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基于CRISPR-Cas系统的多重耐药菌防治技术研究进展 被引量：1
1
作者 周倩 唐梦君 +4 位作者 张小燕 陆俊贤 唐修君 杨星星 高玉时 《生物技术通报》 北大核心 2025年第5期42-51,共10页
动物源细菌耐药性影响动物养殖安全,同时对人类公共卫生和食品安全产生重要威胁。抗生素的滥用加剧了耐药细菌的传播,而新型抗菌药物研发日益困难,动物源细菌耐药污染已成为全球范围内的公共危机,一旦耐药菌从动物向人类扩散,将极大地... 动物源细菌耐药性影响动物养殖安全,同时对人类公共卫生和食品安全产生重要威胁。抗生素的滥用加剧了耐药细菌的传播,而新型抗菌药物研发日益困难,动物源细菌耐药污染已成为全球范围内的公共危机,一旦耐药菌从动物向人类扩散,将极大地威胁人类健康,亟须新的方法和策略应对细菌耐药。CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR-associated)是第三代“基因组定点编辑技术”,该技术能够靶向剪切外源性核酸,保护微生物遗传物质遗传稳定性。与传统的多重耐药菌防治策略相比,CRISPR-Cas系统具备独特的DNA序列的靶向性和灵敏度,通过精准、简便和高效的基因编辑技术,与核酸扩增技术、比色技术等相结合,可以提高灵敏度和检测时效性等性能指标。本文介绍了CRISPR-Cas系统的由来、系统分类、基因编辑的作用机理,在此基础之上,聚焦于该系统在多重耐药菌防治领域的研究进展和应用,在耐药致病菌消除、耐药基因消除以及致病菌诊断检测方面给出案例分析以及目前存在的挑战。总的来说,基于CRISPR-Cas系统的序列特异性抗菌剂能够降低细菌多重耐药性,结合核酸扩增技术和实时监控设备提升检测的精准性和效率,为动物源细菌耐药防控和监测研究提供了新思路。 展开更多
关键词 crispr-Cas系统 基因编辑 多重耐药菌 耐药基因 防治技术
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CRISPR系统转化医学研究进展 被引量：4
2
作者 叶洲杰 王心睿 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期188-197,共10页
CRISPR系统作为在现今科学研究中对基因编辑运用广泛的一项技术,在后基因组学时代对于基因功能研究、疾病发生发展机制以及基因靶向药物等研究具有重要意义。目前人们运用CRISPR/Cas9编辑技术成功构建细胞和模式生物模型用于临床医学研... CRISPR系统作为在现今科学研究中对基因编辑运用广泛的一项技术,在后基因组学时代对于基因功能研究、疾病发生发展机制以及基因靶向药物等研究具有重要意义。目前人们运用CRISPR/Cas9编辑技术成功构建细胞和模式生物模型用于临床医学研究。CRISPR/Cas9作为一类强大的基因编辑技术不单只运用于基因功能缺失或外源基因敲入等研究中,CRISPR基因敲除文库筛选系统、CRISPR/dCas9基因激活系统、CRISPR干扰技术和CRISPR分子诊断技术等CRISPR转化医学研究将CRISPR应用于基因高通量筛选、基因沉默导致疾病发生、跨表观遗传修饰激活基因表达、可逆性干扰靶标基因表达以及运用CRISPR分子诊断检测病原微生物感染性疾病等临床研究中,推动生命科学和临床医学等多学科的发展。针对CRISPR系统在转化医学中的研究应用进行阐述。 展开更多
关键词 crispr/Cas9 crispr诊断 crispr基因敲除文库 crispr激活系统 crispr干扰
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应用CRISPR/Cas9技术对五指山猪GHRHR基因的编辑
3
作者 王文涛 张思佳 +9 位作者 何鑫淼 陈诗怡 吴赛辉 张冬杰 陈瑶生 丛佩清 亓美玉 田明 刘娣 何祖勇 《东北农业大学学报》 北大核心 2025年第2期44-52,共9页
生长激素释放激素受体(GHRHR)表达于垂体细胞表面,调节垂体生长激素合成与分泌,对动物生长发育发挥重要调控作用。为深入了解GHRHR对五指山猪生长发育的影响,通过CRISPR-ctRNP体外酶切试验,筛选出切割效率达27.3%的1条gRNA用于构建CRISP... 生长激素释放激素受体(GHRHR)表达于垂体细胞表面,调节垂体生长激素合成与分泌,对动物生长发育发挥重要调控作用。为深入了解GHRHR对五指山猪生长发育的影响,通过CRISPR-ctRNP体外酶切试验,筛选出切割效率达27.3%的1条gRNA用于构建CRISPR/Cas9表达载体。转染五指山猪肾细胞后,经流式分选富集到编辑效率高达100%的细胞群体作为供体细胞,进行体细胞核移植;再将250枚克隆胚胎转移至5头代孕母猪输卵管中,最终1头代孕母猪成功妊娠,分娩3头克隆仔猪均为GHRHR双等位基因编辑个体;编辑均导致GHRHR基因产生移码突变,可导致蛋白翻译提前终止,丧失生物学功能。最终仅有1头GHRHR编辑五指山猪存活,该个体60日龄时,体质量较野生型个体平均体质量下降23.4%。研究结果在五指山猪中实现GHRHR基因高效编辑,为培养微型宠物猪及解析GHRHR的调控功能提供理论依据。 展开更多
关键词 五指山猪 生长激素释放激素受体 基因编辑猪 crispr/Cas9
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基于RTCPA-CRISPR/Cas12a的牛病毒性腹泻病毒检测方法的建立及应用
4
作者 蒙琦 常亮 +2 位作者 杨明 曹映辉 贺泂杰 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第2期80-88,共9页
