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基于CRISPR-Cas9敲除系统的胚胎干细胞基态多能性退出调控基因的筛选与鉴定
1
作者 杨艺 阮艳 +3 位作者 张俊磊 田衍平 余梦 李红丽 《陆军军医大学学报》 北大核心 2025年第18期2223-2236,共14页
目的系统性鉴定调控胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)基态多能性退出的关键基因,为深入解析多能性状态转换及早期细胞命运决定机制提供新靶点和理论依据。方法利用全基因组Brie敲除文库感染Nanog-绿色荧光蛋白(Nanog-green fluores... 目的系统性鉴定调控胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)基态多能性退出的关键基因,为深入解析多能性状态转换及早期细胞命运决定机制提供新靶点和理论依据。方法利用全基因组Brie敲除文库感染Nanog-绿色荧光蛋白(Nanog-green fluorescent protein,Nanog-GFP)报告基因标记的ESC,在白血病抑制因子/血清(leukemia inhibitory factor/serum,LIF/S)条件下持续培养14 d;通过流式细胞术分选Nanog-GFP^(+)(基态)与Nanog-GFP^(-)(始发态)细胞群,提取基因组DNA进行高通量测序;采用MAGeCK软件分析GFP^(-)/Input、GFP^(+)/Input与GFP^(+)/GFP^(-)组的差异基因,利用Metascape和基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)进行功能富集分析;基于筛选结果构建候选基因敲除模型,通过细胞形态观察、Nanog阳性率检测、克隆形成实验及分子标志物检测评估候选基因功能。结果在GFP^(+)/Input筛选中,鉴定出2921个负向变化基因(主要富集于RNA代谢、细胞周期等基础生命过程)和1393个正向变化基因(主要富集于神经系统发育、糖代谢和脉管系统发育等过程)。在GFP^(-)/Input筛选中,鉴定到2765个负向变化基因(主要富集于RNA代谢、细胞周期等基础生命过程)和1303个正向变化基因(主要富集于神经发育、细胞存活、内皮迁移等过程)。在GFP^(+)/GFP^(-)筛选中,鉴定出1001个负向变化基因[主要参与细胞应激响应和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路抑制]和983个正向变化基因[主要参与成纤维细胞生长因子/细胞外信号调节激酶(fibroblast growth factor/extracellular signal-regulated kinase,FGF/ERK)信号通路和糖代谢过程],其中不仅包括已知的多能性维持因子(如Nanog、Nr5a2、Klf2、Klf4)及多能性退出相关基因(如Gata6、Grb2、Zeb1、Fgfr1),还包括一些在基态多能性退出过程中功能尚未明确的基因(如Dmrt1、Rxra、Zbtb14和Tmem41b)。候选基因功能验证显示,瞬时敲除Dmrt1、Tmem41b和Hic2的ESC中Nanog+细胞比例显著升高(P<0.01),表明这些基因可能抑制基态多能性退出。Dmrt1稳定敲除使ESC呈现更基态的表型,表现为克隆形态变紧密、呈穹隆状,未分化克隆比例增加(P<0.01),基态多能性标志基因(如Nanog、Nr5a2、Dppa3)表达上调(P<0.01),而始发态标志基因(如Fgf5、Lefty1、Dnmt3b)表达下调(P<0.01)。回复表达Dmrt1可逆转上述表型。结论本研究通过全基因组CRISPR-Cas9筛选鉴定出调控ESC基态多能性退出的候选基因集,明确Dmrt1在促进ESC基态多能性退出过程中的关键作用。 展开更多
关键词 crispr-cas9 胚胎干细胞 基态 始发态 多能性退出
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基于CRISPR-Cas9基因编辑技术的《实验动物学》教学实践
2
作者 邹存岩 郭慧 +7 位作者 赵一多 菅瑞珍 马月宏 张慧文 曹晓东 张子英 刘奕廷 韩帅 《畜牧兽医科技信息》 2025年第4期7-11,共5页
