利用CRISPR/Cpf1系统构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的293T细胞株 被引量：2

1

作者 覃鸿妮 谢钰珍 +1 位作者 马傲 蔡一林 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第4期741-750,共10页

【目的】基于CRISPR/Cpf1(AsCpf1/LbCpf1)技术构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的人胚肾细胞(HEK293T)稳定细胞株,旨在研究ABCG1和ABCG4基因的生物学功能。【方法】针对ABCG1和ABCG4基因作用的功能域,设计2对靶向ABCG1和ABCG4基因前7个外显子... 【目的】基于CRISPR/Cpf1(AsCpf1/LbCpf1)技术构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的人胚肾细胞(HEK293T)稳定细胞株,旨在研究ABCG1和ABCG4基因的生物学功能。【方法】针对ABCG1和ABCG4基因作用的功能域,设计2对靶向ABCG1和ABCG4基因前7个外显子的sgRNA序列,分别克隆到AsCpf1和LbCpf1的载体上。将测序验证正确的重组质粒转染到HEK293T细胞中,T7E1酶切和测序验证敲除效率,对敲除成功的293T细胞利用有限稀释法筛选获得基因双突变的敲除细胞株,对其基因组进行PCR扩增并双向测序验证编辑结果,选择有正确编辑结果的PCR产物进行TA克隆,进而测序验证单克隆细胞株编辑效率。【结果】结果获得敲除ABCG1和ABCG4基因的稳定细胞株各1株(AsCpf1-ABCG1-sgRNA 1-1和LbCpf1-ABCG4-sgRNA 2-1)。【结论】通过利用新型基因编辑技术CRISPR/Cpf1系统,获得了永久性敲除目的细胞靶基因的细胞株,可为进一步探索和证实ABCG1和ABCG4在细胞中胆固醇代谢和调节作用提供帮助。 展开更多

关键词 crispr/cpf1 ABCG1 ABCG4 基因敲除 稳定细胞株

在线阅读 下载PDF 职称材料

马疱疹病毒1型的RPA-CRISPR/Cas12a快速检测方法的建立

2

作者 李银涛 撒瑞雪 +4 位作者 宋毅 张嗣玉 刘建华 冉多良 邓海峰 《动物医学进展》 北大核心 2025年第7期11-17,共7页

马疱疹病毒1型(EHV-1)可引起马属动物的马鼻肺炎,临床特征主要表现为孕马流产,还会引起新生马驹呼吸道感染甚至死亡,对马产业造成很大危害。以重组酶聚合酶扩增(RPA)、CRISPR/Cas12a反式酶切反应为基础,旨在建立EHV-1的RPA-CRISPR/Cas12... 马疱疹病毒1型(EHV-1)可引起马属动物的马鼻肺炎,临床特征主要表现为孕马流产,还会引起新生马驹呼吸道感染甚至死亡,对马产业造成很大危害。以重组酶聚合酶扩增(RPA)、CRISPR/Cas12a反式酶切反应为基础,旨在建立EHV-1的RPA-CRISPR/Cas12a快速检测方法。试验过程中通过对EHV-1-ORF68基因进行相似性与遗传进化分析,并根据其保守序列设计RPA引物与crRNA,建立EHV-1的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法并进行特异性试验、敏感性试验以及临床样本检测。结果表明,建立的EHV-1的RPA-CRISPR/Cas12a方法可以特异性地检出EHV-1,对其他马相关病原进行检测均为阴性;最低检测限度为1.92×10^(2) copies/μL,为传统PCR方法灵敏度(1.92×10^(4) copies/μL)的100倍;检测时间短,总时长约为35 min;应用建立的方法对24份临床阳性样本进行检测,结果阳性检出率为66.7%,高于传统PCR方法的29.2%。所建立的EHV-1 RPA-CRISPR/Cas12a检测方法具有良好的特异性与敏感性,结果准确,可以作为快速检测EHV-1的有效方法。 展开更多

关键词 马疱疹病毒1型 重组酶聚合酶扩增 crispr/Cas12a系统 快速检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

