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基于CRISPR-Cas9的筛选文库的类型与应用 被引量：2
1
作者 杜欣娜 戚家峰 张虎 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期931-938,共8页
文库筛选技术广泛应用于生命科学研究各领域,加速了生物医药基础科研和临床实践的进展。本文对基于CRISPR-Cas9的文库类型和应用进行综述。CRISPR-Cas9文库包括敲除、活化和抑制文库。敲除文库通过Cas9/sgRNA靶向切割DNA序列,产生移码... 文库筛选技术广泛应用于生命科学研究各领域,加速了生物医药基础科研和临床实践的进展。本文对基于CRISPR-Cas9的文库类型和应用进行综述。CRISPR-Cas9文库包括敲除、活化和抑制文库。敲除文库通过Cas9/sgRNA靶向切割DNA序列,产生移码突变进行基因敲除。活化文库包括两种:一种是dCas9/sgRNA与转录活化蛋白质融合,例如dCas9-SAM,dCas9-SunTag和dCas9-VPR系统;另一种是dCas9与表观遗传修饰酶融合,例如d Cas9-Tet1和d Cas9-p300系统。CRISPR-Cas9抑制文库通过dCas9与表观遗传修饰蛋白质融合,抑制转录,例如d Cas9-KRAB和d Cas9-Dnmt3a系统。目前,CRISPR-Cas9文库广泛用于功能基因筛选、药物靶点和耐药靶点筛选、病毒靶点筛选和揭示信号通路,并在基因互作筛选及揭示顺式调节元件功能等方面初步展现其优势。CRISPR-Cas9文库优势在于其设计灵活、操作便捷、筛选高效。伴随基因编辑系统的研发,新的筛选文库靶向性和突变将更加精准,应用将更加拓展和深化。基于CRISPR-Cas9筛选文库不仅可以筛选病理和生理过程中的关键基因和非编码DNA,还可以揭示其发挥功能的分子机制,是剖析生命复杂调控网络的手术刀。 展开更多
关键词 crispr-cas9文库 功能基因筛选 基因互作 顺式调节元件
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基于CRISPR-Cas9技术的鸡成纤维细胞系全基因组敲除文库的建立与初步应用 被引量：3
2
作者 徐娟 刘忠媛 +7 位作者 刘彦峰 廖瑛 仇旭升 宋翠萍 谭磊 刘玮炜 孙英杰 丁铲 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2022年第5期50-59,共10页
CRISPR-Cas9已被广泛证实是高效强大的第三代基因编辑工具。高通量且系统无偏的靶向全基因组水平编辑技术的应用对充分理解基因功能具有重要的意义。基于CRISPR-Cas9技术的大规模筛选方法已在哺乳动物研究领域取得重要进展,尽管鸡全基... CRISPR-Cas9已被广泛证实是高效强大的第三代基因编辑工具。高通量且系统无偏的靶向全基因组水平编辑技术的应用对充分理解基因功能具有重要的意义。基于CRISPR-Cas9技术的大规模筛选方法已在哺乳动物研究领域取得重要进展,尽管鸡全基因组测序的工作已完成,但至今尚未有关于禽类CRISPR-Cas9文库的研究,严重限制了对其基因功能的解析。本研究利用CRISPR-Cas9技术构建鸡成纤维细胞系(DF-1)细胞全基因组敲除文库,并利用新城疫病毒(NDV)感染DF-1文库细胞,经过高通量测序筛选到sgRNA富集程度排名前10的影响NDV复制的关键宿主因子。该研究首次构建了鸡CRISPR-Cas9文库筛选模型,为进一步研究家禽免疫学、病毒学等提供强大高效的工具。 展开更多
关键词 crispr-cas9文库筛选 DF-1细胞 新城疫病毒 c-C基序趋化因子类26
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CRISPR-Cas9技术在肿瘤耐药基因筛选中的研究进展 被引量：1
3
作者 张洁 杨谭 卢永刚 《海南医学院学报》 CAS 2021年第11期872-875,共4页
耐药是使用肿瘤分子靶向药物治疗肿瘤面临的主要问题,目前筛选耐药基因常用策略主要为功能性基因筛选。近年来,CRISPR-Cas9基因编辑技术因具有精准、简便、高效的特点,在肿瘤相关基因的功能学研究中被广泛应用。本文就CRISPR-Cas9文库... 耐药是使用肿瘤分子靶向药物治疗肿瘤面临的主要问题,目前筛选耐药基因常用策略主要为功能性基因筛选。近年来,CRISPR-Cas9基因编辑技术因具有精准、简便、高效的特点,在肿瘤相关基因的功能学研究中被广泛应用。本文就CRISPR-Cas9文库筛选技术的原理和在功能性基因筛选方面的应用进行了综述,同时对该技术的应用前景进行了展望。 展开更多