本研究旨在建立一种检测牛病毒性腹泻病毒的RT-CPA-CRISPR/Cas12a方法。选取BVDV的E0蛋白基因序列为基础,设计CPA特异性引物。同时,依据CRISPR/Cas12a的设计原则,设计了crRNA靶向RT-RAA扩增产物,并优化了RT-CPA-CRISPR/Cas12a反应体系,... 本研究旨在建立一种检测牛病毒性腹泻病毒的RT-CPA-CRISPR/Cas12a方法。选取BVDV的E0蛋白基因序列为基础,设计CPA特异性引物。同时,依据CRISPR/Cas12a的设计原则,设计了crRNA靶向RT-RAA扩增产物,并优化了RT-CPA-CRISPR/Cas12a反应体系,此外,借助建立的该方法,开展了临床样品的检测。结果显示:所建立的检测方法对BVDV的最低检出限为8.0 copies/μL,并具有高度特异性,对42份临床样品检测显示,该方法与传统PCR方法的一致性好,符合率能达到92.86%。该研究建立了牛病毒性腹泻病毒的RT-CPA-CRISPR/Cas12a检测方法,为该病的诊断提供了技术手段。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 交叉引物恒温扩增技术 crispr/Cas12a 灵敏度 特异性
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基于CRISPR/Cas9基因编辑系统建立WIP 1基因g.37536832 C>A位点突变的ST细胞系
5
作者 王楠 杜伟伟 +7 位作者 王婉洁 王悦 袁茂莎 聂雨欣 孙亚茹 刘志国 吴添文 牟玉莲 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第5期1966-1976,共11页
【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得野生型p53诱导磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatase 1,WIP1)基因与精子活力显著相关的位点g.37536832 C>A突变的猪睾丸(swine testis,ST)细胞系,为在细胞层面上进一步探讨WIP 1基因... 【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得野生型p53诱导磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatase 1,WIP1)基因与精子活力显著相关的位点g.37536832 C>A突变的猪睾丸(swine testis,ST)细胞系,为在细胞层面上进一步探讨WIP 1基因与公猪精液品质性状之间的关系奠定基础。【方法】利用CRISPOR在线网站在猪WIP 1基因g.37536832 C>A位点附近区域设计3条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接至pX458-GFP载体;通过T7E1酶切试验检测3条sgRNA活性,选择效率较高的sgRNA。构建Donor载体,并将其与sgRNA载体共同转染至ST细胞,采用流式细胞术将表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的阳性细胞进行富集和单克隆细胞筛选,并对筛选出的单克隆细胞进行基因型鉴定。【结果】质粒测序结果表明,成功将3条sgRNA连接至pX458-GFP载体上;T7E1酶切结果显示,转染pX458-GFP-sgRNA1和pX458-GFP-sgRNA2质粒组产生了切割,效率分别为24%和27%,而转染pX458-GFP-sgRNA3质粒组未检测到切割,因此选择pX458-GFP-sgRNA2质粒进行试验。成功构建Donor载体,并将pX458-GFP-sgRNA2和Donor载体共转染至ST细胞。基因型鉴定结果显示,获得的269株单克隆中有205株细胞发生了基因编辑,基因编辑效率为76%,其中9株为WIP 1基因g.37536832 C>A位点纯合突变的ST细胞,精确突变效率为3%。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得了WIP 1基因g.37536832 C>A位点突变的ST细胞系,为深入研究WIP 1基因对公猪精液品质的影响提供了良好的细胞模型。 展开更多
关键词 crispr/Cas9 WIP 1基因 ST细胞系
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CRISPR/Cas9技术:探索lncRNA的自身功能以及在癌症进程中的作用
6
作者 李欣 胡莹 王玉明 《中国生物化学与分子生物学报》 北大核心 2025年第3期364-375,共12页
CRISPR/Cas系统的出现极大推动了基因编辑领域的进步,特别是CRISPR/Cas9系统,已成为生物医学研究的核心工具。长非编码RNA(lncRNA)在基因调控、细胞分化和多种疾病的发展过程中发挥关键作用,尤其在癌症研究中,lncRNA作为癌症生物标志物... CRISPR/Cas系统的出现极大推动了基因编辑领域的进步,特别是CRISPR/Cas9系统,已成为生物医学研究的核心工具。长非编码RNA(lncRNA)在基因调控、细胞分化和多种疾病的发展过程中发挥关键作用,尤其在癌症研究中,lncRNA作为癌症生物标志物和治疗靶点,具有重要的应用前景。然而,由于lncRNA普遍具有低丰度和保守性差等特点,限制了传统手段对其功能的研究。CRISPR/Cas9技术为lncRNA的研究提供了一个高效、灵活且精确的工具,显著加速了该领域的进展。