基于CRISPR/Cas9系统构建裸鼹鼠HIF-1α基因敲除质粒及其功能验证 被引量：1

3

作者 张静远 姜晓龙 崔淑芳 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期202-209,共8页

目的利用簇状规则间隔回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑系统构建质粒并敲除裸鼹鼠皮肤成纤维(NMR skin fibroblasts,NSF)细胞HIF-1α基因,为研究裸鼹鼠的耐低氧机制及缺氧相关疾病的发生发展机制提供体外细胞模型。方法针对裸鼹鼠HIF-... 目的利用簇状规则间隔回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑系统构建质粒并敲除裸鼹鼠皮肤成纤维(NMR skin fibroblasts,NSF)细胞HIF-1α基因,为研究裸鼹鼠的耐低氧机制及缺氧相关疾病的发生发展机制提供体外细胞模型。方法针对裸鼹鼠HIF-1α基因的1~4号外显子区域设计4对sgRNA序列,并成功构建表达质粒。筛选得到最优sgRNA后,转染HEK-293T细胞收集上清液测定病毒滴度。前期用pLenti-Cas9(blast)病毒感染NSF细胞,后用制备的HIF-1α-sgRNA病毒感染表达Cas9蛋白的NSF细胞。经药筛后观察荧光表达,同时提取细胞gDNA和蛋白。通过T7E1酶和Western Blot检测NSF细胞中HIF-1α基因变化及蛋白表达情况。结果Sanger测序显示,所设计的sgRNA成功插入到pX459和pKLV2-U6-sgRNA2载体上,序列验证正确,重组质粒构建成功;T7E1酶切实验成功切除3条带,sgRNA的打靶效率为54%,Western Blot结果表明,经药筛后的裸鼹鼠NSF细胞HIF-1α基因敲除成功,蛋白水平显著降低(P=0.0019);且未发现HIF-1α敲除细胞形态的明显变化,基因敲除对细胞增殖能力无明显影响。结论成功构建靶向裸鼹鼠HIF-1α基因的CRISPR/Cas9质粒,且质粒靶向敲除HIF-1α基因功能验证成功,将有利于裸鼹鼠耐低氧机制研究,并为人类缺氧相关疾病防治提供理论依据。 展开更多

关键词 裸鼹鼠 HIF-1Α 基因敲除 crispr/Cas9系统

在线阅读 下载PDF 职称材料

应用CRISPR/Cas9系统敲除PD-1基因对人T淋巴细胞增殖及分泌IFN-γ的影响 被引量：2

4

作者 龚福生 许扬梅 +2 位作者 刘施佳 黄丽洁 郑秋红 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期656-661,共6页

目的:探讨应用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除PD-1基因对人T细胞增殖及分泌IFN-γ的影响。方法:设计靶向PD-1基因的sgRNA序列,应用T7 RNA聚合酶体外分别合成PD-1-sgRNA和Cas9mRNA。利用核转染技术将PD-1-sgRNA和Cas9 mRNA混合物转入激活的... 目的:探讨应用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除PD-1基因对人T细胞增殖及分泌IFN-γ的影响。方法:设计靶向PD-1基因的sgRNA序列,应用T7 RNA聚合酶体外分别合成PD-1-sgRNA和Cas9mRNA。利用核转染技术将PD-1-sgRNA和Cas9 mRNA混合物转入激活的人T淋巴细胞,测序确认基因敲除的效率。应用流式细胞术分析基因敲除后T淋巴细胞表型和PD-1的表达情况,锥虫蓝活细胞计数法检测T细胞增殖活力,ELISA检测T细胞分泌IFN-γ情况。结果:体外成功合成PD-1-sgRNA和Cas9 mRNA。将PD-1-sgRNA和Cas9 m RNA核转染T淋巴细胞,测序证实PD-1基因序列编辑效率为58.3%。CRISPR/Cas9系统成功下调T淋巴细胞表面PD-1分子的表达水平[(9.6±1.85)%vs(16.2±2.05)%,P<0.05],PD-1基因敲除不影响T细胞的增殖活力和细胞表型(P>0.05);但PD-1-sgRNA组的效应T细胞分泌IFN-γ水平显著升高(P<0.01)。结论:CRISPR/Cas9基因编辑系统成功敲除人T淋巴细胞PD-1基因,降低PD-1分子表达可阻断PD-1/PD-L1负性调控从而增强T细胞的免疫活性,且促进效应T细胞分泌IFN-γ。 展开更多

关键词 crispr/Cas9系统 T淋巴细胞 核转染 PD-1 基因敲除 IFN-Γ

在线阅读 下载PDF 职称材料

CRISPR/Cas9系统介导的猪MRC1修饰基因降低PCV2复制的研究 被引量：1

5

作者 费晓钰 石超群 +2 位作者 刘雪明 苏峰 姜运良 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期934-946,共13页