《实验动物学》课程采用CRISPR-Cas9技术线上线下教学,引导学生理解CRISPR-Cas9技术对于基因功能、遗传疾病机制等的探究,研发课程前沿性实践探索内容,激发学生的创造性思维能力;同时融入思政教育,深刻认识CRISPR-Cas9技术背后的伦理和... 《实验动物学》课程采用CRISPR-Cas9技术线上线下教学,引导学生理解CRISPR-Cas9技术对于基因功能、遗传疾病机制等的探究,研发课程前沿性实践探索内容,激发学生的创造性思维能力;同时融入思政教育,深刻认识CRISPR-Cas9技术背后的伦理和社会形态意识,强化实践能力,促进团队合作,激发学生科研兴趣和引导学生做好职业规划。 展开更多
关键词 实验动物学 crispr-cas9 课程思政 前沿性
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CRISPR-Cas9基因编辑技术在羊育种中的研究进展
3
作者 赵进韬 张瑞国 王喜军 《中国草食动物科学》 北大核心 2025年第5期79-84,共6页
CRISPR-Cas9基因编辑技术是利用细菌的适应性免疫系统,精确对目标DNA序列进行切割和编辑的一种革命性的分子工具。其核心优势在于高效性、精准性和灵活性,能够在基因组特定位点插入、删除或替换,从而实现对基因功能的精确调控。相比传... CRISPR-Cas9基因编辑技术是利用细菌的适应性免疫系统,精确对目标DNA序列进行切割和编辑的一种革命性的分子工具。其核心优势在于高效性、精准性和灵活性,能够在基因组特定位点插入、删除或替换,从而实现对基因功能的精确调控。相比传统的基因编辑技术,CRISPR-Cas9操作简便、成本低廉,且适用于多种生物体系,因此在基础研究、医学治疗和农业育种等领域得到了广泛应用。在羊育种研究中,应用CRISPRCas9基因编辑技术可以精准编辑与其重要经济性状相关的基因,如肌肉生长(MSTN)、羊毛品质(FGF5)和抗病性(HYAL2)等基因,从而加速优良品种的分子育种进程;另外,CRISPR-Cas9基因编辑技术还可用于改善羊的繁殖效率和抗病能力。本文就CRISPR-Cas9基因编辑技术的基本原理及其在羊育种研究中的基因功能调控、生产性能改良和抗病育种等方面进行阐释,同时探讨其应用过程中存在的潜在挑战,以期为推动育种技术创新提供理论参考。 展开更多
关键词 羊 crispr-cas9 基因编辑 分子育种 重要性状
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CRISPR-Cas9基因编辑报道系统于dbDNA来源的iPSC AAVS1安全港的定点整合研究
4
作者 何佳佳 陈耀 +2 位作者 曹淳 鞠小丽 周小明 《华中科技大学学报(医学版)》 北大核心 2025年第2期151-158,共8页
目的建立简便的doggybone DNA(dbDNA)制备技术路线,探讨dbDNA与传统质粒DNA基因表达与诱导免疫反应的差异;利用dbDNA诱导人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)重编程为诱导性多能干细胞(induced pluripotent ste... 目的建立简便的doggybone DNA(dbDNA)制备技术路线,探讨dbDNA与传统质粒DNA基因表达与诱导免疫反应的差异;利用dbDNA诱导人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)重编程为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC);探索在iPSC AAVS1位点插入超长DNA片段的方案,并同时将Cas9表达框定点插入dbDNA来源的iPSC腺相关病毒位点1(adeno-associated virus site 1,AAVS1)安全港内,构建仅需输入目的基因靶向单向导RNA(single guide RNA,sgRNA)即可实现iPSC基因编辑的稳定细胞株。方法利用Phi29 DNA聚合酶多重置换扩增、原核端粒酶TelN酶切及共价连接、限制性内切酶和外切酶去除骨架环,从而建立简便的dbDNA制备技术路线,将dbDNA-GFP载体与pMax-dbDNA-GFP传统质粒载体分别电转至PBMC,检测绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达效率,利用qPCR检测两组细胞干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的mRNA表达水平;制备dbDNA重编程载体dbDNA-MOS、dbDNA-KLF4、dbDNA-MYC及dbDNA-BCL并核转PBMC诱导重编程,通过形态学、碱性磷酸酶染色、RT-PCR以及干细胞多能性标志物检测来鉴定dbDNA-iPSC细胞系;在iPSC AAVS1位点利用ZFN与TALEN基因编辑技术插入11.5 kb的含有Cas9表达框、序列中引入终止密码子的EGFP读码框、真核细胞筛选标记等元件的超长DNA片段,通过红色荧光检测、基因组PCR反应以及Western blot等方法鉴定Cas9整合入AAVS1位点的iPSC细胞株,将EGFP单链同源修复模板与EGFP sgRNA共转染阳性iPSC细胞株,靶向修复EGFP基因中错误终止密码子,正确表达绿色荧光蛋白,从而验证Cas9蛋白的基因编辑能力。