利用Red重组系统对大肠杆菌ClpP基因的敲除 被引量：29

1

作者 白光兴 孙志伟 +1 位作者 黄莺 俞炜源 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期35-38,共4页

利用含有质粒pKD4 6的菌株BW2 5 113,在阿拉伯糖诱导后 ,表达λ噬菌体的 3个重组蛋白 ,宿主菌就具有了同源重组的能力 .设计的引物 5′端有 5 0bp的拟敲除基因的同源臂 ,3′端为扩增引物 ,以pKD3为模板 ,扩增两侧含FRT位点的氯霉素抗性... 利用含有质粒pKD4 6的菌株BW2 5 113,在阿拉伯糖诱导后 ,表达λ噬菌体的 3个重组蛋白 ,宿主菌就具有了同源重组的能力 .设计的引物 5′端有 5 0bp的拟敲除基因的同源臂 ,3′端为扩增引物 ,以pKD3为模板 ,扩增两侧含FRT位点的氯霉素抗性基因 ,将此线性片段电转入具重组功能的感受态细胞 ,利用氯霉素平板就可以筛选到阳性转化体 .再利用表达Flp重组酶的质粒pCP2 0 ,可将FRT位点之间的氯霉素抗性基因删除 .利用该重组系统 ,构建了ClpP蛋白酶缺失的大肠杆菌工程菌株 ,可望在减少外源蛋白的降解方面发挥一定的作用 . 展开更多

关键词 clpp FLP重组酶 FRT位点 Red重组酶

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肺炎链球菌毒力因子ClpP蛋白酶的体外表达及纯化 被引量：6

2

作者 袁军 陈曜 +1 位作者 曹炬 尹一兵 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第18期1753-1755,共3页

目的构建ClpP原核表达载体,获取原核表达的ClpP蛋白分子。方法分离培养TIGR4型肺炎链球菌,获取其染色体DNA,采用基因体外重组的方法将完整的ClpP读码框克隆到pET-32a原核表达载体,并经测序鉴定,所表达的抗原蛋白用Western blot鉴定,镍... 目的构建ClpP原核表达载体,获取原核表达的ClpP蛋白分子。方法分离培养TIGR4型肺炎链球菌,获取其染色体DNA,采用基因体外重组的方法将完整的ClpP读码框克隆到pET-32a原核表达载体,并经测序鉴定,所表达的抗原蛋白用Western blot鉴定,镍柱纯化并透析复性,真空冷冻干燥保存。结果测序结果证实克隆的基因与GenBank中的序列相符,Western blot证实获得了ClpP融合蛋白。结论获得了高表达的重组抗原蛋白,经镍柱纯化后纯度可达90%以上。 展开更多

关键词 毒力因子 肺炎链球菌 clpp蛋白

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clpP基因缺陷对肺炎链球菌毒力表达降低的研究 被引量：4

3

作者 张群 胥文春 +3 位作者 尹一兵 朱兴华 李有强 张雪梅 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期307-310,共4页

目的探索clpP基因缺陷对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)毒力的影响。方法用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)方法失活clpP基因,用PCR、Western blot鉴定缺陷菌株,通过RT-PCR分析自溶素(major autoly-sin A,lytA)、表面黏附A... 目的探索clpP基因缺陷对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)毒力的影响。方法用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)方法失活clpP基因,用PCR、Western blot鉴定缺陷菌株,通过RT-PCR分析自溶素(major autoly-sin A,lytA)、表面黏附A(pneumococcal surface adhesion A,psaA)、溶血素(pneumolysin,ply)和胆碱结合蛋白A(cholinebinding protein A,cbpA)的表达,并通过动物实验观察clpP基因缺陷株毒力改变情况。结果RT-PCR显示clpP缺陷株的4个毒力因子mRNA表达水平均低于野生菌,两者比较有统计学差异(P<0.05);小鼠毒力实验表明野生菌株半数致死时间为22h,而缺陷株半数致死时间为8d,两者比较有统计学差异(P<0.01);缺陷菌在小鼠体内被清除速度也显著快于野生菌株(P<0.05)。结论clpP基因缺陷使S.pn多种毒力因子表达减弱,毒力降低。 展开更多