旨在获得MRC1基因修饰的PCV2靶细胞并在体外验证该细胞对PCV2的抑制作用,为后续基因编辑猪的生产提供理论基础。本研究:1)首先利用基因工程技术建立了慢病毒介导的高效同源重组载体和CRISPR/Cas9基因靶向系统;2)通过细胞和分子生物学技... 旨在获得MRC1基因修饰的PCV2靶细胞并在体外验证该细胞对PCV2的抑制作用,为后续基因编辑猪的生产提供理论基础。本研究:1)首先利用基因工程技术建立了慢病毒介导的高效同源重组载体和CRISPR/Cas9基因靶向系统;2)通过细胞和分子生物学技术筛选了定点整合表达MRC1的PK15细胞系;3)随后通过细胞试验和PCV2的攻毒试验对其抗PCV2的作用进行了相关验证。结果:1)成功构建了含有红色荧光标记基因、嘌呤霉素标记基因、同向LoxP序列和多克隆位点的pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP载体,同时根据不同猪品种间MRC1基因启动子差异序列设计同源臂,成功构建同源重组载体和靶向同源臂的CRISPR/Cas9基因靶向载体;2)通过病毒包装和共转染的方法,利用嘌呤霉素筛选并验证了MRC1启动子基因编辑的PK15细胞株,成功将MRC1基因转录起始位点上游多出的14 bp敲入到PK15细胞中;3)随后对基因编辑的PK15细胞系进行抗病毒验证,MRC1基因编辑的PK15细胞株MRC1的蛋白表达量显著增高(P<0.05),同时显著降低了PCV2的复制(P<0.05)。MRC1启动子编辑的PK15细胞中MRC1蛋白表达量显著增高,该位点可以用于抗PCV2猪的制备。 展开更多

关键词 猪 crispr/Cas9 Cre-LoxP系统 PCV2 MRC1

在线阅读 下载PDF 职称材料

利用CRISPR/Cas9系统建立内生链霉菌SAT1的基因簇敲除体系

6

作者 田文佳 窦桂铭 +2 位作者 王莎 孙靖雅 马玉超 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1-8,共8页

hyBl(hygB-like)基因簇是内生链霉菌SAT1 中的次级代谢基因簇,经分析它与潮霉素B 基因簇具有52%的相似性,可能在SAT1 抑制栗疫菌(Cryphonectria parasitica)的过程中发挥主要作用。为了深入研究该菌的抑菌机制和hyBl 基因簇的功能,以hy... hyBl(hygB-like)基因簇是内生链霉菌SAT1 中的次级代谢基因簇,经分析它与潮霉素B 基因簇具有52%的相似性,可能在SAT1 抑制栗疫菌(Cryphonectria parasitica)的过程中发挥主要作用。为了深入研究该菌的抑菌机制和hyBl 基因簇的功能,以hyBl 为目标,利用CRISPR/Cas9 技术建立SAT1 的基因簇敲除体系。在实验过程中,通过protospacer 的筛选、敲除载体的构建、接合转移供体菌、Ca2+和Mg2+的选择以及接合时间等多个条件的探索,建立了SAT1 的基因簇敲除体系。最终以E. coli ET12567(pUZ8002/pCRISPomyces2-CB)为供体菌,在MS 培养基(含10 mmol Mg2+)上接合16-18 h,成功获得突变株SAT1△ hyBl(缺失14 kb 的hyBl 基因簇)。突变株对栗疫菌的抑制带宽较野生株降低了77%,这说明该基因簇指导合成的次级代谢产物在抑制栗疫菌方面具有重要的功能。本研究证明了利用CRISPR/Cas9 系统可以对内生链霉菌SAT1 进行基因簇编辑,也为深入研究该菌的抑菌机制、基因工程法验证未知基因簇功能提供了良好的技术支撑。 展开更多

关键词 crispr/Cas9 系统 pCRISPomyces-2 内生链霉菌SAT1 接合 基因簇敲除

在线阅读 下载PDF 职称材料

利用CRISPR/Cas9系统构建人源结肠癌SAMHD1基因敲除细胞株及其功能的初步研究 被引量：2

7

作者 张洲 操孙润 +2 位作者 武晋英 马孟涛 宋晓宇 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期193-197,共5页