结果成功制备dbDNA载体并利用其实现基因表达,dbDNA表达GFP基因效率与传统质粒DNA表达效率相近,IFN-γ的mRNA表达水平dbDNA组小于传统质粒DNA组;成功获取形态似人胚胎干细胞,碱性磷酸酶染色、多能性相关基因表达及干细胞多能性标志物阳性的iPSC细胞系;并在该细胞系安全港AAVS1位点成功基因编辑插入超长片段CRISPR-Cas9基因编辑报道系统,基因组PCR鉴定整合片段成功插入基因组,表达红色荧光蛋白,Western blot证实Cas9蛋白成功表达,并成功修复EGFP基因,使细胞表达绿色荧光。结论本研究成功建立了简便的dbDNA制备的技术路线,dbDNA载体基因表达效率与传统质粒DNA无差异,诱导免疫反应较小;经形态学、碱性磷酸酶染色、RT-PCR以及干细胞多能性标志物鉴定获取dbDNA来源的iPSC;成功在iPSC AAVS1安全港插入一个11.5 kb的超长DNA片段,构建Cas9介导基因编辑的iPSC稳定细胞株。 展开更多
关键词 诱导性多能干细胞 dbDNA crispr-cas9 腺相关病毒位点1
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CRISPR-Cas9基因编辑技术在西洋参中的探索与应用
5
作者 邱杰 胡静 +4 位作者 马荣荣 毛积磊 胡怡林 刘甜甜 侯丽娟 《农业开发与装备》 2025年第8期85-87,共3页
成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas基因编辑技术由于其易于操作且高效,成为应用最广泛的基因编辑工具,开启了基因组工程的新时代,越来越多的植物物种通过这种技术进行基因定向编辑。西洋参是五加科人参属多年生药食同源的名贵中... 成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas基因编辑技术由于其易于操作且高效,成为应用最广泛的基因编辑工具,开启了基因组工程的新时代,越来越多的植物物种通过这种技术进行基因定向编辑。西洋参是五加科人参属多年生药食同源的名贵中草药之一,在药品、食品以及化妆品等多个领域均有广泛的应用。若将基因编辑技术应用于人参等药用植物具有深远意义。然而,CRISPR-Cas9基因编辑技术在西洋参物种的应用还处于初级阶段。对基因编辑技术的发展历程、结构特点、工作原理以及在不同植物物种中的应用进行论述,并对基因编辑技术在西洋参中的应用前景进行了展望。目的是为该技术在西洋参基因组功能研究、遗传改良和种质创新等方面的应用提供参考。 展开更多
关键词 crispr-cas9 基因编辑 西洋参 遗传改良
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CRISPR-Cas9技术在作物育种中的应用及伦理考量
6
作者 陈春彦 《种子科技》 2025年第6期32-34,共3页
CRISPR-Cas9技术通过精确的基因敲除、插入或定点突变等,显著提高了作物抗逆性及产量,目前已广泛应用于各个领域,具有操作简单、周期短、效率高等优点。介绍了CRISPR-Cas9技术的产生与发展、技术原理及其在粮食作物和经济作物育种中的应... CRISPR-Cas9技术通过精确的基因敲除、插入或定点突变等,显著提高了作物抗逆性及产量,目前已广泛应用于各个领域,具有操作简单、周期短、效率高等优点。介绍了CRISPR-Cas9技术的产生与发展、技术原理及其在粮食作物和经济作物育种中的应用,并分析了相关研究和应用案例,深入探讨了该技术面临的问题,为保障全球粮食安全和农业可持续发展提供参考。 展开更多
关键词 crispr-cas9技术 作物育种 伦理考量
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基于CRISPR-Cas9的黄瓜Csago1c突变体创制及其种子萌发分析 被引量：1
7
作者 况勇 肖逸 +3 位作者 管丽丽 孙照龙 李俊 甘德芳 《核农学报》 北大核心 2025年第8期1617-1629,I0002-I0004,共16页