关键词 肺炎链球菌 毒力因子 热休克蛋白 clpp基因

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ClpP粘膜免疫预防小鼠发生肺炎链球菌性肺炎和败血症 被引量：2

4

作者 陈怡婷 曹炬 +3 位作者 李岱容 吴凯峰 尹楠林 尹一兵 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期556-559,共4页

目的:肺炎链球菌毒力蛋白ClpP鼻腔粘膜免疫BALB/c小鼠,探讨其作为肺炎链球菌候选蛋白疫苗的价值。方法:利用制备的ClpP多克隆抗体,分析ClpP在肺炎链球菌表面表达情况;ClpP蛋白粘膜免疫小鼠,TIGR4型肺炎链球菌分别经腹腔和鼻腔攻击,分析... 目的:肺炎链球菌毒力蛋白ClpP鼻腔粘膜免疫BALB/c小鼠,探讨其作为肺炎链球菌候选蛋白疫苗的价值。方法:利用制备的ClpP多克隆抗体,分析ClpP在肺炎链球菌表面表达情况;ClpP蛋白粘膜免疫小鼠,TIGR4型肺炎链球菌分别经腹腔和鼻腔攻击,分析肺炎链球菌小鼠肺内定植情况并监测小鼠生存时间。结果:流式细胞技术证实了TIGR4肺炎链球菌表面表达ClpP毒力蛋白,粘膜免疫ClpP可以特异产生系统性和粘膜性的ClpP抗体,并可减少TIGR4肺炎链球菌在小鼠肺内的定植,延长小鼠生存时间。结论:ClpP粘膜免疫可预防小鼠发生肺炎链球菌性肺炎和败血症,进一步证实ClpP蛋白可作为肺炎链球菌的候选蛋白疫苗。 展开更多

关键词 粘膜免疫 肺炎链球菌 clpp

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牛种布鲁氏菌clpP基因缺失株的毒力和免疫保护力评价 被引量：3

5

作者 彭小薇 吴方达 +6 位作者 刘郁夫 董浩 孙永健 毕一鸣 张存瑞 刘林青 韩焘 《中国动物检疫》 CAS 2019年第11期59-64,共6页

为研究布鲁氏菌clpP基因与细菌毒力的关系,采用同源重组的方法,构建牛种布鲁氏菌clpP基因缺失株,用巨噬细胞RAW264.7感染模型和小鼠感染模型评价clpP基因缺失株的毒力,同时测定该缺失株免疫小鼠后产生的免疫保护力。研究发现:牛种布鲁氏... 为研究布鲁氏菌clpP基因与细菌毒力的关系,采用同源重组的方法,构建牛种布鲁氏菌clpP基因缺失株,用巨噬细胞RAW264.7感染模型和小鼠感染模型评价clpP基因缺失株的毒力,同时测定该缺失株免疫小鼠后产生的免疫保护力。研究发现:牛种布鲁氏菌clpP基因缺失后,在细胞感染模型和小鼠感染模型中的毒力显著降低;clpP基因缺失株感染小鼠后,不引起脾脏肿胀,并且在脾脏内的持续期短于A19疫苗株,说明该基因缺失株具有更高的安全性;使用clpP基因缺失株免疫小鼠后,该基因缺失株无法抵御牛种布鲁氏菌2308株和羊种布鲁氏菌M28株的感染。本研究为揭示布鲁氏菌致病机制和新型布病疫苗研发提供了参考。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 疫苗 clpp基因 毒力 基因缺失株 免疫保护

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铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株的构建 被引量：1

6

作者 张加勤 饶慧华 +4 位作者 徐巧丽 黄朝阳 房丽丽 马晓波 宋秀宇 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第7期627-630,共4页

