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基于CaCC的TRPV4调节剂高通量筛选细胞模型的建立 被引量：1
1
作者 肖云萍 解宇浩 +3 位作者 张嘉琪 洪啟元 郝峰 王国庆 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第10期1032-1039,共8页
目的构建基于钙激活氯离子通道(CaCC)的瞬时受体电位香草酸亚型4(TRPV4)调节剂的高通量筛选细胞模型。方法采用RT-PCR检测Fischer大鼠甲状腺滤泡上皮(FRT)细胞中内源性表达的TRPV4,所得PCR产物切胶回收后测序;采用Western blotting检测... 目的构建基于钙激活氯离子通道(CaCC)的瞬时受体电位香草酸亚型4(TRPV4)调节剂的高通量筛选细胞模型。方法采用RT-PCR检测Fischer大鼠甲状腺滤泡上皮(FRT)细胞中内源性表达的TRPV4,所得PCR产物切胶回收后测序;采用Western blotting检测FRT细胞中TRPV4蛋白的表达情况。应用脂质体转染法构建共表达钙激活氯离子通道蛋白1(ANO1)和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞模型,倒置荧光显微镜下观察ANO1和YFP-H148Q/I152L在细胞中的表达情况,应用荧光淬灭动力学实验测定细胞模型的有效性。加入TRPV4激活剂和抑制剂,应用荧光淬灭动力学实验检测模型能否筛选TRPV4调节剂;加入TRPV4激活剂,应用Fura-2荧光探针法检测细胞内的Ca2+浓度;通过Z'因子评估细胞模型是否适用于高通量筛选。结果RT-PCR和Western blotting检测结果显示,FRT细胞内源性表达TRPV4。倒置荧光显微镜下清晰可见ANO1表达在FRT细胞膜上,YFP-H148Q/I152L表达在FRT细胞质中,即成功构建了共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞模型。荧光淬灭动力学实验结果显示,该模型可以筛选TRPV4调节剂,斜率(Slope)值与TRPV4调节剂的浓度呈剂量依赖关系;该模型可敏感检测细胞内Ca2+的浓度变化,通过Slope值可反映细胞内Ca2+浓度的高低;Z'因子为0.728,表明该模型可高通量筛选TRPV4调节剂。结论成功构建了一种可以敏感高效筛选TRPV4调节剂的高通量筛选细胞模型。 展开更多
关键词 瞬时受体电位香草酸亚型4 钙激活氯离子通道 YFP-H148Q/I152L 高通量筛选细胞模型
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基于膜电位检测原理的γ-氨基丁酸A型受体药物高通量筛选模型
2
作者 张毅 石童 +5 位作者 张瑞华 陈学军 靳倩 石晶晶 王陈 李丽琴 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS 北大核心 2022年第2期120-128,共9页
目的利用膜电位检测原理,构建一种靶向γ-氨基丁酸A型受体(GABA_(A)R)的药物高通量筛选模型。方法采用α_(1)β_(2)γ_(2L)-GABA_(A)R-CHO细胞株构建GABA_(A)R药物高通量筛选方法;分别以工具化合物的50%激动效应浓度(EC_(50))和EC_(80)... 目的利用膜电位检测原理,构建一种靶向γ-氨基丁酸A型受体(GABA_(A)R)的药物高通量筛选模型。方法采用α_(1)β_(2)γ_(2L)-GABA_(A)R-CHO细胞株构建GABA_(A)R药物高通量筛选方法;分别以工具化合物的50%激动效应浓度(EC_(50))和EC_(80)浓度下的激活值(ASV)和Z′因子作为判定指标,对缓冲液反应体系、激动剂GABA激活浓度、染料种类和染料孵育时间进行优化选择;在优化条件下分别利用激动剂GABA(0.05,0.25和1.00μmol·L^(-1))、阳性变构剂地西泮(Dia,1,5和30μmol·L^(-1))和拮抗剂加巴嗪(gabazine,Gab,0.1,1.0和10.0μmol·L^(-1))进行方法稳定性考察;通过工具化合物GABA,Dia和Gab的剂量-效应关系检测,考察方法灵敏度。结果构建的方法分别实现了对不同药理性质化合物GABA,Dia和Gab的特异性检测;通过方法优化获得的优化条件为:在GABAEC_(20)~EC_(50)激活浓度下,采用5μL含氯体系加样,对使用红色染料孵育30~50 min的GABAAR-CHO细胞进行工具化合物检测;对不同浓度GABA,Dia和Gab检测的CV%分别介于4.09%~15.30%,5.59%~8.30%和5.65%~15.64%;通过对3种工具化合物的剂量-效应关系检测,获得GABA和Dia的EC_(50)值分别为(137.4±26.3)nmol·L^(-1)和(3.5±0.7)μmol·L^(-1),Gab的50%抑制效应浓度为(164.9±36.6)nmol·L^(-1)。结论本研究建立并优化了高通量检测方法,该方法特异性好、精密度高、稳定可靠、灵敏度高,为靶向GABA_(A)R的先导化合物发现提供了良好的技术基础。 展开更多
关键词 高通量筛选 γ-氨基丁酸A型受体 地西泮 膜电位 细胞模型