Argonaute(AGO)蛋白是RNA诱导的基因沉默复合体的核心组分,参与调控植物生长发育及逆境胁迫响应等生物学过程。为探讨黄瓜Cs AGO1c基因的功能,利用CRISPR/Cas9技术构建黄瓜Cs AGO1c基因编辑载体,农杆菌介导法转化新泰密刺自交系,经筛选... Argonaute(AGO)蛋白是RNA诱导的基因沉默复合体的核心组分,参与调控植物生长发育及逆境胁迫响应等生物学过程。为探讨黄瓜Cs AGO1c基因的功能,利用CRISPR/Cas9技术构建黄瓜Cs AGO1c基因编辑载体,农杆菌介导法转化新泰密刺自交系,经筛选和分子检测获得CsAGO1c基因突变植株,分析Csago1c突变体的编辑情况、突变体植株的表型以及种子萌发情况。结果表明,试验获得4株转基因抗性苗(T_(0)),其中#4和#12为编辑植株,#7和#11未发生编辑;但#7植株在T1代出现了大片段碱基缺失、少数碱基缺失、单碱基插入以及碱基替换等多种编辑情况。突变体植株在叶片形状、节间长、卷须、侧枝、雄花和雌花着生节位等与对照均无明显差异,但突变体种子萌发率降低,推测Cs AGO1c可能参与调控黄瓜种子的萌发过程。该研究结果对探明黄瓜Cs AGO1c基因功能以及对黄瓜遗传改良和新品种选育具有重要理论指导意义。 展开更多
关键词 黄瓜 Argonaute(AGO)蛋白 CRISPR/Cas9 基因编辑 种子萌发
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利用CRISPR-Cas9系统定点突变猪MSTN基因的研究 被引量：12
8
作者 张冬杰 刘娣 +2 位作者 张旭 汪亮 杨国伟 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期207-212,共6页
为了今后能够有效的利用CRISPR-Cas9系统进行基因功能研究及转基因动物的培育,本研究将带有绿色荧光蛋白(GFP)和肌肉生长抑制素基因(Myostatin,MSTN)靶序列的CRISPR-Cas9系统转染入PK15细胞系,利用流式细胞仪分离并收集转染成功的阳性细... 为了今后能够有效的利用CRISPR-Cas9系统进行基因功能研究及转基因动物的培育,本研究将带有绿色荧光蛋白(GFP)和肌肉生长抑制素基因(Myostatin,MSTN)靶序列的CRISPR-Cas9系统转染入PK15细胞系,利用流式细胞仪分离并收集转染成功的阳性细胞,使用PCR扩增结合克隆测序的方法检测和分析CRISPR-Cas9系统的定点突变情况,以评价CRISPR-Cas9系统的作用效果。结果发现,随机挑选的100个阳性克隆中,38个发生了变异,突变效率为38%,其中32个为插入突变,6个为缺失突变。插入突变中突变1(Mutation1)所占比例最高,为47.4%。本研究中CRISPR-Cas9系统的突变效率达到了38%,是目前进行基因组编辑的一个有效工具,推测其突变类型具有一定的偏好性。 展开更多
关键词 crispr-cas9系统 基因组编辑 突变率
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木薯MeMLO12基因克隆及其CRISPR-Cas9表达载体的构建 被引量：2
9
作者 蔡吉苗 李博勋 +3 位作者 黄贵修 李超萍 时涛 王国芬 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2024年第8期1528-1537,共10页
MLO基因是植物中特有的一类抗病性负调控因子,该基因突变导致植物产生广谱抗病性。本研究从木薯全基因组中克隆获得木薯MLO12基因的DNA和cDNA序列,并将其命名为MeMLO12。该基因全长3743 nt、编码区(ORF)全长1728 nt,具有一个完整的开放... MLO基因是植物中特有的一类抗病性负调控因子,该基因突变导致植物产生广谱抗病性。本研究从木薯全基因组中克隆获得木薯MLO12基因的DNA和cDNA序列,并将其命名为MeMLO12。该基因全长3743 nt、编码区(ORF)全长1728 nt,具有一个完整的开放阅读框,含有15个外显子和14个内含子,编码586个氨基酸,蛋白的分子质量为67.2 kDa,等电点为8.85。该基因编码的蛋白定位在内质网膜上,无信号肽,在23~45、74~96、161~183、285~307、312~334、371~393、413~435 aa处形成7次跨膜结构域。qRT-PCR定量分析发现,受木薯黄单胞病菌侵染后,MeMLO12基因在木薯抗、感品种中的表达量存在明显的差异,参与木薯与黄单胞菌之间的互作,表现出负调控作用。选择该基因第11个外显子进行Snap Gene Viewer分析,获得了10 455条sgRNA的种子序列,从中选取3条靶序列约23 nt,碱基组成上3'末端含G结尾,将其构建到CRISPR-Cas9载体上,经验证,确认MeMLO12的3条靶序列已经成功构建到基因编辑载体上,将其命名为pSGR-Cas9-AT-MeMLO12载体。 展开更多
