旨在利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术制备CD13基因敲除的IPEC-J2(猪空肠上皮细胞系)细胞,揭示细胞表面分化抗原13(cluster of differentiation 13,CD13)在肠道病原微生物感染肠道细胞中所起的作用。本研究在猪CD13基因第2外显子区域设计...旨在利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术制备CD13基因敲除的IPEC-J2(猪空肠上皮细胞系)细胞,揭示细胞表面分化抗原13(cluster of differentiation 13,CD13)在肠道病原微生物感染肠道细胞中所起的作用。本研究在猪CD13基因第2外显子区域设计2个向导RNA(guide RNA,gRNA),命名为g3、g5,然后分别将g3和g5克隆到pX330-GFP和pX330-RFP载体骨架上,电转染IPEC-J2细胞,48 h后通过流式细胞术分选具有双荧光标记的细胞,培养并获得单克隆细胞,PCR扩增、测序,从而获得CD13基因纯合敲除的阳性细胞系。对获得的20个细胞单克隆进行PCR,并挑取部分克隆PCR产物测序,发现共有7个克隆发生了基因片段缺失,其中1个克隆为单等位基因片段缺失,3个克隆为双等位基因杂合片段缺失,3个克隆为双等位基因纯合片段敲除。本研究检测双等位基因纯合片段敲除细胞的蛋白表达水平,其结果显示,在该纯合敲除细胞中CD13蛋白几乎不表达,表明成功构建了CD13敲除的IPEC-J2细胞系。本研究获得的CD13基因敲除细胞系为探究CD13在猪肠道病原微生物感染肠道细胞中所起的作用奠定了基础。展开更多
CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,规律成簇的间隔短回文重复)平台是出色的基因组编辑工具,其中新型核酸酶Cas13a(CRISPR-associated protein 13a)既可编辑DNA,也可编辑RNA,这一新平台可实现DNA或RNA...CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,规律成簇的间隔短回文重复)平台是出色的基因组编辑工具,其中新型核酸酶Cas13a(CRISPR-associated protein 13a)既可编辑DNA,也可编辑RNA,这一新平台可实现DNA或RNA的摩尔灵敏度以及单碱基错配的特异性检测,同时拓展用于病毒与细菌的精细检测(甚至是寨卡与登革热的近亲病毒株)、癌症早期监测和遗传性疾病等治疗;其需要设计少,技术操作简单,具有广泛的应用潜力,是基因组编辑的又一项卓越成果。综述了Cas13a系统的最新进展。展开更多
文摘CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,规律成簇的间隔短回文重复)平台是出色的基因组编辑工具,其中新型核酸酶Cas13a(CRISPR-associated protein 13a)既可编辑DNA,也可编辑RNA,这一新平台可实现DNA或RNA的摩尔灵敏度以及单碱基错配的特异性检测,同时拓展用于病毒与细菌的精细检测(甚至是寨卡与登革热的近亲病毒株)、癌症早期监测和遗传性疾病等治疗;其需要设计少,技术操作简单,具有广泛的应用潜力,是基因组编辑的又一项卓越成果。综述了Cas13a系统的最新进展。