目的构建铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株。方法分别以质粒pUCGM和铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板PCR扩增庆大霉素抗性基因(GM)和铜绿假单胞菌clpP基因及其3′、5′侧翼序列,将clpP基因及其3′、5′侧翼序列克隆至pMD19T载体,EcoRV切除clpP基... 目的构建铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株。方法分别以质粒pUCGM和铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板PCR扩增庆大霉素抗性基因(GM)和铜绿假单胞菌clpP基因及其3′、5′侧翼序列,将clpP基因及其3′、5′侧翼序列克隆至pMD19T载体,EcoRV切除clpP基因37bp^453bp片段后,引入庆大霉素抗性基因,构建重组质粒pCKR2;EcoRⅠ/HindⅢ双酶切重组质粒pCKR2,回收FclpP-GM-clpPR片段,与自杀质粒pEX18Tc连接,得到clpP基因缺陷的同源重组载体pCKR3;将pCKR3质粒转化大肠埃希菌SM10,与铜绿假单胞菌PAO1双亲杂交,庆大霉素筛选得到铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株。结果经酶切鉴定同源重组载体pCKR3构建正确;PCR和DNA测序鉴定铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株构建成功。结论本研究成功敲除了铜绿假单胞菌clpP基因,为进一步研究clpP基因的生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 铜绿假单胞菌 clpp基因 双亲杂交 同源重组

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胡萝卜软腐果胶杆菌clpP基因的功能研究 被引量：1

7

作者 李婷 蒋欢 +4 位作者 杨钟灵 邓亚岷 杜硕 刘凤权 范加勤 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期58-64,共7页

为探索clpP基因对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum,P.c.c)生物学特性及致病性等方面的影响,采用同源重组法构建clpP基因缺失突变体ΔclpP和互补菌株ΔclpP(clpP),测定突变体及互补菌株的运... 为探索clpP基因对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum,P.c.c)生物学特性及致病性等方面的影响,采用同源重组法构建clpP基因缺失突变体ΔclpP和互补菌株ΔclpP(clpP),测定突变体及互补菌株的运动性、生物膜、抗氧化压力,以及在不同培养基和不同温度下的生长能力、部分致病因子活性及致病性等表型,并采用RT-PCR分析了果胶酸裂解酶(Pel)、纤维素酶(Cel)、蛋白酶(Prt)和坏死诱导蛋白(necrosis-inducing protein,Nip)等相关致病因子的编码基因转录水平变化。结果表明:ΔclpP的运动性无变化,生物膜形成、高温和营养饥渴耐受力及抗氧化压力等均下降;果胶酶、纤维素酶与蛋白酶活性有不同程度降低,酶活性检测平板上水解圈的直径分别比野生株下降19.35%、34.38%和35.00%;ΔclpP的致病性显著下降,离体接种‘黄花马蹄莲’叶片和大白菜叶柄,病斑面积分别比野生株的减小99.00%和99.60%;在4个毒力因子中,qRT-PCR显示:ΔclpP果胶酸裂解酶与纤维素酶mRNA相对表达量为野生菌株的40.00%左右。由此可见,clpP基因对胡萝卜软腐果胶杆菌的生长和致病性具有多方面的决定作用。 展开更多

关键词 胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种 clpp 生物学特性 致病性

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变异链球菌clpP基因启动子的克隆及活性测定

8

作者 张加勤 侯香华 +5 位作者 张世阳 郑港森 马晓波 赵元勋 黄朝阳 洪国粦 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第12期1126-1130,共5页