关键词 木薯 MeMLO12基因 克隆 表达分析 crispr-cas9载体 构建
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T7E1检测CRISPR-Cas9基因编辑效果实验设计 被引量：2
10
作者 王宏刚 魏远 +1 位作者 李艳君 朱玉山 《实验技术与管理》 CAS 北大核心 2023年第5期38-41,共4页
CRISPR-Cas9是一种现代生命科学研究中普遍使用的新型基因编辑技术。为了升级课程内容体系,使实验教学贴近科研实际,提升实验课程教学质量,设计了T7核酸内切酶1(T7E1)检测CRISPR-Cas9基因编辑效果实验。以CRISPR-Cas9基因编辑技术对mfn... CRISPR-Cas9是一种现代生命科学研究中普遍使用的新型基因编辑技术。为了升级课程内容体系,使实验教学贴近科研实际,提升实验课程教学质量,设计了T7核酸内切酶1(T7E1)检测CRISPR-Cas9基因编辑效果实验。以CRISPR-Cas9基因编辑技术对mfn1编辑过的HeLa细胞为实验材料,提取基因组DNA,PCR扩增mfn1基因片段,切胶回收后,变性,退火,使用T7E1对编辑效果进行检测。经1%琼脂糖凝胶电泳,可观察到T7E1将略大于500 bp的mfn1基因片段切成两条大小约为250 bp的DNA片段,表明CRISPR-Cas9成功地对mfn1进行了编辑。 展开更多
关键词 T7核酸内切酶1 crispr-cas9 实验教学 科研反哺教学
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CRISPR-Cas9技术在肿瘤耐药基因筛选中的研究进展 被引量：1
11
作者 张洁 杨谭 卢永刚 《海南医学院学报》 CAS 2021年第11期872-875,共4页
耐药是使用肿瘤分子靶向药物治疗肿瘤面临的主要问题,目前筛选耐药基因常用策略主要为功能性基因筛选。近年来,CRISPR-Cas9基因编辑技术因具有精准、简便、高效的特点,在肿瘤相关基因的功能学研究中被广泛应用。本文就CRISPR-Cas9文库... 耐药是使用肿瘤分子靶向药物治疗肿瘤面临的主要问题,目前筛选耐药基因常用策略主要为功能性基因筛选。近年来,CRISPR-Cas9基因编辑技术因具有精准、简便、高效的特点,在肿瘤相关基因的功能学研究中被广泛应用。本文就CRISPR-Cas9文库筛选技术的原理和在功能性基因筛选方面的应用进行了综述,同时对该技术的应用前景进行了展望。 展开更多
关键词 crispr-cas9技术 功能基因 筛选
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CRISPR-Cas9技术在作物中研究进展 被引量：3
12
作者 薛永国 刘鑫磊 +2 位作者 唐晓飞 曹旦 栾晓燕 《黑龙江农业科学》 2020年第2期125-130,共6页
基因编辑技术CRISPR-Cas9系统的出现,为基因功能研究和作物改良提供了技术支持。本文就CRISPR-Cas9技术背景、发展等做了简要说明,综述了CRISPR-Cas9技术在基因敲除、定点整合和调控转录的应用中的原理、特点与前景,同时总结了针对CRISP... 基因编辑技术CRISPR-Cas9系统的出现,为基因功能研究和作物改良提供了技术支持。本文就CRISPR-Cas9技术背景、发展等做了简要说明,综述了CRISPR-Cas9技术在基因敲除、定点整合和调控转录的应用中的原理、特点与前景,同时总结了针对CRISPR-Cas9技术缺点改进的最新研究成果,重点介绍了此技术在作物中应用情况,并对其在作物中的应用前景进行了展望。 展开更多
关键词 crispr-cas9 基因编辑 作物 sgRNA
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用CRISPR-Cas9在绵羊成纤维细胞ACTG1导入荧光标记基因
13
作者 郭延华 皮文辉 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期1747-1755,共9页