关键词 crispr-cas9技术 功能基因 筛选
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利用CRISPR/Cas9 sgRNA文库筛选调控结直肠癌对奥沙利铂敏感性的表观遗传相关基因
4
作者 付亚坤 贾林创 穆标 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第12期1698-1708,共11页
结直肠癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,以奥沙利铂(oxaliplatin,OXA)为基础的联合化疗方案是临床上治疗中晚期病人最常用的策略,但耐药性的产生极大限制了化疗的效果,是导致化疗失败的主要原因。因耐药发生机制未明,亟需一种高通量... 结直肠癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,以奥沙利铂(oxaliplatin,OXA)为基础的联合化疗方案是临床上治疗中晚期病人最常用的策略,但耐药性的产生极大限制了化疗的效果,是导致化疗失败的主要原因。因耐药发生机制未明,亟需一种高通量、高特异性的测序方法探索奥沙利铂耐药性产生的原因。CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9)文库筛选是近年快速发展起来高通量筛选肿瘤耐药基因的新技术,但尚未在结直肠癌对奥沙利铂耐药性产生的基因筛选中应用。我们构建了含有5256个小向导RNA(small-guide RNA,sgRNA)的针对910个人类表观遗传相关基因的sgRNA文库,利用慢病毒包装,并通过蛋白质免疫印迹检测,以及流式细胞术检测确定病毒感染的条件,将慢病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI)维持在30%以下,使其保证每1个细胞感染1条sgRNA并敲除1个基因;使用慢病毒携带文库感染结直肠癌细胞HCT116和SW620,通过阳性筛选策略获得单克隆并进行扩增,通过测序筛选得到21个调控结直肠癌细胞对奥沙利铂敏感的基因,通过分别敲除候选基因发现,敲除TDRKH、ALKBH3、UNKL、TTF2、TNKS、AURKA、RBM12、ELAVL2、LSM5、NOL8、PRPF 3基因可以显著提高奥沙利铂对结直肠癌细胞的半数致死量(IC_(50))(P<0.05),其中ALKBH3、AURKA和RBM 12等3个基因的高表达与临床的预后具有显著的相关性(总生存期:P=0.043,P<0.0001,P=0.045;无复发生存期:P=0.004,P=0.0019,P=0.0064)。研究证明,CRISPR/Cas9文库是筛选肿瘤敏感性基因的高通量方法,可为进一步探究结直肠癌对奥沙利铂敏感性的机制提供靶点参考。 展开更多
关键词 结直肠癌 奥沙利铂 肿瘤耐药性 CRISPR/Cas9文库筛选
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CRISPR/Cas9文库筛选技术的发展及在肿瘤研究中的应用 被引量：7
5
作者 雷婷 肖斌 +3 位作者 何咏茵 曲璟 孙朝晖 李林海 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期1381-1386,共6页
近年兴起的CRISPR/Cas9[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9]技术因其能快速、简便、精准地实现基因敲除、敲入、激活、干扰等编辑功能而成为一种强大的遗传筛选工具,目前已... 近年兴起的CRISPR/Cas9[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9]技术因其能快速、简便、精准地实现基因敲除、敲入、激活、干扰等编辑功能而成为一种强大的遗传筛选工具,目前已在各类细胞系和小鼠及斑马鱼等多种动物模型中得到大规模运用。利用CRISPR系统构建基因组文库进行高通量筛选,是研究疾病特别是肿瘤靶标基因的主要策略。本文就CRISPR/Cas9文库筛选技术的原理和发展,脱靶效应的改进方案,文库筛选的基本流程以及近年来该技术在肿瘤研究中的应用进行总结。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 高通量筛选 文库 肿瘤