目的克隆变异链球菌clpP基因启动子,并进行初步验证。方法 PCR分别扩增变异链球菌clpP基因5′-侧翼序列FclpP及其突变体FclpP-ΔRS,插入β-半乳糖苷酶(β-glucuronidase,gusA)报道基因表达载体pIB107 BamHI/XhoI酶切位点之间,构建clpP基... 目的克隆变异链球菌clpP基因启动子,并进行初步验证。方法 PCR分别扩增变异链球菌clpP基因5′-侧翼序列FclpP及其突变体FclpP-ΔRS,插入β-半乳糖苷酶(β-glucuronidase,gusA)报道基因表达载体pIB107 BamHI/XhoI酶切位点之间,构建clpP基因5′-侧翼序列及其突变体gusA报道基因表达载体pFclpP和pFclpP-ΔRS,PCR、酶切及测序鉴定;经Bgl II线性化后转化变异链球菌UA159,卡那霉素筛选阳性克隆,得到clpP基因5′-侧翼序列及其突变体gusA报道基因表达株SClpP和SClpP-ΔRS,经PCR及测序鉴定后,测定SClpP、SClpP-ΔRS、阳性对照SAmi和阴性对照SIB107的GusA活性。结果成功扩增出变异链球菌clpP基因5′-侧翼序列及其突变体;变异链球菌clpP基因gusA报道基因表达载体经PCR、酶切及测序鉴定正确无误;PCR及测序结果表明成功构建clpP基因5′-侧翼序列及其突变体变异链球菌gusA报道基因表达株SClpP和SClpP-ΔRS;GusA活性测定证实变异链球菌clpP基因5′-侧翼序列及其变体gusA报道基因表达株SClpP和SClpP-ΔRS的GusA活性分别是阴性对照pIB107的34.6和8.7倍,是阳性对照松鼠葡萄球菌ami基因启动子片段gusA报道基因表达株活性的5.2和1.3倍,提示插入片段FclpP和FclpP-ΔRS具有较强的启动子活性。结论成功定位并克隆变异链球菌clpP基因启动子,为今后研究clpP基因上游调控序列提供试验和理论依据。 展开更多

关键词 变异链球菌 clpp 启动子

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细菌ClpP蛋白酶功能及其抗菌药物靶点的研究进展 被引量：2

9

作者 颜骊颖 张亚培 董世雷 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期15-21,共7页

ClpP(Casein lytic proteinase P)是一种广泛存在于真核细胞和原核生物中的丝氨酸蛋白酶,可与多种类型AAA+(ATPase associated with various cellular activity)超家族ATP酶组成多种ClpP蛋白酶复合物,其主要功能是清除或降解细菌胞内合... ClpP(Casein lytic proteinase P)是一种广泛存在于真核细胞和原核生物中的丝氨酸蛋白酶,可与多种类型AAA+(ATPase associated with various cellular activity)超家族ATP酶组成多种ClpP蛋白酶复合物,其主要功能是清除或降解细菌胞内合成不当、受损伤、变性聚集或无用的蛋白,并维持正常代谢和压力刺激下胞内蛋白质的动态平衡。近年研究表明,细菌ClpP可协助病原菌在宿主体内生存、繁殖和播散,ClpP在细菌致病过程中发挥重要作用,其相关致病机制也受到广泛关注。近年,细菌对抗生素耐药性不断增强,已严重威胁人类健康,ClpP蛋白酶因其独特的蛋白水解作用而成为抗菌药物研究的新靶点。本文综述了ClpP在不同病原体中的结构、分子功能和不同作用以及相应药物开发方面的研究进展。 展开更多

关键词 酪蛋白水解蛋白酶P(clpp) 蛋白降解 致病机制 酰基缩肽(ADEPs) 药物开发

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西瓜ClPP2C3克隆及表达分析

10

作者 朱毅 柳唐镜 +3 位作者 宫国义 张洁 王晋芳 张海英 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期243-249,共7页

【目的】蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2C,PP2C)是动植物中均存在的一类蛋白磷酸酶,拟探究其在西瓜果实成熟过程中发挥的重要作用。【方法】通过逆转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)从栽培类型西瓜... 【目的】蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2C,PP2C)是动植物中均存在的一类蛋白磷酸酶,拟探究其在西瓜果实成熟过程中发挥的重要作用。【方法】通过逆转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)从栽培类型西瓜‘97103’中克隆ClPP2C3,并对其进行生物信息学、表达模式和亚细胞定位分析。【结果】西瓜ClPP2C3的cDNA序列长度为1317 bp,编码438个氨基酸,其分子量大小为47.81 kD,蛋白质等电点为5.12。ClPP2C3包含1个PP2C保守结构域,与负调控果实成熟的番茄SlPP2C3、草莓FaABI1具有较高的同源性。西瓜ClPP2C3在细胞核表达。ClPP2C3在含糖量高的栽培品种中表达量显著高于含糖量低的野生品种。栽培品种ClPP2C3的2kb片段长度启动子活性显著高于野生品种,而1kb片段长度启动子活性之间无显著差异。【结论】由1-2kb区间SNP导致的启动子活性差异对不同含糖量品种ClPP2C3表达量存在影响。 展开更多