【目的】在绵羊成纤维细胞中,针对ACTG1基因羧基端,定点导入荧光蛋白标记基因,将外源基因定点导入绵羊基因组中,建立有效的方法。【方法】CRISPR-Cas9系统在绵羊成纤维细胞基因组特定区域引起DNA双链断裂,从而诱导细胞修复断裂的的基因... 【目的】在绵羊成纤维细胞中,针对ACTG1基因羧基端,定点导入荧光蛋白标记基因,将外源基因定点导入绵羊基因组中,建立有效的方法。【方法】CRISPR-Cas9系统在绵羊成纤维细胞基因组特定区域引起DNA双链断裂,从而诱导细胞修复断裂的的基因组。通过NHEJ修复途径,在特定位点导入外源基因,改善定点导入效率。【结果】采用CRISPaint通用供体模板,结合CRISPR-Cas9系统,在绵羊成纤维细胞ACTG1基因导入荧光标记效率达1.4%,获得了外源基因定点导入的单克隆细胞株。【结论】CRISPR-Cas9系统结合NHEJ,能够有效的将大的外源DNA序列导入绵羊成纤维细胞的预定基因组位点。 展开更多
关键词 绵羊 成纤维细胞 ACTG1 crispr-cas9
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利用CRISPR-Cas9基因编辑技术制备牛MSTN基因编辑胚胎 被引量：10
14
作者 尉翔栋 吕晨晨 +7 位作者 朱肖亭 冯亚杰 辛晓玲 施巧婷 梁瑞清 徐照学 王二耀 滑留帅 《河南农业科学》 北大核心 2019年第2期131-136,共6页
为了给双肌肉牛品种的培育提供新的遗传素材,拟利用CRISPR-Cas9基因编辑技术制备牛MSTN基因编辑胚胎。从采集到的86对牛卵巢中收集卵母细胞进行成熟培养以及体外受精,并使用在线软件设计能够在体外高效编辑牛MSTN基因的gRNA序列,将验证... 为了给双肌肉牛品种的培育提供新的遗传素材,拟利用CRISPR-Cas9基因编辑技术制备牛MSTN基因编辑胚胎。从采集到的86对牛卵巢中收集卵母细胞进行成熟培养以及体外受精,并使用在线软件设计能够在体外高效编辑牛MSTN基因的gRNA序列,将验证后所得的体外切割活性最高的gRNA与Cas9 mRNA的混合物显微注射牛的受精卵,培养至囊胚后,利用T7EI核酸内切酶法检测囊胚中MSTN基因的编辑情况,然后将基因编辑阳性的囊胚样品进行测序验证。结果表明,牛胚胎体外培养平均囊胚率为21.28%;在设计的多条gRNA序列中,gRNA5的体外切割活性最高,为96.00%;将Cas9 mRNA和gRNA5的混合物显微注射受精卵并培养至囊胚后,T7EI核酸内切酶检测表明囊胚MSTN基因切割阳性率为15.40%;对MSTN基因编辑囊胚阳性样品测序表明,在gRNA5靶位点存在部分片段缺失。综上,说明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功获得了牛MSTN基因编辑胚胎。 展开更多
关键词 牛 MSTN基因 基因编辑 crispr-cas9 胚胎
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Lager酵母中CRISPR-Cas9基因敲除系统的构建 被引量：4
15
作者 李梦琦 张可心 +4 位作者 郑飞云 钮成拓 刘春凤 李崎 王金晶 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期36-44,96,共10页
利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在Lager型啤酒酵母(Saccharomyces pasteurianus)中建立CRISPRCas9基因敲除系统。将质粒pMY中毕赤酵母基因表达系统中常用GAP启动子替换为酿酒酵母基因表达系统中常用PGK1启动子,增强外源基因表达量。设计... 利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在Lager型啤酒酵母(Saccharomyces pasteurianus)中建立CRISPRCas9基因敲除系统。将质粒pMY中毕赤酵母基因表达系统中常用GAP启动子替换为酿酒酵母基因表达系统中常用PGK1启动子,增强外源基因表达量。设计酿酒酵母(S.cerevisiae)基因组及真贝酵母(S.eubayanus)基因组中目的基因TRP1小向导RNA。增加向导RNA结构中锤头状核酶和肝炎三角洲病毒核酶结构,提高gRNA转录水平。Lager型啤酒酵母Pilsner中TRP1基因被敲除,成功构建Lager型啤酒酵母中CRISPR-Cas9基因敲除系统。 展开更多
关键词 Lager酵母 crispr-cas9 基因敲除 S.pasteurianus
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基于CRISPR-Cas9技术的鸡成纤维细胞系全基因组敲除文库的建立与初步应用 被引量：4
16