本文首先回顾了CRISPR/Cas9系统的基本原理及其在基因编辑中的广泛应用,包括CRISPR敲除、敲入、干扰和激活等多种功能系统。这些技术不仅可以筛选特定生物过程中的关键lncRNA,还能够用于基因功能研究,探索其在疾病中的作用。本文重点分析了CRISPR/Cas9技术在研究lncRNA功能和调控机制,以及其在肿瘤研究中的关键应用。此外,文章还总结了通过CRISPR/Cas9进行全基因组筛选以识别功能性lncRNA的方法,并探讨了这些lncRNA在癌症细胞增殖、迁移、侵袭以及耐药性中的作用。CRISPR/Cas9敲除系统可以高效敲除lncRNA基因,揭示其在基因调控中的具体功能。同时,CRISPR激活和干扰技术为非编码基因的研究提供了新的思路,通过调控lncRNA的表达水平,进一步探索其在癌症等疾病中的临床应用。文章还探讨了CRISPR技术在未来lncRNA研究中的潜力,尤其是在解决基因组复杂性、靶向效率和脱靶效应等技术难题方面的进展。综上所述,CRISPR/Cas9技术不仅为研究lncRNA提供了强有力的工具,也为未来开发新的癌症诊断和治疗手段提供了新的思路和机会。 展开更多
关键词 成簇的规则间隔短回文重复序列(crispr/Cas9) 长非编码RNA 基因调控 癌症
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基于CRISPR-Cas9敲除系统的胚胎干细胞基态多能性退出调控基因的筛选与鉴定
7
作者 杨艺 阮艳 +3 位作者 张俊磊 田衍平 余梦 李红丽 《陆军军医大学学报》 北大核心 2025年第18期2223-2236,共14页
目的系统性鉴定调控胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)基态多能性退出的关键基因,为深入解析多能性状态转换及早期细胞命运决定机制提供新靶点和理论依据。方法利用全基因组Brie敲除文库感染Nanog-绿色荧光蛋白(Nanog-green fluores... 目的系统性鉴定调控胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)基态多能性退出的关键基因,为深入解析多能性状态转换及早期细胞命运决定机制提供新靶点和理论依据。方法利用全基因组Brie敲除文库感染Nanog-绿色荧光蛋白(Nanog-green fluorescent protein,Nanog-GFP)报告基因标记的ESC,在白血病抑制因子/血清(leukemia inhibitory factor/serum,LIF/S)条件下持续培养14 d;通过流式细胞术分选Nanog-GFP^(+)(基态)与Nanog-GFP^(-)(始发态)细胞群,提取基因组DNA进行高通量测序;采用MAGeCK软件分析GFP^(-)/Input、GFP^(+)/Input与GFP^(+)/GFP^(-)组的差异基因,利用Metascape和基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)进行功能富集分析;基于筛选结果构建候选基因敲除模型,通过细胞形态观察、Nanog阳性率检测、克隆形成实验及分子标志物检测评估候选基因功能。结果在GFP^(+)/Input筛选中,鉴定出2921个负向变化基因(主要富集于RNA代谢、细胞周期等基础生命过程)和1393个正向变化基因(主要富集于神经系统发育、糖代谢和脉管系统发育等过程)。在GFP^(-)/Input筛选中,鉴定到2765个负向变化基因(主要富集于RNA代谢、细胞周期等基础生命过程)和1303个正向变化基因(主要富集于神经发育、细胞存活、内皮迁移等过程)。在GFP^(+)/GFP^(-)筛选中,鉴定出1001个负向变化基因[主要参与细胞应激响应和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路抑制]和983个正向变化基因[主要参与成纤维细胞生长因子/细胞外信号调节激酶(fibroblast growth factor/extracellular signal-regulated kinase,FGF/ERK)信号通路和糖代谢过程],其中不仅包括已知的多能性维持因子(如Nanog、Nr5a2、Klf2、Klf4)及多能性退出相关基因(如Gata6、Grb2、Zeb1、Fgfr1),还包括一些在基态多能性退出过程中功能尚未明确的基因(如Dmrt1、Rxra、Zbtb14和Tmem41b)。候选基因功能验证显示,瞬时敲除Dmrt1、Tmem41b和Hic2的ESC中Nanog+细胞比例显著升高(P<0.01),表明这些基因可能抑制基态多能性退出。Dmrt1稳定敲除使ESC呈现更基态的表型,表现为克隆形态变紧密、呈穹隆状,未分化克隆比例增加(P<0.01),基态多能性标志基因(如Nanog、Nr5a2、Dppa3)表达上调(P<0.01),而始发态标志基因(如Fgf5、Lefty1、Dnmt3b)表达下调(P<0.01)。回复表达Dmrt1可逆转上述表型。结论本研究通过全基因组CRISPR-Cas9筛选鉴定出调控ESC基态多能性退出的候选基因集,明确Dmrt1在促进ESC基态多能性退出过程中的关键作用。 展开更多
关键词 crispr-Cas9 胚胎干细胞 基态 始发态 多能性退出
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CRISPR/Cas9技术(递送)在支气管上皮细胞中的应用和进展
8
作者 张莹莹 王楚雯 钱国清 《中国病理生理杂志》 北大核心 2025年第1期173-180,共8页