关键词 西瓜 clpp2C3 基因克隆 亚细胞定位 启动子活性差异分析

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一种新型ATP-依赖型ClpP家族蛋白质水解酶PlclpP基因的克隆、表达和酶学特性

11

作者 龚丽 李云霞 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第6期1424-1429,共6页

运用基因克隆技术,以分离鉴定获得的蛋白质水解酶高活性类芽孢杆菌(Paenibacillus lautus)CHN26菌株基因组DNA为模板,克隆鉴定了该菌株一种新型ATP-依赖型Clp P家族蛋白质水解酶Plclp P基因(585 bp),编码194个氨基酸,蛋白质分子量约为2.... 运用基因克隆技术,以分离鉴定获得的蛋白质水解酶高活性类芽孢杆菌(Paenibacillus lautus)CHN26菌株基因组DNA为模板,克隆鉴定了该菌株一种新型ATP-依赖型Clp P家族蛋白质水解酶Plclp P基因(585 bp),编码194个氨基酸,蛋白质分子量约为2.1×104。采用大肠杆菌(Eschericia coli)p ET表达系统,构建了Plclp P基因表达质粒p ET-28-Plclp P,并在大肠杆菌BL21中实现了重组Pl Clp P蛋白质的表达。利用组氨酸标签(His-tag)亲和纯化法,获得了Pl Clp P纯化蛋白质,发现Pl Clp P可能与宿主菌未知伴侣分子形成蛋白质复合物。Pl Clp P复合物具有ATP-依赖型酪蛋白水解酶活性,最适反应条件为40℃、p H7.0。表面活性剂强烈抑制Pl Clp P复合物的酶活,而常规丝氨酸蛋白酶抑制剂对其活性无抑制作用。 展开更多

关键词 clpp家族蛋白质水解酶 芽孢杆菌 基因克隆 基因表达 酶学特性

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一种新型ATP-依赖型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP基因的克隆、表达和酶学特性

12

作者 龚丽 李云霞 《江苏农业科学》 北大核心 2016年第5期47-50,共4页

运用基因克隆技术,以分离鉴定获得的蛋白水解酶高活性类芽孢杆菌(Paenibacillus lautus)CHN26菌株的基因组DNA为模板,经克隆鉴定该菌株是一种新型ATP-依赖型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP基因,全长585 bp,编码194个氨基酸,分子量约为21 ku... 运用基因克隆技术,以分离鉴定获得的蛋白水解酶高活性类芽孢杆菌(Paenibacillus lautus)CHN26菌株的基因组DNA为模板,经克隆鉴定该菌株是一种新型ATP-依赖型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP基因,全长585 bp,编码194个氨基酸,分子量约为21 ku。采用大肠杆菌(Eschericia coli)pET表达系统构建PlclpP基因表达质粒pET-28-PlclpP,并在大肠杆菌BL21中实现了重组PlClpP蛋白的表达。利用组氨酸标签(His-tag)亲和纯化法获得Pl ClpP纯化蛋白,发现Pl ClpP可能与宿主菌未知伴侣分子形成蛋白复合物。PlClpP复合物具有ATP-依赖型酪蛋白水解酶活性,最适反应温度为40℃、pH值7.0。表面活性剂强烈抑制PlClpP复合物的酶活性,而常规丝氨酸蛋白酶抑制剂对其活性没有抑制作用。本研究结果为蛋白酶新基因资源的开发、ClpP家族蛋白酶的基础理论和应用研究奠定了基础。 展开更多

