具备高效CRISPR协同激活活性的HIEC6-dCas9-SAM稳转细胞株构建 被引量：1

1

作者 任柱平 杨泰然 +4 位作者 雷元三 金留飞 崔古贞 田益明 陈峥宏 《生物技术通报》 北大核心 2025年第5期52-61,共10页

【目的】以人正常肠道上皮细胞(HIEC6)为研究模型,建立具有高水平转录激活活性的HIEC6-dCas9-SAM单克隆细胞株,为利用CRISPR激活(CRISPRactivation,CRISPRa)系统筛选人类肠道疾病发生发展相关关键基因和探究分子致病机制提供细胞工具。... 【目的】以人正常肠道上皮细胞(HIEC6)为研究模型,建立具有高水平转录激活活性的HIEC6-dCas9-SAM单克隆细胞株,为利用CRISPR激活(CRISPRactivation,CRISPRa)系统筛选人类肠道疾病发生发展相关关键基因和探究分子致病机制提供细胞工具。【方法】首先利用PiggyBac转座子系统构建HIEC6-dCas9-SAM多克隆细胞;然后通过有限稀释法筛选单克隆细胞株,并使用免疫印迹、间接免疫荧光法鉴定单克隆细胞株中dCas9-SAM蛋白(dCas9、VP64、MS2、HSF1、p65)的表达情况;最后利用CRISPRa荧光报告系统和构建包装特定靶基因sgRNA慢病毒,检测所构建稳转株在转录和蛋白水平的CRISPR激活效率。【结果】成功获得两株HIEC6-dCas9-SAM单克隆细胞,两株细胞均能高水平稳定表达dCas9-SAM蛋白。CRISPRa荧光报告系统检测显示,两株HIEC6-dCas9-SAM稳转细胞的激活效率分别高达96.7%、99.0%。靶基因激活功能验证显示,在转录水平,两株HIEC6-dCas9-SAM稳转细胞中靶基因APN的转录激活水平分别高达2725倍和4521倍,SLC35A1基因的转录激活水平分别为27.5倍和18.1倍;在蛋白水平,APN蛋白的激活效率分别高于12.9倍和11.2倍,SLC35A1蛋白的激活效率分别为1.32倍和0.97倍。两株单克隆稳转细胞均表现出较高的转录激活活性。【结论】成功构建两株具有高水平CRISPR转录激活活性的HIEC6-dCas9-SAM单克隆稳转细胞,为后续基于CRISPRa系统筛选人类肠道疾病发生发展相关关键基因和探究分子致病机制提供了重要细胞工具。 展开更多

关键词 dcas9-sam HIEC6细胞 crispr激活 稳转细胞株

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基于CRISPR/dCas9-SAM系统筛选胃癌细胞增殖相关基因 被引量：1

2

作者 彭玉 巩琦凡 +5 位作者 台福敏 王田田 葛常辉 郑晓飞 秦宜德 付汉江 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2022年第11期1693-1698,共6页

目的利用CRISPR/dCas9-SAM系统探究影响胃癌细胞AGS增殖相关基因,分析其在胃癌发生发展中的作用。方法针对胃癌与正常胃组织差异表达的基因设计sgRNA,构建包装后获得慢病毒文库。以该文库感染AGS细胞后不同时间点作为筛选压力,收取第0、... 目的利用CRISPR/dCas9-SAM系统探究影响胃癌细胞AGS增殖相关基因,分析其在胃癌发生发展中的作用。方法针对胃癌与正常胃组织差异表达的基因设计sgRNA,构建包装后获得慢病毒文库。以该文库感染AGS细胞后不同时间点作为筛选压力,收取第0、7、14天3个时间点的AGS细胞。高通量测序分析感染后不同时间点AGS细胞中sgRNA富集情况,获得与AGS细胞增殖相关差异基因。结果生物信息学显示与0 d组相比,7 d组、14 d组分别获得阴性筛选差异基因42、45个,阳性筛选差异基因59、40个。其中7 d组和14 d组中阴性筛选和阳性筛选共有的基因各11个。结论筛选获得11个抑制AGS细胞增殖的基因,其中5个为蛋白编码基因,6个为长链非编码RNA(lncRNA)基因;筛选获得11个促进AGS细胞增殖的候选基因,其中3个为蛋白编码基因,8个为lncRNA基因。为进一步功能验证、全面解析胃癌发生发展过程奠定基础。 展开更多