规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)技术操作简易、高效,适用性强,在探究呼吸道潜在机制中具有独特优势。支气管上皮细胞是肺部防御的物理屏障,其损伤或功能缺失是慢性气道疾病的发病基础。近年来,慢性气道疾病... 规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)技术操作简易、高效,适用性强,在探究呼吸道潜在机制中具有独特优势。支气管上皮细胞是肺部防御的物理屏障,其损伤或功能缺失是慢性气道疾病的发病基础。近年来,慢性气道疾病发病率升高,但治疗进展相对缓慢,亟需找到治疗的突破口。CRISPR/Cas9系统可以进行精准基因编辑,为慢性气道疾病提供新策略。本文从CRISPR/Cas9的多种递送方式和作用机制出发,对其在原代、永生化支气管上皮细胞和动物体内的应用与进展进行概述,探讨了其发展前景和面临的挑战,以期为未来应用该技术进行气道疾病治疗提供参考。 展开更多
关键词 crispr/Cas9系统 支气管上皮细胞 基因编辑
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基于CRISPR∕Cas9技术创制抗稻瘟病基因pi21突变体
9
作者 谢留杰 段敏 黄善军 《上海农业学报》 2025年第2期8-15,共8页
利用CRISPR∕Cas9技术对台15-7糯的抗稻瘟病基因pi21进行编辑。选择位于pi21基因第一、第二外显子上的2段序列作为靶点构建双元表达载体pHUE411-pi21-Cas9,通过农杆菌侵染法获得21个以台15-7糯为背景的T0代单株。加代后在149个T1代单株... 利用CRISPR∕Cas9技术对台15-7糯的抗稻瘟病基因pi21进行编辑。选择位于pi21基因第一、第二外显子上的2段序列作为靶点构建双元表达载体pHUE411-pi21-Cas9,通过农杆菌侵染法获得21个以台15-7糯为背景的T0代单株。加代后在149个T1代单株中检测出6个不含载体的纯合突变体,包含3种突变类型,分别命名为pi21-t1、pi21-t2、pi21-t3,每种突变分别导致pi21基因编码的蛋白缺失227、239、99个氨基酸。稻瘟病鉴定结果表明:成熟期时,3种突变体中仅pi21-t3的病斑数量和面积较台15-7糯显著降低,其他2种突变体发病水平与台15-7糯基本相同。除抗稻瘟病能力有所提高外,突变体pi21-t3在成熟期的其他农艺性状,如株高、每穗粒数、结实率等,与台15-7糯没有显著差异。本研究可为抗稻瘟病水稻育种提供借鉴。 展开更多
关键词 crispr∕Cas9技术 pi21基因 稻瘟病 纯合突变体
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CRISPR/Cas9系统在家畜生殖细胞中的研究进展
10
作者 解雅茹 金昊延 +2 位作者 孔辰 蔡蓓 张令锴 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第2期479-491,共13页
生殖细胞是生命体遗传物质传递的主要载体,在家畜育种过程中发挥重要作用。人们对畜产品需求的不断增加促进了精确育种技术的发展。基因编辑技术显著提升基因强化和疾病治疗成效,这一进展凸显了将该技术应用于家畜生殖细胞研究的重要性... 生殖细胞是生命体遗传物质传递的主要载体,在家畜育种过程中发挥重要作用。人们对畜产品需求的不断增加促进了精确育种技术的发展。基因编辑技术显著提升基因强化和疾病治疗成效,这一进展凸显了将该技术应用于家畜生殖细胞研究的重要性。与其他基因编辑技术相比,CRISPR/Cas9系统和CRISPR/Cas12系统的研究较为深入。CRISPR/Cas技术已在多项研究中取得突破性进展,被视为一种极有潜力的育种改良手段。本文主要针对两种CRISPR/Cas系统及CRISPR/Cas9系统在家畜生殖细胞中的应用进行综述,对家畜生殖细胞形成过程进行简要概括,阐述CRISPR/Cas9系统和CRISPR/Cas12系统的原理、构成和衍生技术,介绍CRISPR/Cas9系统在家畜生殖细胞中的应用,对基因编辑技术广泛应用于家畜生殖细胞进行展望,旨在为未来畜牧基因编辑领域的研究提供参考。 展开更多
关键词 基因编辑技术 crispr/Cas9系统 crispr/Cas12系统 家畜生殖细胞
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基于CRISPR/Cas系统的生物传感器在环境分析中的应用进展 被引量：2
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作者 张毅波 马明 +1 位作者 王明仕 常天俊 《环境化学》 北大核心 2025年第3期805-819,共15页
CRISPR/Cas可改造为靶核酸刺激-响应的传感系统,可视为集“分子识别与信号输出”一体的生物传感器,目前在核酸即时诊断中已得到广泛应用.鉴于该系统具有成熟、可靠和可扩展的优点,研究人员尝试将其用于环境分析领域的非核酸分析物检测,... CRISPR/Cas可改造为靶核酸刺激-响应的传感系统,可视为集“分子识别与信号输出”一体的生物传感器,目前在核酸即时诊断中已得到广泛应用.鉴于该系统具有成熟、可靠和可扩展的优点,研究人员尝试将其用于环境分析领域的非核酸分析物检测,已开发了一系列具有应用前景的便携式设备.然而,如何将非核酸靶标信息转换为核酸信息仍存在挑战,这限制了CRISPR/Cas系统在环境分析中的应用推广.为此,本文综述了CRISPR/Cas系统在重金属离子和阴离子、新污染物、农药与真菌毒素以及有害细菌等非核酸靶标检测中的应用进展,重点介绍了构筑非核酸靶标信息转换元件的策略,以期为推进该系统在环境分析中的应用提供支持. 展开更多
关键词 crispr/Cas 新污染物 核酸适体 RNA-cleaving DNAZYME 生物传感器.