目的通过常间回文重复序列丛集(CRISPR)/常间回文重复序列丛集关联蛋白9(Cas9)系统敲除技术靶向敲除人源结肠癌HCT116细胞中的SAMHD1基因,并初步研究敲除该基因后HCT116细胞增殖能力的变化。方法利用单向导RNA(sgRNA)在线设计工具,针对S... 目的通过常间回文重复序列丛集(CRISPR)/常间回文重复序列丛集关联蛋白9(Cas9)系统敲除技术靶向敲除人源结肠癌HCT116细胞中的SAMHD1基因,并初步研究敲除该基因后HCT116细胞增殖能力的变化。方法利用单向导RNA(sgRNA)在线设计工具,针对SAMHD1设计sgRNA;利用pYSY-CMV-Cas9-EF1α-Puromycin质粒载体,构建pYSY-CMV-Cas9-EF1α-PuromycinsgRNA-SAMHD1;转染HCT116细胞株,以嘌呤霉素进行筛选鉴定后,采用蛋白质印迹法检测HCT116细胞中SAMHD1蛋白表达水平;采用蛋白质印迹法检测靶向敲除SAMHD1基因后HCT116细胞株DNA损伤修复能力的变化;通过光学显微镜和CCK-8法比较Cas9-vector组(HCT116细胞中转染pYSY-CMV-Cas9-EF1α-Puromycin载体质粒,对照组)和Cas9-SAMHD1组(转染pYSY-CMVCas9-EF1α-Puromycin-sgRNA-SAMHD1靶向敲除SAMHD1质粒,实验组)的细胞数量和增殖能力水平。结果通过酶切载体、退火产物结果和重组质粒的测序结果,验证重组质粒构建成功;蛋白质印迹法检测结果验证明利用CRISPR/Cas9系统技术靶向敲除SAMHD1的HCT116细胞株无SAMHD1蛋白表达,即Cas9-SAMHD1细胞株构建成功;蛋白质印迹法结果显示,Cas9-SAMHD1组与Cas9-vector组相比,在DNA损伤诱导剂阿霉素刺激作用下DNA损伤指标γH2AX降低;光学显微镜和CCK-8结果显示,Cas9-SAMHD1组与Cas9-vector组相比,细胞增殖能力显著增强(P<0.01)。结论采用CRISPR/Cas9系统成功敲除人源结肠癌细胞SAMHD1基因后,结肠癌细胞的增殖能力和DNA损伤修复能力显著增强。 展开更多

关键词 crispr/Cas9系统 结肠癌 HCT116 SAMHD1 细胞增殖

在线阅读 下载PDF 职称材料

苹果愈伤组织CRISPR/LbCpf1基因编辑体系的建立

8

作者 刘杨 张春玲 +2 位作者 肖旭 由春香 王小非 《落叶果树》 2022年第6期10-16,共7页

为在苹果愈伤组织中建立CRISPR/Cpf1基因编辑体系,构建双靶点CRISPR/LbCpf1载体,靶向正调控花青苷积累的苹果MdMYB1转录因子基因。转化王林愈伤组织,通过测序以及花青苷积累实验验证敲除效率。结果表明,CRISPR/LbCpf1在苹果愈伤组织中... 为在苹果愈伤组织中建立CRISPR/Cpf1基因编辑体系,构建双靶点CRISPR/LbCpf1载体,靶向正调控花青苷积累的苹果MdMYB1转录因子基因。转化王林愈伤组织,通过测序以及花青苷积累实验验证敲除效率。结果表明,CRISPR/LbCpf1在苹果愈伤组织中可实现44.4%的总突变率,其中靶点1突变率为22.2%,靶点2为33.3%。CRISPR/LbCpf1易造成2个碱基对(bp)以及7~9 bp的小片段删除,占比68.8%,在距PAM序列远端14~22 bp位置发生突变概率较高,符合典型CRISPR/LbCpf1体系的特点。相对于野生型,成功基因编辑的愈伤组织株系花青苷积累明显减少,综上说明CRISPR/LbCpf1体系可在苹果愈伤组织中实现较高效的基因编辑。 展开更多

关键词 苹果 愈伤组织 基因编辑 crispr/cpf1

在线阅读 下载PDF 职称材料

CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1基因组编辑技术在农作物基因功能中的研究进展 被引量：1

9

作者 聂利珍 房永雨 《北方农业学报》 2019年第4期27-32,共6页

基因组编辑技术是研究植物基因功能和农作物品种改良的强有力工具。文章对CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1两种基因组编辑技术的作用机理、区别及其在模式植物和农作物研究中取得的进展进行了综述,进一步揭示了基因组编辑技术在农作物分子育... 基因组编辑技术是研究植物基因功能和农作物品种改良的强有力工具。文章对CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1两种基因组编辑技术的作用机理、区别及其在模式植物和农作物研究中取得的进展进行了综述,进一步揭示了基因组编辑技术在农作物分子育种中的应用前景,以期为基因组编辑技术在农作物育种中的应用提供理论依据。 展开更多

关键词 crispr/Cas9 crispr/cpf1 农作物

在线阅读 下载PDF 职称材料

利用CRISPR/Cas9系统构建可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系

10

作者 乔延召 刘凯 +3 位作者 李清华 黄建豪 卫恒习 张守全 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期1-8,共8页