关键词 crispr/dcas9-sam系统 细胞增殖 胃癌 长链非编码RNA

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CRISPR/dCas9-KRAB系统沉默猪LncRNA-NEAT1基因 被引量：1

3

作者 赵为民 戴超辉 +6 位作者 陈哲 涂枫 李辉 付言峰 李碧侠 任守文 程金花 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2023年第4期1036-1042,共7页

本研究利用RT-PCR检测LncRNA-NEAT1基因表达在细胞中的亚定位,采用5′RACE获得LncRNA-NEAT1基因的转录起始位点;利用CRISPOR软件对-300~0 bp区域的LncRNA-NEAT1启动子序列设计sgRNA并构建到px330载体,通过转染细胞与T7E1酶切验证sgRNA效... 本研究利用RT-PCR检测LncRNA-NEAT1基因表达在细胞中的亚定位,采用5′RACE获得LncRNA-NEAT1基因的转录起始位点;利用CRISPOR软件对-300~0 bp区域的LncRNA-NEAT1启动子序列设计sgRNA并构建到px330载体,通过转染细胞与T7E1酶切验证sgRNA效率;利用酶切和亚克隆方法将dCas9-KRAB-BSD片段替换px330载体的Cas9序列,形成重组px330-dCas9-KRAB载体;将验证有效的sgRNA构建到px330-dCas9-KRAB载体,形成px330-sgRNA-dCas9-KRAB载体。添加不同质量浓度的Blasticidin S处理细胞,以最小致死质量浓度来确定筛选质量浓度。转染px330-sgRNA-dCas9-KRAB载体并用Blasticidin S筛选细胞7 d后进行LncRNA-NEAT1基因的表达检测,同时对sgRNA在LncRNA-NEAT1基因启动子上的结合位点进行Sanger测序,以进一步验证上述结合位点是否发生切割。结果显示LncRNA-NEAT1主要表达于细胞核,而在细胞质中几乎不表达。5′RACE获得了LncRNA-NEAT15′端大约270 bp的序列。qPCR检测结果显示,与对照组相比,sgRNA1和sgRNA2能够显著抑制LncRNA-NEAT1的表达(P<0.05)。Sanger测序结果表明sgRNA1和sgRNA2所在的位点并没有发生碱基缺失和插入。研究结果为后续进一步研究LncRNA-NEAT1在先天性免疫反应中的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 crispr dcas9-KRAB LncRNA-NEAT1基因 猪 基因沉默

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CRISPR/dCas9技术在基因表达调控中的研究进展 被引量：2

4

作者 杨莎 郝海生 +6 位作者 杜卫华 庞云渭 赵善江 邹惠影 朱化彬 杨宇泽 赵学明 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第1期53-59,共7页