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pcDNA3.1/hTSHR真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达 被引量：6
3
作者 詹升华 张徽 刘纯 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期390-393,共4页
目的 :构建pcDNA3.1(+)人促甲状腺激素受体 (hTSHR)基因真核表达载体 ,并在COS 7细胞中进行表达。方法 :以限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切pBluescriptSK(- ) /hTSHR ,获得hTSHRcDNA的全长片段 ,在以低熔点琼脂糖回收纯化后 ,定向插入真... 目的 :构建pcDNA3.1(+)人促甲状腺激素受体 (hTSHR)基因真核表达载体 ,并在COS 7细胞中进行表达。方法 :以限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切pBluescriptSK(- ) /hTSHR ,获得hTSHRcDNA的全长片段 ,在以低熔点琼脂糖回收纯化后 ,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆酶切位点中 ,构建重组体pcDNA3.1/hTSHR ,进行酶切、PCR及测序鉴定。通过脂质体介导 ,转染COS 7细胞进行瞬时表达 ,并用RT PCR和免疫细胞化学染色法检测hTSHR的表达。结果 :双酶切pBluescriptSK(- ) /hTSHR得到约 2 70 0bp含TSHR全长cD NA的片段 ,同预期片段的大小相符。所构建的pcDNA3.1/hT SHR经双酶切及PCR鉴定同预期大小相符 ;测序结果与Gen Bank中收录的hTSHR全长序列一致 ,表明真核表达质粒构建正确。以脂质体转染COS 7细胞后 ,用RT PCR和免疫细胞化学染色法检测表明 ,细胞可表达hTSHR。结论 :成功地构建真核重组表达质粒pcDNA3.1/hTSHR ,为进一步研究TSHR的功能 ,以及利用hTSHR真核表达载体建立Graves实验动物模型奠定了基础。 展开更多
关键词 人促甲状腺激素受体 PCDNA3.1 cos-7细胞 转染 动物模型
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白细胞介素1受体拮抗剂筛选模型研究 被引量：1
4
作者 李全文 边昕 +1 位作者 张洋 李元 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2000年第5期330-332,共3页
以链霉菌表达的重组 hs IL- 1R 为靶位 ,建立了基于受体配基竞争性结合为原理、白细胞介素 1受体拮抗剂筛选模型 ,对 5 0 0株微生物发酵产物进行了筛选 ,复筛阳性率为 4%～ 5 % ,该模型具有新颖性和实用性。
关键词 重组白细胞介素1受体 拮抗剂 高通量筛选模型
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应用诱导多能干细胞构建体外神经退行性疾病模型的研究进展
5
作者 马寅仲 杜冠华 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期1185-1189,共5页
随着细胞重编程技术的不断发展,诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)向不同类型体细胞定向分化的技术已经日趋成熟。由于许多疾病或易感体质具有其独特的遗传信息,因而使用来自具有不同疾病类型的捐赠者体细胞,可以... 随着细胞重编程技术的不断发展,诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)向不同类型体细胞定向分化的技术已经日趋成熟。由于许多疾病或易感体质具有其独特的遗传信息,因而使用来自具有不同疾病类型的捐赠者体细胞,可以重编程为一系列具有特定致病基因背景的iPSCs库。根据需要可以将其直接分化为能够产生该疾病表征的细胞谱系或亚型。这些细胞由于带有捐赠者的基因特征,因而能够在体外表现出与体内实际病理特征相似的疾病模型。目前已有超过15种此类疾病模型的新药筛选报道。虽然尚不成熟,但我们已经可以预见该方法在药物筛选中巨大的发展潜力。该文总结了以iPSCs作为基础,针对神经退行性疾病所进行的疾病模型的建立。对比传统方法,分析了其在新药高通量筛选(high-throughput screening,HTS)以及高内涵筛选(high-content screening,HCS)中的应用前景。 展开更多
关键词 诱导多能干细胞 疾病模型 神经退行性疾病 新药高通量筛选 高内涵筛选 细胞分化
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利用自主发光结核分枝杆菌快速连续检测抗结核药物的细胞内活性 被引量：5
6