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基于RPA-CRISPR/Cas12a的杰克贝尔氏粉蚧可视化快速检测体系建立 被引量：1
12
作者 陈燕婷 史梦竹 +4 位作者 胡美玲 陈彦 杨秀娟 赵建伟 李建宇 《昆虫学报》 北大核心 2025年第6期830-839,共10页
【目的】本研究旨在利用重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)-CRISPR/Cas12a技术建立一套对杰克贝尔氏粉蚧Pseudococcus jackbeardsleyi进行快速、灵敏、便捷和可视化的荧光检测和侧向流层析检测(lateral f... 【目的】本研究旨在利用重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)-CRISPR/Cas12a技术建立一套对杰克贝尔氏粉蚧Pseudococcus jackbeardsleyi进行快速、灵敏、便捷和可视化的荧光检测和侧向流层析检测(lateral flow assay)体系,以实现在田间或者口岸等资源受限场所的现场实时检测。【方法】基于杰克贝尔氏粉蚧28S rDNA基因序列设计RPA特异性引物和crRNA,分别对杰克贝尔氏粉蚧与其他9种粉蚧(木瓜秀粉蚧Paracoccus marginatus、石蒜绵粉蚧Phenacoccus solani、扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis、柑橘臀纹粉蚧Planococcus citri、南洋臀纹粉蚧Planococcus lilacinus、新菠萝灰粉蚧Dysmicoccus neobrevipes、大洋臀纹粉蚧Planococcus minor、柑橘棘粉蚧Pseudococcus cryptus和奥德曼粉蚧Pseudococcus odermatti)进行RPA和CRISPR/Cas12a检测,验证该体系的特异性。对RPA-CRISPR/Cas12a检测体系进行条件优化,包括RPA反应时间、Cas12a和crRNA的浓度比及其浓度、荧光报告分子FQ Reporter的浓度、试纸条报告分子LF Reporter的浓度以及CRISPR/Cas12a体系反应时间,筛选获得最佳检测体系。【结果】利用设计的RPA特异性引物的RPA体系可扩增出一条201 bp的杰克贝尔氏粉蚧28S rDNA基因片段,结合CRISPR/Cas12a反应体系,可特异性地将杰克贝尔氏粉蚧与其他9种粉蚧区分开,并呈现可视化结果。通过条件优化建立的对杰克贝尔氏粉蚧的最适RPA-CRISPR/Cas12a检测体系中,RPA反应时间为20 min,Cas12a和crRNA浓度比为1∶1且在体系中的浓度均为50 nmol/L,LF Reporter浓度为500 nmol/L,LF Reporter浓度为800 nmol/L,荧光检测体系和侧向流层析检测体系的反应时间分别为5和20 min。【结论】本研究建立了一套杰克贝尔氏粉蚧RPA-CRISPR/Cas12a检测体系,具有高特异性、快速(25~40 min)、不依赖仪器设备且结果可视化的优点。该检测体系在入侵粉蚧的早期识别和现场检测具有重要的应用价值,为制定合理的管理策略提供了指导。 展开更多
关键词 杰克贝尔氏粉蚧 重组酶聚合酶扩增 crispr/Cas12a检测 荧光检测 侧向流层析检测
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一种基于HDR-CRISPR/Cas9技术快速构建重组鸭肠炎病毒的方法的建立 被引量：1
13
作者 贾文凤 蒋香香 +3 位作者 陶慧丽 王安平 吴植 朱善元 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第1期298-309,共12页
[目的]本研究通过优化试验条件,建立基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速、准确地将外源基因定向插入鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV)基因组的方法,为以DEV为载体的重组疫苗的研制奠定基础。[方法]分离并扩繁DEV疫苗株,测定其... [目的]本研究通过优化试验条件,建立基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速、准确地将外源基因定向插入鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV)基因组的方法,为以DEV为载体的重组疫苗的研制奠定基础。[方法]分离并扩繁DEV疫苗株,测定其病毒滴度。根据DEV疫苗株UL26、UL27基因间非编码区序列,设计合成向导RNA(gRNA),经双链退火获得目的片段,通过基因克隆技术将其插入PX459-V2.0载体获得gRNA-Cas9质粒。同时,通过常规基因克隆技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因插入PVAX-1载体,构建含有真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA的重组表达质粒。