CRISPR/dCas9是在CRISPR/Cas9基因编辑系统的基础上改造升级建立起的一种用于调控基因组转录与表观遗传修饰的系统,它不仅继承了CRISPR/Cas9系统的精准性,同时还展现出了良好的作用效果。在该系统中dCas9蛋白保留了Cas9蛋白结合DNA的能... CRISPR/dCas9是在CRISPR/Cas9基因编辑系统的基础上改造升级建立起的一种用于调控基因组转录与表观遗传修饰的系统,它不仅继承了CRISPR/Cas9系统的精准性,同时还展现出了良好的作用效果。在该系统中dCas9蛋白保留了Cas9蛋白结合DNA的能力而切割功能不复存在。将dCas9蛋白与不同的激活、抑制效应子域和表观遗传调控酶偶联,可以对基因表达与表观遗传修饰进行精确调控。组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、DNA甲基化等表观遗传修饰过程是基因表达的基础,对整个生命过程作出了巨大的贡献,同时表观遗传与多种疾病和癌症都存在因果关系,因此以CRISPR/dCas9系统为框架的不同表观遗传修饰系统在人类疾病治疗和癌症研究领域具有重要的研究价值。笔者简要介绍了CRISPR/Cas9系统的发现过程以及作用原理,主要总结了以CRISPR/dCas9系统为框架的不同调控系统在基因表达调控和表观遗传调控中的应用以及优化过程,以期为从事相关领域的科研工作者提供一些参考。 展开更多

关键词 crispr/Cas9 dcas9 激活 抑制 表观遗传修饰

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CRISPR-dCas9系统在基因表达调控中的最新研究进展 被引量：2

5

作者 罗旻 顾华 《实验室研究与探索》 CAS 北大核心 2016年第3期20-23,共4页

CRISPR-Cas9系统自问世以来一直被广泛地应用于基因组编辑技术中,直到人们通过点突变的方式将Cas9的Ruv C和HNH剪切结构域失活得到d Cas9后,这个系统又有了新的功能——调节基因的表达水平。研究者通过改变g RNA的结构,并与RNA结合蛋白... CRISPR-Cas9系统自问世以来一直被广泛地应用于基因组编辑技术中,直到人们通过点突变的方式将Cas9的Ruv C和HNH剪切结构域失活得到d Cas9后,这个系统又有了新的功能——调节基因的表达水平。研究者通过改变g RNA的结构,并与RNA结合蛋白配对,从而招募转录因子以调节基因的转录水平,达到影响基因表达的目的。本文主要讨论了CRISPR-d Cas9系统的结构特点、作用原理和目前对调节基因表达的最新研究进展,以期为此领域的研究者提供参考。 展开更多

关键词 crispr dcas9 引导RNA 协同激活因子

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酿酒酵母中基于CRISPR/dCas9的基因转录调控工具的开发与应用 被引量：1

6

作者 陈永灿 张建志 司同 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期1-12,共12页

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是重要的模式真核微生物,广泛用于基础研究和工业发酵。基于CRISPR/dCas9系统开发的转录调控方法具有可编程、多重性和正交性等优点,在酿酒酵母的基因调控、功能基因组学、代谢工程等研究领域具有巨... 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是重要的模式真核微生物,广泛用于基础研究和工业发酵。基于CRISPR/dCas9系统开发的转录调控方法具有可编程、多重性和正交性等优点,在酿酒酵母的基因调控、功能基因组学、代谢工程等研究领域具有巨大潜力。本文关注酿酒酵母中CRISPR/dCas9基因转录调控工具的研究进展,阐述了不同转录调节结构域对dCas9或gRNA活性的调节,设计与优化dCas9和gRNA表达的方法,影响CRISPR/dCas9系统转录调控效率、特异性和通量的靶向性因素,最后总结了该工具在酿酒酵母代谢工程中的应用,并对该技术的未来发展提出了展望。 展开更多

关键词 酿酒酵母 crispr/dcas9 gRNA 转录调控 代谢工程

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CRISPR/Cas9系统在基因表达调控中的应用 被引量：5

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作者 魏泽辉 贾存灵 张智英 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期1387-1392,共6页