【目的】将Tet-on系统与CRISPR/Cas9系统相结合建立诱导敲除猪Sohlh1基因的细胞系。【方法】分离培养猪胎儿成纤维细胞(PFF),进行慢病毒载体PCW-eSpCas9(1.1)侵染并通过1μg/mL嘌呤霉素筛选及强力霉素(Dox)诱导;改造pLV-sgRNA载体,进行2... 【目的】将Tet-on系统与CRISPR/Cas9系统相结合建立诱导敲除猪Sohlh1基因的细胞系。【方法】分离培养猪胎儿成纤维细胞(PFF),进行慢病毒载体PCW-eSpCas9(1.1)侵染并通过1μg/mL嘌呤霉素筛选及强力霉素(Dox)诱导;改造pLV-sgRNA载体,进行293FT细胞转染验证;构建含Sohlh1基因目标靶点的pLV-sgRNA-2AGFP特异性载体,进行慢病毒包装检测;利用包装病毒侵染稳转PCW-eSpCas9(1.1)的PFF细胞,3μg/mL灭稻瘟菌素进行筛选,随后添加Dox诱导进行表达分析和敲除效率检测。【结果】建立了受Dox调控可诱导eSpCas9(1.1)蛋白表达的PFF细胞系,不添加Dox,eSpCas9(1.1)蛋白不表达;293FT细胞表达绿色荧光,表明pLV-sgRNA-2A-GFP载体改造成功。3、4、6号Sohlh1基因靶点具有敲除活性,利用最优的2个靶点构建了pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体,荧光表达显示载体慢病毒包装成功。构建稳转PCW-eSpCas9(1.1)和pLVsgRNA-2A-GFP的PFF,经Dox诱导72 h后,Sohlh1基因的敲除效率为85%。【结论】利用Tet-on系统和CRISPR/Cas9系统成功构建了可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系,为研究Sohlh1基因的功能以及制备条件性敲除Sohlh1基因去除生殖细胞的模型猪奠定了基础。 展开更多

关键词 猪 Tet-on系统 crispr/Cas9系统 Sohlh1 基因敲除

在线阅读 下载PDF 职称材料

利用RGR核酶结构拓展家蚕CRISPR基因组编辑系统的应用研究

11

作者 张启超 宋红生 +5 位作者 曾保胜 陈树清 许军 李芝倩 张忠杰 陈旭 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期226-232,共7页

针对目前家蚕基因组编辑平台在基因组特定位点的靶点选择、多靶点同时编辑等方面的技术瓶颈,利用家蚕卵巢培养细胞系（Bm N）验证含有双核酶结构的RGR（Ribozyme-gRNA-Ribozyme）在CRISPR/Cas9基因组编辑系统中的应用效果,用以拓展现有C... 针对目前家蚕基因组编辑平台在基因组特定位点的靶点选择、多靶点同时编辑等方面的技术瓶颈,利用家蚕卵巢培养细胞系（Bm N）验证含有双核酶结构的RGR（Ribozyme-gRNA-Ribozyme）在CRISPR/Cas9基因组编辑系统中的应用效果,用以拓展现有CRISPR/Cas9系统的靶点范围。研究结果显示,采用Cas9系统和Cpf1系统,RGR结构在Bm N细胞中具有良好的定点编辑效果,可成功实现对内源、外源靶基因序列的剪切,且对内外源基因具有高效编辑作用,表明RGR结构可应用于家蚕CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1基因组编辑系统。利用RGR结构的自剪切功能不仅可以拓展家蚕基因组靶基因的范围,还为进一步实现多靶点编辑打下了基础。 展开更多

关键词 crispr/Cas9系统 crispr/cpf1系统 RGR核酶结构 家蚕基因组编辑 家蚕卵巢培养细胞

在线阅读 下载PDF 职称材料

慢病毒载体介导稳定表达Cpf1的细胞系的构建及其基因编辑效率验证

12

作者 覃鸿妮 谢钰珍 +3 位作者 陈罡 密苗苗 彭赛男 张勇 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第2期246-251,共6页

【目的】通过慢病毒转染细胞构建稳定表达CRISPR/Cpf1的293 T和HT 1080细胞系,实现高效率基因编辑。【方法】PCR扩增AsCpf1和LbCpf1基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、... 【目的】通过慢病毒转染细胞构建稳定表达CRISPR/Cpf1的293 T和HT 1080细胞系,实现高效率基因编辑。【方法】PCR扩增AsCpf1和LbCpf1基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共转染293FT细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达LbCpf1和AsCpf1的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。用设计好的针对ABCG1基因的sgRNA转染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。【结果】成功构建了Cpf1-pLent慢病毒载体,重组载体对293 FT细胞进行慢病毒包装、浓缩与纯化后,病毒滴度均在10~6 TU/mL之上。用纯化后的病毒感染293 T和HT 1080细胞,筛选出3株能稳定表Cpf1的细胞系,目的ABCG1基因的基因编辑功能验证表明其中2株T7EΙ酶切掉带明显,sgRNA靶向敲除效率较高,命名为AsCpf1-293 T-7D和AsCpf1-HT108002-3B。【结论】建立了稳定表达Cpf1的293T和HT 1080细胞细胞系,可以用于目的基因的高效敲除。 展开更多