以DEV疫苗株基因组为模板,扩增gRNA上、下游同源臂序列,通过融合PCR将同源臂序列与真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA进行连接并克隆至PUC19载体获得供体质粒PUC19-UP-EGFP-DOWN。采用先转染质粒后感染亲本DEV的策略构建重组病毒rDEV-EGFP,通过控制单一变量法优化重组病毒构建的试验条件,根据不同条件下绿色荧光蚀斑数量确定最佳条件。利用有限稀释法筛选并纯化表达绿色荧光的蚀斑,获得重组病毒rDEV-EGFP,并对其进行遗传稳定性及体外复制能力的评估。[结果]PCR扩增及测序结果显示,成功构建靶向DEV基因组UL27与UL26基因间非编码区序列的gRNA-Cas9质粒及包含EGFP真核表达盒的供体质粒。鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast, CEF)中转染gRNA-Cas9及供体质粒后感染DEV,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蚀斑,表明成功利用HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术将EGFP报告基因敲入DEV基因组。优化后的最佳试验条件为:DEV感染复数(MOI)为0.2、gRNA-Cas9质粒与供体DNA转染比例为1∶2、供体DNA的转染形式为DNA片段、转染与感染时间间隔为6 h、重组病毒收取时间为DEV感染后48 h,优化后EGFP报告基因的敲入效率显著提高(P<0.05)。重组病毒rDEV-EGFP在CEF中连续传代15次,EGFP真核表达盒仍稳定整合在UL26与UL27基因之间的非编码区,具有良好的遗传稳定性。生长曲线结果显示,重组病毒rDEV-EGFP在CEF中的复制能力与DEV疫苗株无明显差异,生长趋势一致,具有良好的体外复制能力。[结论]本研究建立了一种基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速构建重组DEV的方法,成功构建了具有良好遗传稳定性及体外复制能力的重组病毒rDEV-EGFP,为重组DEV载体疫苗候选株的研制提供了理论依据及技术平台。 展开更多
关键词 鸭肠炎病毒 crispr/Cas9基因编辑 重组载体
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CRISPR/Cas12a基因编辑技术在植物中的研究进展 被引量：2
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作者 霍贯中 张欣濡 +1 位作者 田士军 李君 《生物技术通报》 北大核心 2025年第6期1-11,共11页
CRISPR/Cas系统是细菌和古生菌长期进化形成的适应性免疫系统,科研人员对其进行开发和优化,建立了CRISPR/Cas9基因编辑技术、CRISPR/Cas12a基因编辑技术、单碱基编辑技术和引导编辑技术,为生命科学研究提供了众多基因编辑工具。这些基... CRISPR/Cas系统是细菌和古生菌长期进化形成的适应性免疫系统,科研人员对其进行开发和优化,建立了CRISPR/Cas9基因编辑技术、CRISPR/Cas12a基因编辑技术、单碱基编辑技术和引导编辑技术,为生命科学研究提供了众多基因编辑工具。这些基因编辑工具能够高效精准地编辑目的基因组,产生各种类型的突变体,在基因功能研究、疾病模型构建、基因治疗以及作物育种等领域展现出巨大的应用潜力。CRISPR/Cas12a作为Ⅱ类Ⅴ型成员,Cas12a(Cpf1)核酸酶分子量较小,识别TTTV PAM序列,仅依赖单个crRNA结构,且无需tracrRNA的加工,操作简单以及具有多基因编辑等优点备受关注。CRISPR/Cas12a基因编辑技术自开发以来,已经成功应用在各种动植物基因组编辑中,为基因治疗及作物育种等提供重要技术支撑。本文详细介绍了CRISPR/Cas12a基因编辑技术的原理及基于CRISPR/Cas12a开发的碱基编辑和引导编辑技术,重点阐述了通过提高基因编辑效率、扩展靶向编辑范围和提高特异性等方面对CRISPR/Cas12a进行优化的策略,着重总结了该技术在植物遗传改良方面的应用,以期为CRISPR/Cas12a在植物中的进一步应用提供参考。 展开更多
关键词 crispr/Cas12a 基因组编辑 优化 遗传改良
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CRISPR技术在链霉菌细胞工厂中的应用和优化 被引量：1
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作者 李新颖 苏畅 +3 位作者 郭超 庞建 王超 李春 《化工学报》 北大核心 2025年第3期922-932,共11页
链霉菌底盘细胞的开发是微生物源药物高效合成的有效策略,高效的基因编辑工具为构建链霉菌细胞工厂提供了有力的技术支撑。CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技术具有精准性、普适性和易操作性,在微... 链霉菌底盘细胞的开发是微生物源药物高效合成的有效策略,高效的基因编辑工具为构建链霉菌细胞工厂提供了有力的技术支撑。CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技术具有精准性、普适性和易操作性,在微生物中得到了广泛的应用。然而脱靶效应、Cas蛋白毒性、编辑效率低下等原因,导致CRISPR在链霉菌中的应用受到一定的限制。对CRISPR相关技术在链霉菌中的应用及优化策略进行了总结和归纳,并对CRISPR系统在链霉菌细胞工厂中的应用前景进行了展望,为开发适用于链霉菌的高效基因编辑工具提供了参考。 展开更多