作者 徐娟 刘忠媛 +7 位作者 刘彦峰 廖瑛 仇旭升 宋翠萍 谭磊 刘玮炜 孙英杰 丁铲 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2022年第5期50-59,共10页
CRISPR-Cas9已被广泛证实是高效强大的第三代基因编辑工具。高通量且系统无偏的靶向全基因组水平编辑技术的应用对充分理解基因功能具有重要的意义。基于CRISPR-Cas9技术的大规模筛选方法已在哺乳动物研究领域取得重要进展,尽管鸡全基... CRISPR-Cas9已被广泛证实是高效强大的第三代基因编辑工具。高通量且系统无偏的靶向全基因组水平编辑技术的应用对充分理解基因功能具有重要的意义。基于CRISPR-Cas9技术的大规模筛选方法已在哺乳动物研究领域取得重要进展,尽管鸡全基因组测序的工作已完成,但至今尚未有关于禽类CRISPR-Cas9文库的研究,严重限制了对其基因功能的解析。本研究利用CRISPR-Cas9技术构建鸡成纤维细胞系(DF-1)细胞全基因组敲除文库,并利用新城疫病毒(NDV)感染DF-1文库细胞,经过高通量测序筛选到sgRNA富集程度排名前10的影响NDV复制的关键宿主因子。该研究首次构建了鸡CRISPR-Cas9文库筛选模型,为进一步研究家禽免疫学、病毒学等提供强大高效的工具。 展开更多
关键词 crispr-cas9文库筛选 DF-1细胞 新城疫病毒 c-C基序趋化因子类26
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CRISPR-Cas9基因编辑技术在牛、羊生产中的应用研究进展 被引量：8
17
作者 潘东霞 王辉 +1 位作者 熊本海 唐湘方 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期4880-4889,共10页
近年来,基因编辑技术作为一种基因组修饰工具迅速发展,包括锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)和成簇规则间隔短回文重复序列相关蛋白(clus... 近年来,基因编辑技术作为一种基因组修饰工具迅速发展,包括锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)和成簇规则间隔短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein,CRISPR-Cas)系统在内的基因编辑工具使生物体的基因组DNA靶向修饰成为可能,尤其是CRISPR-Cas9系统的出现,加速了基因编辑技术的发展,成为基础科学和应用科学中的革命性工具。与ZFNs和TALENs技术相比,CRISPR-Cas9系统因其高灵活性、灵敏度、特异性和成本效益而被广泛使用。CRISPR-Cas9基因编辑技术通过靶向特定序列精确地切割DNA,并通过在特定基因组位点产生双链断裂来添加、去除或替换核苷酸等方式在位点引入特异性修饰对畜牧生产的不同方面做出了重大贡献,产生了改善牲畜生产和具有抗病性等多种动物模型,以研究畜禽关键基因功能,加速性状改良。作者主要阐述了CRISPR-Cas9系统的机制与功能及其在牛、羊生产中的应用进展,以期为今后的相关研究提供参考。 展开更多
关键词 crispr-cas9系统 基因编辑 牛 羊 繁殖 泌乳 抗病
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CRISPR-Cas9介导的蒙古牛MSTN基因敲除细胞系的建立 被引量：3
18
作者 郭梓茹 张立 +4 位作者 马云龙 苏小虎 周欢敏 张焱如 刘晓 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第4期841-849,共9页
试验旨在利用CRISPR-Cas9技术对蒙古牛胎儿成纤维细胞肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因进行编辑,构建无标记的MSTN基因敲除的蒙古牛细胞系,为培育肌肉发达的蒙古牛提供试验材料。通过组织块贴壁法对妊娠45d的蒙古牛胎儿建立皮肤成纤... 试验旨在利用CRISPR-Cas9技术对蒙古牛胎儿成纤维细胞肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因进行编辑,构建无标记的MSTN基因敲除的蒙古牛细胞系,为培育肌肉发达的蒙古牛提供试验材料。