作者 梁镇兴 张可 +2 位作者 张天宇 谭耀驹 谭守勇 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2013年第23期3823-3826,共4页
目的:建立无筛选标记的自主发光结核分枝杆菌感染巨噬细胞模型并利用该模型直接快速连续检测抗结核药物的细胞内活性。方法:将小鼠巨噬细胞株(Raw264.7)接入96孔板中贴壁过夜处理,然后利用UAlRv菌感染4 h后进行清洗,加入抗结核药物后进... 目的:建立无筛选标记的自主发光结核分枝杆菌感染巨噬细胞模型并利用该模型直接快速连续检测抗结核药物的细胞内活性。方法:将小鼠巨噬细胞株(Raw264.7)接入96孔板中贴壁过夜处理,然后利用UAlRv菌感染4 h后进行清洗,加入抗结核药物后进行培养。分别在感染后的第0～7天对同一样品进行发光值的检测,直接通过发光值的变化进行药效的判断。结果:成功构建UAlRv感染小鼠巨噬细胞的模型,并利用该模型成功对利福平(RIF),异烟肼(INH),莫西沙星(MFX)和利奈唑胺(LZD)等抗结核药物进行细胞内抗结核作用评价。UAlRv体外检测药物活性的最小抑菌浓度(MIC,μg/mL)分别为RIF 0.125,INH 0.06,MFX 0.5和LZD 2.0,与之前报道过的利用带抗性标记的自主发光结核杆菌体外检测药物活性一致。在UAlRv感染巨噬细胞模型中药物的MIC(μg/mL)分别为RIF 0.125,INH 0.015,MFX 0.5和LZD 4.0,这与报道过的利用普通H37Rv结核菌感染巨噬细胞模型检测的结果相一致。结论:利用UAlRv感染巨噬细胞模型可快速、经济、连续地检测抗结核药物的细胞内活性,并可能用于高通量筛选/评价抗结核药物。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 巨噬细胞感染模型 高通量筛选 利奈唑胺 莫西沙星
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桑叶中对PPARγ有激活作用的组分分离和活性鉴定 被引量：1
7
作者 宋如鋆 耿明星 +2 位作者 吕正兵 钱坤 舒建洪 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期511-517,共7页
过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARγ)是调节脂肪细胞基因表达和分化的重要因子,也称作胰岛素增敏剂受体,一些脂肪酸对PPARγ有激活作用。桑叶中含有多种脂肪酸,以其为材料,利用构建的COS-7细胞高通量筛选模型筛选具有PPARγ配体活性... 过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARγ)是调节脂肪细胞基因表达和分化的重要因子,也称作胰岛素增敏剂受体,一些脂肪酸对PPARγ有激活作用。桑叶中含有多种脂肪酸,以其为材料,利用构建的COS-7细胞高通量筛选模型筛选具有PPARγ配体活性的组分及单体。桑叶粉通过正己烷提取和石油醚萃取后,石油醚萃取组分(Fr.P)对PPARγ的激活倍数可达到阴性对照DMSO的3.34倍。经气相色谱-质谱(GC-MS)分析,从桑叶正己烷提取物(Fr.H)和Fr.P组分中共获得19种脂肪酸,其中Fr.H中的亚麻酸质量分数为1.91%,亚油酸为0.94%,十四酸为0.11%。高通量细胞筛选模型分析显示,与阴性对照DMSO比较,100μmol/L十四酸对PPARγ的激活倍数为1.51,50μmol/L十五酸对PPARγ的激活倍数为2.12,150μmol/L亚麻酸对PPARγ的激活倍数为2.48,100μmol/L亚油酸对PPARγ的激活倍数为2.21,而其他脂肪酸均无PPARγ配体活性。通过十四酸、亚麻酸和亚油酸的协同PPARγ激活效应分析,推测桑叶中可能含有非脂肪酸的PPARγ激动剂成分。研究结果提示有望从桑叶中寻找到新的天然胰岛素增敏剂。 展开更多
关键词 过氧化物酶体增殖物激活受体-Γ cos-7细胞高通量筛选模型 桑叶 脂肪酸
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96种中药单体抑制血管生成的活性研究 被引量：2
8
作者 花慧 张敏 陶永辉 《天然产物研究与开发》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期1612-1617,共6页
采用内皮细胞高通量筛选模型和鸡胚尿囊膜(CAM)实验筛选技术,分析96种中药单体的抑制血管生成的活性。筛选结果表明有11种中药单体对Eahy-926细胞的增殖有一定的抑制作用且呈剂量依赖关系,有10种中药单体具有抑制CAM血管形成的作用。秦... 采用内皮细胞高通量筛选模型和鸡胚尿囊膜(CAM)实验筛选技术,分析96种中药单体的抑制血管生成的活性。筛选结果表明有11种中药单体对Eahy-926细胞的增殖有一定的抑制作用且呈剂量依赖关系,有10种中药单体具有抑制CAM血管形成的作用。秦皮素、汉防己甲素、和厚朴酚、蝙蝠葛碱、鲁斯可皂苷元、高粱姜素、染料木素、隐绿原酸、齐墩果酸和α-倒捻子素,这10种单体化合物值得进一步研究。 展开更多
关键词 中药单体 高通量筛选模型 Eahy 926细胞
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