关键词 crispr 链霉菌 基因编辑 生物技术 优化策略
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CRISPR/Cas9介导的doublesex基因敲除导致草地贪夜蛾雄成虫翅发育畸形 被引量：1
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作者 张浩楠 顾俊文 +3 位作者 张昕达 魏巍 康秋阁 张琪 《昆虫学报》 北大核心 2025年第6期720-727,共8页
【目的】通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda双性基因doublesex(Sfdsx)单靶点敲除,旨在探究Sfdsx对草地贪夜蛾雄成虫翅发育的影响。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对草地贪夜蛾胚胎Sfdsx雌雄共有区域... 【目的】通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda双性基因doublesex(Sfdsx)单靶点敲除,旨在探究Sfdsx对草地贪夜蛾雄成虫翅发育的影响。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对草地贪夜蛾胚胎Sfdsx雌雄共有区域进行敲除,构建Sfdsx突变体;待化蛹后,在显微镜下观察草地贪夜蛾Sfdsx突变体蛹及成虫翅的形态特征差异。【结果】草地贪夜蛾Sfdsx突变体出现显著的性别比趋于雄性(雌∶雄=0∶14),位于腹部第8-9节的雄蛹生殖孔两侧发生严重扭曲;雄成虫突变体的翅性状趋向性别中间态,其中,前翅中央的肾形斑变形、翅末端黑斑消失、翅鳞片排列错乱。后翅翅展畸形,翅鳞片排列发生改变,着生小黑斑。【结论】CRISPR/Cas9介导的Sfdsx基因公共区域的敲除导致草地贪夜蛾雄成虫翅发育畸形。本研究的结果为利用昆虫不育技术(sterile insect technology,SIT)调控草地贪夜蛾的发育提供了理想的基因靶标和理论依据。 展开更多
关键词 草地贪夜蛾 基因敲除 crispr/Cas9 DOUBLESEX 翅发育
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靶向RNA的CRISPR/Cas系统及衍生技术 被引量：1
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作者 周迅 周世杰 +1 位作者 刘捷 王宇祥 《遗传》 北大核心 2025年第8期842-860,共19页
RNA编辑是表观遗传学领域重要的研究方向之一。随着研究的深入,科学家们发现CRISPR/Cas系统不仅可以靶向DNA,也可以靶向RNA,从而实现转录水平的基因精准编辑;同时,使用CRISPR/Cas系统进行RNA编辑也可以避免对基因组的破坏。目前,基于靶... RNA编辑是表观遗传学领域重要的研究方向之一。随着研究的深入,科学家们发现CRISPR/Cas系统不仅可以靶向DNA,也可以靶向RNA,从而实现转录水平的基因精准编辑;同时,使用CRISPR/Cas系统进行RNA编辑也可以避免对基因组的破坏。目前,基于靶向RNA的CRISPR系统已开发出多种衍生技术,如RNA敲低和编辑、核酸检测和成像、RNA示踪等。这些衍生技术的出现,为生物遗传机制解析和疾病治疗提供了有利工具。本文归纳总结了靶向RNA的CRISPR/Cas系统的结构、功能、机制以及开发的衍生技术,以期丰富人们对CRISPR/Cas系统编辑RNA的认知。 展开更多
关键词 基因编辑 crispr/Cas系统 RNA 功能及应用
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基于CRISPR-Cas9的黄瓜Csago1c突变体创制及其种子萌发分析 被引量：1
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作者 况勇 肖逸 +3 位作者 管丽丽 孙照龙 李俊 甘德芳 《核农学报》 北大核心 2025年第8期1617-1629,I0002-I0004,共16页
Argonaute(AGO)蛋白是RNA诱导的基因沉默复合体的核心组分,参与调控植物生长发育及逆境胁迫响应等生物学过程。为探讨黄瓜Cs AGO1c基因的功能,利用CRISPR/Cas9技术构建黄瓜Cs AGO1c基因编辑载体,农杆菌介导法转化新泰密刺自交系,经筛选... Argonaute(AGO)蛋白是RNA诱导的基因沉默复合体的核心组分,参与调控植物生长发育及逆境胁迫响应等生物学过程。为探讨黄瓜Cs AGO1c基因的功能,利用CRISPR/Cas9技术构建黄瓜Cs AGO1c基因编辑载体,农杆菌介导法转化新泰密刺自交系,经筛选和分子检测获得CsAGO1c基因突变植株,分析Csago1c突变体的编辑情况、突变体植株的表型以及种子萌发情况。结果表明,试验获得4株转基因抗性苗(T_(0)),其中#4和#12为编辑植株,#7和#11未发生编辑;但#7植株在T1代出现了大片段碱基缺失、少数碱基缺失、单碱基插入以及碱基替换等多种编辑情况。突变体植株在叶片形状、节间长、卷须、侧枝、雄花和雌花着生节位等与对照均无明显差异,但突变体种子萌发率降低,推测Cs AGO1c可能参与调控黄瓜种子的萌发过程。该研究结果对探明黄瓜Cs AGO1c基因功能以及对黄瓜遗传改良和新品种选育具有重要理论指导意义。 展开更多