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利用NCI-H1975细胞筛选对奥西替尼耐药的铁氧还蛋白1基因及其功能鉴定 被引量：1
6
作者 陈晨 彭培佩 +4 位作者 王健 黄芳 王芃 李山虎 王建刚 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS 北大核心 2019年第4期265-272,共8页
目的利用非小细胞肺癌细胞研究对奥西替尼潜在耐药基因及其分子机制。方法首先利用CRISPR-Cas9全基因组文库在人非小细胞肺癌细胞NCI-H1975中筛选奥西替尼潜在耐药基因,并且分别敲除潜在耐药基因铁氧还蛋白1(FDX1)和一个对照基因腺相关... 目的利用非小细胞肺癌细胞研究对奥西替尼潜在耐药基因及其分子机制。方法首先利用CRISPR-Cas9全基因组文库在人非小细胞肺癌细胞NCI-H1975中筛选奥西替尼潜在耐药基因,并且分别敲除潜在耐药基因铁氧还蛋白1(FDX1)和一个对照基因腺相关病毒整合位点1(AAVS1),建立敲除了FDX1和AAVS1稳定细胞,简称sg-FDX1细胞和sg-AAVS1细胞。提取sg-FDX1细胞基因组并且PCR扩增出sgRNA序列两侧的DNA序列,连接到T载体后进行测序;Western印迹法检测sg-FDX1和sg-AAVS1细胞中FDX1蛋白表达水平;将构建的sg-FDX1和sg-AAVS1细胞分别与奥西替尼0,30,50和100 nmol·L-1培养30 h,Western印迹法检测细胞中切割后的聚(ADP-核糖)聚合酶(c-PARP)蛋白表达水平,表皮生长因子受体(EGFR)和细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化水平。采用平板克隆实验,当克隆生长到约为10个细胞时加入奥西替尼12 nmol·L-1作用10 d,显微镜下计数≥10个细胞的克隆数;细胞用奥西替尼0~30 nmol·L-1作用72 h,或30 nmol·L-1作用3,5和7 d后,CCK8法检测肿瘤细胞的存活率。结果测序结果表明,sg-FDX1细胞中的FDX1基因发生缺失,同时FDX1在蛋白表达水平被有效敲除;和sg-AAVS1细胞相比,奥西替尼50 nmol·L-1处理的sg-FDX1细胞中c-PARP表达水平显著降低(P<0.01);奥西替尼在sg-FDX1细胞中对EGFR和ERK蛋白磷酸化表达抑制作用相对于sg-AAVS1细胞显著降低(P<0.01)。克隆形成和CCK8实验表明,相对于sg-AAVS1细胞,奥西替尼对sg-FDX1细胞的克隆形成率和增殖抑制作用显著降低(P<0.05)。结论 NCI-H1975细胞敲除FDX1,减弱了奥西替尼诱导细胞凋亡功能,可能是FDX1参与NCI-H1975细胞对奥西替尼耐药机制之一。 展开更多
关键词 crispr-cas9文库 奥西替尼 非小细胞肺癌 铁氧还蛋白1 耐药基因
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利用可诱导表达Cas9的HeLa细胞系进行顺铂耐药性基因筛选
7
作者 陈红全 王建瑛 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2021年第10期1432-1439,1452,共9页
目的:利用PiggyBac转座子系统,构建可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系,并针对人核受体基因构建sg RNA文库,进行顺铂耐药性基因筛选。方法:构建PB-TRE-Cas9-NLS-IRES-hrGFP-Zeo载体,与PB-CAG-rtTA以及转座酶载体一同电转到HeLa细胞中,通过... 目的:利用PiggyBac转座子系统,构建可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系,并针对人核受体基因构建sg RNA文库,进行顺铂耐药性基因筛选。