CRISPR/Cas9系统是2012年发展起来由RNA导向的基因组编辑技术。相比ZFN和TALENs技术,CRISPR/Cas9系统具有类似的打靶效率,且更易于操作。通过将核酸酶Cas9蛋白D10A和H840A位点突变,可以获得失去切割活性的dCas9蛋白。借助导向RNA将dCas9... CRISPR/Cas9系统是2012年发展起来由RNA导向的基因组编辑技术。相比ZFN和TALENs技术,CRISPR/Cas9系统具有类似的打靶效率,且更易于操作。通过将核酸酶Cas9蛋白D10A和H840A位点突变,可以获得失去切割活性的dCas9蛋白。借助导向RNA将dCas9与DNA特定位点结合的作用,可以实现抑制或激活基因转录,从而达到对特定基因表达进行调控的目的。本文主要从作用原理、影响因素等方面综述了CRISPR/Cas9系统在基因调控中的应用,以期为相关研究提供参考。 展开更多

关键词 crispr dcas9 转录抑制 转录激活

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CRISPR/Cas系统及其在结核分枝杆菌研究中的应用 被引量：3

8

作者 宋禹昊 李东 +6 位作者 孙江洋 时坤 李健明 宗颖 赵丹 曾范利 杜锐 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期2613-2621,共9页

簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)系统是一种针对入侵核酸的可遗传性原核适应性免疫系统。CRISPR/Cas系统可以产生高度特异性的基因双链断裂,并通过非同源末端连接(NHEJ)或者同源重组(HR)进行修复,如今已经成... 簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)系统是一种针对入侵核酸的可遗传性原核适应性免疫系统。CRISPR/Cas系统可以产生高度特异性的基因双链断裂,并通过非同源末端连接(NHEJ)或者同源重组(HR)进行修复,如今已经成为许多生物方便有效的基因组编辑工具。结核分枝杆菌因其基因操作的复杂性,其基因组研究存在诸多困难,因此,CRISPR/Cas系统的出现对结核分枝杆菌的研究具有里程碑式意义。本文围绕CRISPR/Cas系统在结核分枝杆菌中的应用,综述了国内外最新的研究进展,为结核分枝杆菌研究方法的选择提供参考。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 crispr/Cas系统 crispr/dcas9 crispr-Cas12a

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人源软骨细胞PIEZO2过表达细胞株模拟骨关节炎表型

9

作者 许博洋 樊逸菲 +5 位作者 杜雨青 孙梦泽 王俊雁 程锦 敖英芳 胡晓青 《中国生物化学与分子生物学报》 北大核心 2025年第6期871-878,共8页

为解析机械敏感性离子通道PIEZO2在骨关节炎(osteoarthritis, OA)中的分子机制,本研究通过构建内源性过表达PIEZO2的慢病毒载体,转染永生化人原代软骨细胞后成功建立稳定高表达PIEZO2的细胞株。首先明确人原代软骨细胞PIEZO2基因座的开... 为解析机械敏感性离子通道PIEZO2在骨关节炎(osteoarthritis, OA)中的分子机制,本研究通过构建内源性过表达PIEZO2的慢病毒载体,转染永生化人原代软骨细胞后成功建立稳定高表达PIEZO2的细胞株。首先明确人原代软骨细胞PIEZO2基因座的开放阅读框序列,设计特异性sgRNA序列,基于CRISPR/Cas9-SAM(协同激活调控)系统将转录激活元件定点整合至PIEZO2启动子区。利用慢病毒载体介导的基因靶向整合技术实现PIEZO2内源性过表达。mCherry荧光示踪联合流式分选验证显示,过表达细胞株中PIEZO2蛋白呈现膜特异性定位特征(定位效率78.49%)。qPCR检测证实PIEZO2 mRNA表达水平显著上调约17倍,Western印迹分析进一步佐证其膜定位蛋白质表达量增加。与野生型对照组相比,PIEZO2过表达细胞株呈现典型OA代谢表型:Ⅱ型胶原(Collagen type II alpha 1, COL2A1)mRNA表达下调至基准水平的50%,基质金属蛋白酶13(Matrix metalloproteinase 13, MMP13)mRNA表达激增至20倍。综合上述结果显示,PIEZO2过表达细胞株与经周期性机械应力加载(10%应变,0.5 Hz, 8 h/d,连续2 d)构建OA模型组的基质代谢表型变化趋势一致。因此,本研究成功建立了人源软骨细胞稳定高表达PIEZO2细胞株,该细胞模型为深入解析PIEZO2介导的机械转导信号网络及靶向药物筛选提供了可靠的研究平台。 展开更多