关键词 黄瓜 Argonaute(AGO)蛋白 crispr/Cas9 基因编辑 种子萌发
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基于CRISPR/Cas9系统构建Uox基因敲除的高尿酸血症小鼠模型
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作者 张艺薇 龙维虎 +6 位作者 唐东红 范胜涛 王鹏 王陈芸 李哲丽 黄璋琼 叶尤松 《中国实验动物学报》 北大核心 2025年第3期411-419,共9页
目的 通过CRISPR/Cas9技术构建Uox基因敲除且能稳定遗传的小鼠品系,并评价其是否能够模拟高尿酸血症患者的疾病特点。方法 在Uox基因Exon 2~4的前后两侧设计双sgRNA,将基因敲除所需的sgRNA与Cas9 mRNA按照一定比例显微注射进小鼠的受精... 目的 通过CRISPR/Cas9技术构建Uox基因敲除且能稳定遗传的小鼠品系,并评价其是否能够模拟高尿酸血症患者的疾病特点。方法 在Uox基因Exon 2~4的前后两侧设计双sgRNA,将基因敲除所需的sgRNA与Cas9 mRNA按照一定比例显微注射进小鼠的受精卵中,培养2~4 h后,将胚胎移植至代孕母鼠体内并最终获得F0代小鼠。对F0代小鼠进行PCR鉴定与测序分析,筛选适合的Uox基因阳性敲除小鼠与野生型(wide type, WT)小鼠合笼获得F1代,再挑选F1代中杂合子(基因型为Uox^(+/-))雌鼠与雄鼠合笼得到纯合的F2代小鼠(基因型为Uox^(-/-))。最后检测Uox^(-/-)小鼠与WT小鼠血清尿酸、尿液尿酸,血清中肌酐、尿素、丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶的含量并进行对比,通过苏木素-伊红(HE)染色结合Masson染色观察肾和肝组织的病理变化。结果 与WT小鼠相比,Uox^(-/-)小鼠血清尿酸(雄鼠:(478.4±114.6)μmol/L,P<0.001;雌鼠:(507.7±129.6)μmol/L,P<0.001)、尿液尿酸(雄鼠:(4116.8±1928.1)μmol/L,P<0.001;雌鼠:(2998.0±547.7)μmol/L,P<0.01)、血清中肌酐((91.8±55.6)μmol/L,P<0.001)、尿素((28.6±13.9) mmol/L,P<0.05)、丙氨酸氨基转移酶((53.3±23.3) U/L,P<0.01)及门冬氨酸氨基转移酶((203.3±70.3) U/L,P<0.001)水平均显著升高。组织病理学的结果显示,Uox^(-/-)小鼠的肝中可见中量肝细胞变性,肾中可见中重度的肾小管囊性扩张、变性和纤维化,肾小球肥大增生,小血管扩张充血,间质单核及淋巴细胞浸润。结论 通过CRISPR/Cas9技术成功构建了Uox基因Exon 2敲除的小鼠纯合品系,可以作为高尿酸领域相关研究的动物模型。 展开更多
关键词 高尿酸血症 动物模型 crispr/Cas9 基因敲除 尿酸氧化酶
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一种高通量的CRISPR/Cas9材料靶点检测方法在大豆中的应用研究
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作者 彭丽华 欧阳文琦 +9 位作者 曹东 郭葳 杨红丽 郝青南 陈水莲 张婵娟 袁松丽 陈海峰 沙爱华 陈李淼 《中国油料作物学报》 北大核心 2025年第4期920-928,共9页
CRISPR/Cas9基因编辑技术已经被广泛地应用于多种植物中,常规基因编辑靶点检测方法实验繁琐且耗时,成本较高,开发更简便和高通量的方法可以极大提高靶点检测的效率。本实验以南方大豆品种天隆一号为材料,开发了一种叶片DNA的快速提取方... CRISPR/Cas9基因编辑技术已经被广泛地应用于多种植物中,常规基因编辑靶点检测方法实验繁琐且耗时,成本较高,开发更简便和高通量的方法可以极大提高靶点检测的效率。本实验以南方大豆品种天隆一号为材料,开发了一种叶片DNA的快速提取方法——水磨法,缩短DNA提取和检测时间,并且提取的DNA可以保存20 d。此外,本文还进一步研究了将提取液替换为TE buffer后,在煮沸条件下,DNA的稳定性分析。结果表明:煮沸1 min、3 min、5 min和10 min后,4℃或-20℃放置的DNA样品均可以保存45 d。然后,将天隆一号为遗传背景的待测材料中的靶点序列PCR产物进行毛细管电泳,与对照材料相比,观察是否存在差异碱基的特异性条带,进而判断待测材料是否发生基因编辑及可能存在的编辑类型种类。本文将植物叶片DNA快速提取法和毛细管电泳技术相结合,更加快速、高通量地筛选大豆材料的突变情况及突变种类,为大豆重要性状基因功能分析提供技术支持。 展开更多
关键词 大豆 crispr/Cas9 DNA快速提取法 靶点检测 高通量
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