通过组织块贴壁法对妊娠45d的蒙古牛胎儿建立皮肤成纤维细胞系,同时在第2外显子区域选定1个gRNA靶位点,使用在线软件设计sgRNA序列,并选取评分较高的3个sgRNA,采用试剂盒法构建无标记的Cas9/gRNA载体,随后用T7E1酶酶切法对其进行活性验证,将有活性的载体用电转法转染蒙古牛胎儿成纤维细胞,通过无限稀释法和口吸管法将转染后的单细胞接种于96孔板扩繁后提取DNA,对其进行PCR扩增及测序验证来获取阳性细胞。本试验构建了3个无标记的CRISPR-Cas9载体,经验证1个有活性,对电转染后的单细胞进行筛选共获得96个单细胞株,测序分析后有1个单细胞株发生单碱基突变,使得MSTN基因不能编码正常的蛋白。试验成功建立了1个MSTN基因失活的细胞株,可作为后续体细胞核移植的供体细胞,用于生产无标记的敲除MSTN基因的蒙古牛,对培养产肉率高并具有生物安全性的蒙古牛具有重要的意义。 展开更多
关键词 crispr-cas9系统 MSTN基因 蒙古牛 无标记细胞系
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基于CRISPR-Cas9技术构建gpr41基因敲除的RAW264.7细胞系 被引量：3
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作者 苏丛 徐方明 +6 位作者 伍婷 张鹏飞 陈昊然 刘艳艳 兰燕虎 李家斌 律娜 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2020年第5期800-803,共4页
采用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建G-蛋白偶联受体41(gpr41)基因敲除的RAW264.7细胞系。利用慢病毒转染,构建稳定表达Cas9蛋白的巨噬细胞株。针对gpr41基因作用的功能区域,设计靶向gpr41基因的向导RNA(gRNA),构建pLenticrisprV2重组质... 采用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建G-蛋白偶联受体41(gpr41)基因敲除的RAW264.7细胞系。利用慢病毒转染,构建稳定表达Cas9蛋白的巨噬细胞株。针对gpr41基因作用的功能区域,设计靶向gpr41基因的向导RNA(gRNA),构建pLenticrisprV2重组质粒转化DH5α感受态细胞,筛选出重组子测序验证gRNA的有效性。鉴定成功的pLenticrisprV2-gpr41-gRNA重组质粒采用转染试剂转染巨噬细胞系RAW264.7。筛选阳性单克隆细胞株,Western blot检测gpr41基因的表达。测序结果证实pLenticrisprV2-gpr41-gRNA重组质粒构建成功;Western blot筛选出重组质粒pLenticrisprV2-gpr41-gRNA3转染RAW264.7细胞13号单克隆株的GPR41蛋白不表达。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了gpr41基因敲除的巨噬细胞株,为研究gpr41基因在RAW264.7细胞中的作用机制奠定基础。 展开更多
关键词 crispr-cas9技术 gpr41 巨噬细胞 基因敲除
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CRISPR-Cas9系统及其在动物生产和疾病基因治疗中的应用 被引量：2
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作者 俞大阔 李卫真 +6 位作者 刘学洪 王绍卿 彭洁 刘超英 赵敏 田建云 张永云 《家畜生态学报》 北大核心 2017年第1期79-84,共6页
CRISPR-Cas9系统是生产转基因动物的有力的基因组编辑工具,具有制作相对简单、成本相对较低的优点,可快速用于基因敲除、基因定点突变和基因修复等,在动物基因组定点改造、编辑、疾病控制和治疗中具有广阔的应用前景。文章从CRISPR-Cas... CRISPR-Cas9系统是生产转基因动物的有力的基因组编辑工具,具有制作相对简单、成本相对较低的优点,可快速用于基因敲除、基因定点突变和基因修复等,在动物基因组定点改造、编辑、疾病控制和治疗中具有广阔的应用前景。文章从CRISPR-Cas9系统的技术原理、研究进展和应用等方面进行描述,旨在阐明CRISPR-Cas9系统的原理及在动物基因组编辑方面的优势和局限,为动物生产、动物基因组编辑、遗传疾病的治疗等研究提供支撑。 展开更多
关键词 crispr-cas9系统 基因组编辑 动物生产 疾病治疗 局限性
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