关键词 机械敏感性离子通道 PIEZO2 软骨细胞 骨关节炎 crispr/Cas9-sam系统

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表观遗传修饰影响花青苷合成研究进展 被引量：4

10

作者 张杨景晖 常沛瑶 +3 位作者 杨紫淑 薛宇航 李雪奇 张旸 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期1117-1127,共11页

花青苷是广泛存在于植物中的一类重要的类黄酮化合物,对植物生长、代谢、应激等方面具有重要作用。在植物生长发育过程中,花青苷使植物的花和果实呈现出丰富色彩的颜色,从而吸引昆虫传粉和动物采食,便于结种和传播;在植物代谢应激反应中... 花青苷是广泛存在于植物中的一类重要的类黄酮化合物,对植物生长、代谢、应激等方面具有重要作用。在植物生长发育过程中,花青苷使植物的花和果实呈现出丰富色彩的颜色,从而吸引昆虫传粉和动物采食,便于结种和传播;在植物代谢应激反应中,花青苷使植物具有抵御低温、干旱、真菌感染,防御紫外线伤害、虫害等能力。花青苷生物合成通路受相关结构基因和转录因子的调控机制已被解析得十分清楚,近几年研究发现,植物花青苷生物合成相关基因受到表观调控,从而影响花青素苷的合成。表观遗传学是目前生命科学领域研究的热点之一,本文结合最新的植物花青苷合成表观遗传学研究进展,综述了花青苷合成过程中的表观遗传修饰以及基因编辑技术在表观遗传学研究中的应用,以期利用表观遗传手段为花色育种改良提供新思路。 展开更多

关键词 花青苷 表观遗传修饰 crispr/dcas9

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基于R-loop靶向编辑技术的R-loop功能位点高通量筛选系统

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作者 皮一飞 宋新辉 +3 位作者 王淅琳 李谨谨 孙长斌 徐炜 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期181-190,共10页

【目的】开发哺乳动物细胞R-loop靶向编辑技术,探究其在肿瘤细胞耐药性研究中的应用。【方法】构建无酶切活性的Cas9与具有R-loop水解活性的RNase H1融合蛋白dCas9-RNaseH1表达载体,用于实现对R-loop的靶向编辑。在HeLa细胞中稳定表达... 【目的】开发哺乳动物细胞R-loop靶向编辑技术,探究其在肿瘤细胞耐药性研究中的应用。【方法】构建无酶切活性的Cas9与具有R-loop水解活性的RNase H1融合蛋白dCas9-RNaseH1表达载体,用于实现对R-loop的靶向编辑。在HeLa细胞中稳定表达该融合蛋白,建立R-loop靶向编辑细胞模型。转染覆盖全基因组转录起始区域的sgRNA文库,构建R-loop筛选细胞库,筛选影响紫杉醇和顺铂耐药性的R-loop功能位点。【结果】筛选获得744个影响HeLa细胞耐药性的R-loop功能位点,覆盖了细胞周期、凋亡、信号传导等关键生物通路。其中,26个位点使HeLa细胞对这两种药物产生耐药性,8个位点使其对这两种药物敏感,提示可能存在共享的生物通路。功能验证显示,部分R-loop功能位点通过调节相关基因(如ZBTB20、SPON2、ACTRT1等)的表达来影响HeLa细胞对抗肿瘤药物的敏感性。【结论】成功开发出适用于哺乳动物细胞的R-loop靶向编辑系统,并建立高通量筛选平台。 展开更多

关键词 高通量筛选 耐药性 R-loop 定点调控 crispr/dcas9

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