37位氨基酸的密码子同义替换。通过流式细胞分...旨在构建ALV-J受体分子chNHE1精准基因编辑细胞系,本研究利用荧光标记的CRISPR/Cas9系统,在DF-1细胞中将chNHE1介导ALV-J进入宿主细胞的关键氨基酸V33进行突变,W38进行缺失,同时将编码第34-37位氨基酸的密码子同义替换。通过流式细胞分选获得48株单克隆细胞系,PCR及测序分析结果显示,其中有14株单克隆细胞系的chNHE1成功发生V33突变、W38缺失以及34-37位氨基酸的密码子同义替换,基因编辑效率为29%。为了验证chNHE1基因编辑DF-1细胞系的遗传稳定性及增殖水平,对传至第25代的细胞系进行测序分析,结果显示,chNHE1基因未发生回复性突变;进一步细胞计数分析结果显示,chNHE1基因编辑细胞系增殖水平未受到影响;为了评价chNHE1基因编辑细胞系抗ALV-J感染的能力,分别利用ALV-J荧光报告病毒(ALV-J-GFP)及ALV-J原型毒株(HPRS-103)对其进行病毒感染试验,荧光观察结果及流式细胞分析结果显示,chNHE1基因编辑细胞系可完全抵抗0.1 MOI ALV-J-GFP的感染;进一步间接免疫荧光试验、PCR扩增试验以及病毒滴度测定试验结果显示,chNHE1基因编辑细胞系可完全抵抗0.1 MOI HPRS-103毒株及0.1 MOI JL08CH3-1毒株的感染。本研究利用荧光标记的CRISPR/Cas9系统结合流式细胞分选,成功构建了chNHE1基因编辑细胞系,其可完全抵抗ALV-J的感染,且该细胞系遗传稳定性及增殖活性良好,为建立抗ALV-J感染的新技术提供了理论支持及基因编辑靶点。展开更多
目的构建SF3B1突变等位基因敲除的人葡萄膜黑色素瘤细胞模型,筛选靶向抑制SF3B1突变型葡萄膜黑色素瘤的药物。方法通过主成分分析法对来自TCGA数据库的葡萄膜黑色素瘤患者分成SF3B1野生型和突变型两组进行转录组可变剪接分析,研究SF3B1...目的构建SF3B1突变等位基因敲除的人葡萄膜黑色素瘤细胞模型,筛选靶向抑制SF3B1突变型葡萄膜黑色素瘤的药物。方法通过主成分分析法对来自TCGA数据库的葡萄膜黑色素瘤患者分成SF3B1野生型和突变型两组进行转录组可变剪接分析,研究SF3B1突变对可变剪接的影响。通过CRISPR-Cas9技术敲除Mel202细胞株的SF3B1突变等位基因,Sanger测序明确基因编辑的序列。MTT法和克隆形成实验检测Mel202细胞株和基因敲除mut-KO细胞株的增殖,RT-PCR琼脂糖电泳结合Sanger测序检测Mel202细胞株和基因敲除mut-KO细胞株的可变剪接事件。MTT法从上市药物库和生物活性化合物库筛选对SF3B1突变细胞具有选择性抑制活性的药物。结果选择性敲除Mel202细胞SF3B1突变等位基因促进了细胞的增殖(5.47±0.32 vs 10.17±0.27),改变了ZDHHC16和DYNLL1转录本的可变剪接。化合物库筛选结果显示13个化合物对SF3B1突变的Mel202细胞具有选择性的抑制活性(Fold change≥2),其中上市药物tetrandrine和lapatinib显示了较好的量效曲线。结论本研究为SF3B1突变的葡萄膜黑色素瘤患者提供了细胞筛选模型和潜在的个体化治疗药物。展开更多
文摘旨在构建ALV-J受体分子chNHE1精准基因编辑细胞系,本研究利用荧光标记的CRISPR/Cas9系统,在DF-1细胞中将chNHE1介导ALV-J进入宿主细胞的关键氨基酸V33进行突变,W38进行缺失,同时将编码第34-37位氨基酸的密码子同义替换。通过流式细胞分选获得48株单克隆细胞系,PCR及测序分析结果显示,其中有14株单克隆细胞系的chNHE1成功发生V33突变、W38缺失以及34-37位氨基酸的密码子同义替换,基因编辑效率为29%。为了验证chNHE1基因编辑DF-1细胞系的遗传稳定性及增殖水平,对传至第25代的细胞系进行测序分析,结果显示,chNHE1基因未发生回复性突变;进一步细胞计数分析结果显示,chNHE1基因编辑细胞系增殖水平未受到影响;为了评价chNHE1基因编辑细胞系抗ALV-J感染的能力,分别利用ALV-J荧光报告病毒(ALV-J-GFP)及ALV-J原型毒株(HPRS-103)对其进行病毒感染试验,荧光观察结果及流式细胞分析结果显示,chNHE1基因编辑细胞系可完全抵抗0.1 MOI ALV-J-GFP的感染;进一步间接免疫荧光试验、PCR扩增试验以及病毒滴度测定试验结果显示,chNHE1基因编辑细胞系可完全抵抗0.1 MOI HPRS-103毒株及0.1 MOI JL08CH3-1毒株的感染。本研究利用荧光标记的CRISPR/Cas9系统结合流式细胞分选,成功构建了chNHE1基因编辑细胞系,其可完全抵抗ALV-J的感染,且该细胞系遗传稳定性及增殖活性良好,为建立抗ALV-J感染的新技术提供了理论支持及基因编辑靶点。
文摘目的构建SF3B1突变等位基因敲除的人葡萄膜黑色素瘤细胞模型,筛选靶向抑制SF3B1突变型葡萄膜黑色素瘤的药物。方法通过主成分分析法对来自TCGA数据库的葡萄膜黑色素瘤患者分成SF3B1野生型和突变型两组进行转录组可变剪接分析,研究SF3B1突变对可变剪接的影响。通过CRISPR-Cas9技术敲除Mel202细胞株的SF3B1突变等位基因,Sanger测序明确基因编辑的序列。MTT法和克隆形成实验检测Mel202细胞株和基因敲除mut-KO细胞株的增殖,RT-PCR琼脂糖电泳结合Sanger测序检测Mel202细胞株和基因敲除mut-KO细胞株的可变剪接事件。MTT法从上市药物库和生物活性化合物库筛选对SF3B1突变细胞具有选择性抑制活性的药物。结果选择性敲除Mel202细胞SF3B1突变等位基因促进了细胞的增殖(5.47±0.32 vs 10.17±0.27),改变了ZDHHC16和DYNLL1转录本的可变剪接。化合物库筛选结果显示13个化合物对SF3B1突变的Mel202细胞具有选择性的抑制活性(Fold change≥2),其中上市药物tetrandrine和lapatinib显示了较好的量效曲线。结论本研究为SF3B1突变的葡萄膜黑色素瘤患者提供了细胞筛选模型和潜在的个体化治疗药物。