方法:构建PB-TRE-Cas9-NLS-IRES-hrGFP-Zeo载体,与PB-CAG-rtTA以及转座酶载体一同电转到HeLa细胞中,通过药筛和挑选单克隆得到稳定细胞系;构建核受体基因sgRNA病毒文库,并感染可诱导表达Cas9的HeLa细胞系,筛选对顺铂具有抵抗性的克隆,并进行目的基因的测序鉴定。结果:挑选出可诱导表达Cas9的8E单克隆细胞株,在5个基因位点上可以进行高效编辑;感染sgRNA文库之后,挑选顺铂耐药的克隆,并鉴定出大部分克隆含有VDR sg RNA,经测序发现这些克隆中的VDR基因发生突变。结论:利用PiggyBac转座子系统,构建了可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系,利用这个细胞系可以在多位点进行高效基因编辑,并可用于高通量文库筛选顺铂耐药性基因。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 PIGGYBAC转座子 可诱导表达 文库筛选
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靶向抑制CDK12/13在高级别胶质瘤中的体外治疗效果和作用分子机制探究 被引量：1
8
作者 梅艳青 韩雨洁 +2 位作者 翁文筠 张蕾 唐玉杰 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期545-559,共15页
目的·筛选高级别胶质瘤(high-grade gliomas,HGGs)共有的表观转录靶向治疗新策略,并进行体外治疗效果的测试与相关分子机制的探究。方法·对HGGs中恶性程度和致死率均较高的多个胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)和弥漫性内生性... 目的·筛选高级别胶质瘤(high-grade gliomas,HGGs)共有的表观转录靶向治疗新策略,并进行体外治疗效果的测试与相关分子机制的探究。方法·对HGGs中恶性程度和致死率均较高的多个胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)和弥漫性内生性脑桥胶质瘤(diffuse intrinsic pontine glioma,DIPG)细胞系进行表观转录相关的靶向小分子药物库筛选和基于CRISPR-Cas9系统的功能基因组筛选,以寻找在GBM和DIPG中共同的表观转录靶向治疗新策略。然后针对筛选得到的目标表观转录调控因子,分别测试经CRISPR-Cas9方法敲除该基因以及对应的靶向小分子处理对GBM和DIPG细胞系的体外生长、细胞增殖与凋亡的影响。继而对靶向小分子处理的GBM和DIPG细胞系进行RNA-seq转录组分析,解析其抗肿瘤分子机制。基于此分析结果,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)、蛋白质印迹法以及流式细胞术进一步验证目标表观转录调控因子的抗肿瘤分子机制。结果·针对表观转录调控因子的靶向小分子药物库筛选和功能基因组筛选鉴定出CDK12和CDK13(CDK12/13)是GBM和DIPG共同的潜在治疗新靶点。在多个GBM和DIPG细胞系中,通过CRISPR-Cas9方法敲除CDK12能够显著降低其体外细胞活性。CDK12/13抑制剂SR-4835或THZ531也均能够通过拮抗细胞增殖和促进细胞凋亡造成这2类HGGs细胞系的体外生长受到显著抑制。SR-4835处理GBM和DIPG细胞之后的RNA-seq转录组分析结果表明,HGGs细胞中受CDK12/13抑制剂作用而表达显著下调的基因主要富集在转录调控、DNA损伤反应(DNA damage response,DDR)通路、泛素-蛋白酶体通路以及细胞周期等生物学过程。进一步通过一系列实验方法验证了在DIPG和GBM中,靶向抑制CDK12/13显著下调DDR相关基因的转录进而引起DNA损伤的累积,并诱导细胞发生G2-M细胞周期阻滞。结论·CDK12/13是GBM和DIPG这2类HGGs共同的潜在表观转录靶向治疗靶标;该发现为后续体内模型验证、组合治疗测试提供了理论支持,也为未来进一步的临床转化应用奠定了基础。 展开更多
关键词 胶质母细胞瘤 弥漫性内生性脑桥胶质瘤 分子靶向治疗 抗肿瘤药物库筛选 crispr-cas9 CDK12 CDK13
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