关键词 crispr/cpf1 慢病毒载体 细胞系 基因编辑

在线阅读 下载PDF 职称材料

利用CRISPR/Cas9系统编辑银腺杨84K LAZY基因

13

作者 杨海峰 甘晓雪 +5 位作者 薄高峰 王佳琪 郝璞 张富满 王文功 韩傲霜 《江苏农业科学》 北大核心 2022年第18期258-262,273,共6页

LAZY1基因隶属于IGT基因家族,与植物分枝角度调控相关。为敲除84K杨中的LAZY1基因,获得转基因株系开展功能研究,以银腺杨84K为材料,克隆84K杨LAZY1基因的3个同源基因,设计基因编辑靶点,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,运用农杆菌介导法转... LAZY1基因隶属于IGT基因家族,与植物分枝角度调控相关。为敲除84K杨中的LAZY1基因,获得转基因株系开展功能研究,以银腺杨84K为材料,克隆84K杨LAZY1基因的3个同源基因,设计基因编辑靶点,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,运用农杆菌介导法转化84K杨并成功获得13个基因编辑株系,经测序分析发现,有3个转基因株系的靶标位点发生碱基缺失或插入,表明这3个株系基因编辑成功,编辑效率为23.07%。本研究结果丰富了IGT基因家族的功能研究,为IGT基因家族的分子育种应用和研究奠定了基础,为CRISPR/Cas9系统在银腺杨84K中的应用做出了初步探索。 展开更多

关键词 LAZY1基因 银腺杨84K crispr/Cas9系统 载体构建 效率检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除奶山羊胎儿成纤维细胞SCD1基因 被引量：4

14

作者 刘雷雷 贾启鹏 +4 位作者 李宗帅 杨洋 李海江 赵兴绪 张勇 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期30-38,共9页

【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除奶山羊胎儿成纤维细胞(GFFs)中硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)基因,旨在为奶山羊敲入外源性基因奠定理论基础以及构建动物模型提供生物材料.【方法】根据“20N+NGG”原则在SCD1第4外显子和第6外显... 【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除奶山羊胎儿成纤维细胞(GFFs)中硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)基因,旨在为奶山羊敲入外源性基因奠定理论基础以及构建动物模型提供生物材料.【方法】根据“20N+NGG”原则在SCD1第4外显子和第6外显子分别设计6个靶向SCD1基因sgRNA(F1、F2、F3、S1、S2、S3),构建PX330-eGFP-sgRNA敲除载体,通过脂质体转染到GFFs中,PCR扩增阳性细胞SCD1外显子4和外显子6的核苷酸序列,连接到pEASY-Blunt载体上,测序评估不同sgRNA的敲除效率;分别在第4外显子和第6外显子选择敲除效率高的sgRNA共同转染GFFs,经流式分选获得敲除SCD1基因的GFFs.【结果】设计的6个sgRNA均能够连入PX330-eGFP载体中,单克隆菌测序试验表明sgRNA F2、sgRNA F3、sgRNA S1和sgRNA S2具有敲除作用,其敲除效率分别为41.67%、30.77%、6.67%和28.57%;实时荧光定量PCR检测结果表明sgRNA-F2-S2与sgRNA-F3-S2转染组均能显著降低阳性细胞中SCD1的mRNA水平(P<0.05);Western Blot检测结果表明在阳性细胞中均未表达SCD1蛋白.【结论】获得两株敲除SCD1基因的GFFs,为制备敲除SCD1基因奶山羊核供体提供了生物材料. 展开更多

关键词 crispr/Cas9系统 奶山羊胎儿成纤维细胞 敲除 硬脂酰辅酶A去饱和酶1

在线阅读 下载PDF 职称材料

CRISPR/Cas9慢病毒系统敲除胰岛β细胞PKA C-α的研究

15

作者 何士俊 万毅虹 +4 位作者 章嘉雯 蔡秀潮 刘静文 刘叔文 姚新刚 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期102-109,共8页

利用CRISPR/cas9系统建立稳定敲除PKA C-α基因的INS-1细胞株,研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能。设计2个长25 bp且分别靶向PKA C-α基因的exon 5和exon 7的sgRNA,将其克隆至LentiCRISPRv2-sgRNA质粒并转染至293T细胞中制备sgRNA-Cas9... 利用CRISPR/cas9系统建立稳定敲除PKA C-α基因的INS-1细胞株,研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能。设计2个长25 bp且分别靶向PKA C-α基因的exon 5和exon 7的sgRNA,将其克隆至LentiCRISPRv2-sgRNA质粒并转染至293T细胞中制备sgRNA-Cas9慢病毒,慢病毒感染INS-1细胞,嘌呤霉素筛选出阳性细胞并采用有限稀释法筛选单克隆细胞,Western blotting印记法检测单克隆细胞中PKA C-α蛋白的表达水平,测序确认单克隆细胞中PKA C-α基因的突变位点。WB实验证实靶向Exon 5的sgRNA可成功敲除PKA C-α基因,得到稳定敲除PKA C-α基因的细胞株,测序结果表明该细胞株的PKA C-α基因发生1 bp碱基插入突变,并且敲除PKA C-α基因的INS-1细胞胰岛素分泌能力下降。本实验利用CRISPR/Cas9系统成功敲除INS-1细胞中的PKA C-α基因,为研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 crispr/cas9系统 PKA C-α INS-1细胞 稳定细胞株

在线阅读 下载PDF 职称材料

INRA717-1B4杂交杨TAC基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建及编辑效率检测

16

作者 郝璞 薄高峰 +4 位作者 刘璐 白鹤鸣 吴凤霞 周星雨 杨海峰 《山东农业科学》 北大核心 2021年第11期1-7,共7页

TAC(tiller angle control)基因作为IGT [G?L(A/T)IGT]保守家族的一员,与植物体内各类激素相互作用,共同参与分枝角度的调控。为探究TAC基因的分子结构功能及其调节功能,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,以INRA717-1B4杂交杨为试验材料构建... TAC(tiller angle control)基因作为IGT [G?L(A/T)IGT]保守家族的一员,与植物体内各类激素相互作用,共同参与分枝角度的调控。为探究TAC基因的分子结构功能及其调节功能,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,以INRA717-1B4杂交杨为试验材料构建pDE-CAS9-NPTⅡ表达载体,通过农杆菌介导法侵染叶片进行遗传转化获得阳性植株,并通过测序检测基因编辑效率。最终获得基因编辑转基因株系12株,其中实现基因突变的2株,编辑效率为16.7%。本试验为CRISPR/Cas9系统在杨树TAC基因功能的验证提供了借鉴,为进一步在木本植物中的应用研究提供了技术支持。 展开更多

关键词 INRA717-1B4杂交杨 crispr/Cas9系统 TAC基因 载体构建 编辑效率

在线阅读 下载PDF 职称材料

T细胞条件性敲除Spi1基因小鼠的繁育及鉴定 被引量：1

17

作者 王卉卉 朱向玲 +5 位作者 吴旭铭 张慧茹 周园园 王安琪 刘崇 涂佳杰 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2024年第4期595-599,共5页

目的繁育T细胞条件性敲除Spi1基因的小鼠并对其进行鉴定,为进一步探索Spi1编码蛋白PU.1的作用提供研究基础。方法将Lck-Cre小鼠与Spi1^(flox/flox)小鼠进行杂交繁育,通过聚合酶链式反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型,筛选出基因... 目的繁育T细胞条件性敲除Spi1基因的小鼠并对其进行鉴定,为进一步探索Spi1编码蛋白PU.1的作用提供研究基础。方法将Lck-Cre小鼠与Spi1^(flox/flox)小鼠进行杂交繁育,通过聚合酶链式反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型,筛选出基因型为Lck-Cre×Spi1^(flox/flox)的小鼠即为T细胞条件性敲除Spi1基因的纯合子小鼠。使用磁珠分选脾脏T淋巴细胞,并应用Western blot、实时荧光定量PCR(qPCR)及流式细胞术检测PU.1在T细胞中的敲除效率。结果Lck-Cre×Spi1^(flox/flox)小鼠基因稳定遗传。与Spi1^(flox/flox)小鼠相比,Lck-Cre×Spi1^(flox/flox)小鼠脾脏T细胞中的PU.1表达水平显著降低。结论该研究应用Cre/LoxP系统和CRISPR/Cas9技术成功构建了T细胞条件性敲除Spi1基因小鼠,为后续研究PU.1在T细胞相关疾病中的具体作用提供了可靠的动物模型。 展开更多

关键词 Spi1 CRE/LOXP系统 crispr/Cas9技术 T细胞 PU.1 条件性敲除

在线阅读 下载PDF 职称材料

CRISPR/Cas基因编辑技术在草类植物中的研究进展 被引量：4

18

作者 丛丽丽 旦真措 +6 位作者 张文玉 徐明 王孜成 张立霞 柴茂峰 王爱华 杨国锋 《中国草地学报》 CSCD 北大核心 2022年第9期107-120,共14页

CRISPR/Cas介导的基因编辑技术是一种可以在生物体内对DNA序列进行定点编辑的新技术,具有简单、高效、特异性高等特点,广泛应用于植物基因功能研究和新品种培育。对CRISPR/Cas基因编辑系统的发展、工作原理、优势以及其在草类植物中的... CRISPR/Cas介导的基因编辑技术是一种可以在生物体内对DNA序列进行定点编辑的新技术,具有简单、高效、特异性高等特点,广泛应用于植物基因功能研究和新品种培育。对CRISPR/Cas基因编辑系统的发展、工作原理、优势以及其在草类植物中的应用现状、前景及存在问题进行系统综述,以期为草类植物基因功能研究和新品种培育领域的研究工作者提供参考。 展开更多

关键词 crispr/Cas9 crispr/cpf1 单碱基编辑 引导编辑 草类植物

在线阅读 下载PDF 职称材料

CRISPR基因编辑技术研究进展及其在水生生物中的应用 被引量：3

19

作者 马杭柯 孙金秋 +2 位作者 徐莞媛 阎斌伦 高焕 《海洋渔业》 CSCD 北大核心 2018年第5期632-640,共9页

CRISPR基因编辑技术主要包括CRISPR/Cas9技术和CRISPR/Cpf1技术,与以往的基因编辑技术相比,具有高效、简便、低廉等优点,因此在过去短短的几年里,该基因编辑技术被大量应用于拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、小鼠(Mu... CRISPR基因编辑技术主要包括CRISPR/Cas9技术和CRISPR/Cpf1技术,与以往的基因编辑技术相比,具有高效、简便、低廉等优点,因此在过去短短的几年里,该基因编辑技术被大量应用于拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、小鼠(Mus musculus)、猪(Sus scrofa)等陆生生物基因编辑相关研究中。目前,该技术在水生生物中也得到了应用,如在模式生物与疾病模型的构建、基因功能解析与筛选、水生生物新品种选育、疾病控制及海洋药物研发等方面。在阐述CRISPR基因编辑技术相关结构、作用机制和与其它基因编辑技术比较的基础上,对其在水生生物多个方面的应用情况进行了综述,旨在为从事相关研究的科研工作者们提供帮助。 展开更多

关键词 基因编辑技术 crispr/Cas9 crispr/cpf1 水生生物 研究进展

在线阅读 下载PDF 职称材料

TLR4^-/- DF1细胞系感染NDV后免疫机制的初步研究 被引量：1

20

作者 王辉 鲁国涛 +6 位作者 许曼 曾为俊 邵玉乐 赵丽丽 陈洪岩 刘建华 孟庆文 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期1244-1250,共7页

为初步探究鸡TLR4在抗病毒感染天然免疫中发挥的作用,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术针对鸡TLR4基因的功能域,设计、构建了CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染鸡DF1细胞;经流式细胞仪分选、测序及western blot鉴定筛选得到TLR4^-/- DF... 为初步探究鸡TLR4在抗病毒感染天然免疫中发挥的作用,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术针对鸡TLR4基因的功能域,设计、构建了CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染鸡DF1细胞;经流式细胞仪分选、测序及western blot鉴定筛选得到TLR4^-/- DF1细胞系;利用新城疫病毒(NDV)感染TLR4^-/- DF1细胞系,采用绝对荧光定量PCR检测NDV拷贝数,相对荧光定量PCR检测TLR4下游接头蛋白、细胞因子及干扰素基因的转录水平。结果显示:与野生型DF1细胞相比,NDV感染6 h、16 h和36 h的TLR4^-/- DF1细胞中病毒基因拷贝数显著升高(p<0.05),16 h升高了2.95倍,感染6 h、16 h和24 h下游接头蛋白MyD88基因转录水平下降,感染16 h促炎因子IL-1β下降了48.5%(p<0.01),IL-8下降了62.5%(p<0.01),I型干扰素转录水平下降。以上结果表明:NDV感染诱导的天然免疫应答可能是通过MyD88途径诱导高水平促炎性因子和I型干扰素(IFN-α、IFN-β)的表达,从而抑制NDV的增殖,TLR4在NDV感染引起的天然免疫应答和疾病防控研究中具有重要意义。同时,本研究TLR4^-/- DF1细胞系的建立可用于病毒引起的炎性因子风暴及天然免疫抗病毒作用的探究。 展开更多

关键词 TLR4 crispr/Cas9系统 DF1 基因敲除 NDV

在线阅读 下载PDF 职称材料