关键词 clpp家族蛋白水解酶 类芽孢杆菌 基因 克隆 表达 酶学特性

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环境微生物样品真菌群落BIOLOG分析方法 被引量：12

13

作者 韩蕙 翟振华 +3 位作者 张燕燕 王晓丹 郑少奎 李艳红 《生态学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期2368-2373,共6页

利用BIOLOG YT、FF微孔板分别考察了4个真菌群落代谢活性及群落间的代谢相似性,并与聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)结构相似性分析对比试图探讨代谢相似性与结构相似性的内在联系,探讨了超低温冻存法作为样品保存手段对真... 利用BIOLOG YT、FF微孔板分别考察了4个真菌群落代谢活性及群落间的代谢相似性,并与聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)结构相似性分析对比试图探讨代谢相似性与结构相似性的内在联系,探讨了超低温冻存法作为样品保存手段对真菌群落特征BIOLOG分析结果的影响。结果表明:两种微孔板所反映的代谢相似性聚类分析结果完全不同,FF板所反映的代谢相似性聚类分析规律与PCR-DGGE提供的种群结构聚类分析规律一致;超低温冻存处理影响显著影响BIOLOGYT代谢活性(P=0.023)和BIOLOG FF多样性指数(H’)(P=0.041),但对两种微孔板所反映的其它指数如代谢活性、丰富度指数(S)、多样性指数(H’)分析结果均无显著性影响(P>0.05)。 展开更多

关键词 BIOLOG 真菌群落 clpps PCR-DGGE 超低温冻存

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Biolog法在环境微生物功能多样性研究中的应用 被引量：123

14

作者 田雅楠 王红旗 《环境科学与技术》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期50-57,共8页

微生物是生态系统的重要组成部分,它不仅要受到外界环境的影响,其自身的结构和功能变化也会对环境产生持续的作用,而这种作用主要是通过群落代谢功能差异来实现的,因此研究微生物群落功能多样性更能够揭示微生物与环境间相互作用的内在... 微生物是生态系统的重要组成部分,它不仅要受到外界环境的影响,其自身的结构和功能变化也会对环境产生持续的作用,而这种作用主要是通过群落代谢功能差异来实现的,因此研究微生物群落功能多样性更能够揭示微生物与环境间相互作用的内在机制。Biolog法是目前已知的研究微生物代谢功能多样性的很有力的方法。为了使该项技术在更大范围上得以推广,使其为环境微生物群落功能多样性分析更好的服务,为环境工作者进一步剖析环境与微生物间相关关系提供方法,该文从Biolog法应用原理、数据处理、在环境微生物群落功能多样性中的应用及存在的问题几方面对其进行了详细阐述。通过对应用现状的探讨本文得出应引起今后重视的研究方向,主要包括:探讨不同的数据处理方法以寻求更为适宜的数据处理方法、注重方法改进以期早日形成规范的操作流程、注重新领域应用的探索、针对特殊情况形成专用研究微平板等方面。 展开更多

关键词 微生物 功能多样性 BIOLOG clpp

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马铃薯连作栽培对土壤化感物质及微生物群落的影响 被引量：9

15

作者 杨桂丽 马琨 +2 位作者 卢斐 魏常慧 代晓华 《生态与农村环境学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期711-717,共7页

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分,长期连作严重影响了作物产量和品质,改变了土壤生态系统过程。试验以不同连作年限马铃薯和倒茬地根际土壤为材料,采用气相色谱和质谱联用技术以及群落水平生理活性(CLPPs)和磷脂脂肪酸(PLFAs)... 土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分,长期连作严重影响了作物产量和品质,改变了土壤生态系统过程。试验以不同连作年限马铃薯和倒茬地根际土壤为材料,采用气相色谱和质谱联用技术以及群落水平生理活性(CLPPs)和磷脂脂肪酸(PLFAs)生物标记法,对不同连作年限马铃薯根际土壤化学物质及微生物群落结构、功能进行研究。结果表明,连作马铃薯根际土壤乙酸乙酯浸提的酸、中、碱性相中都有质量分数高达50%左右的邻苯二甲酸二丁异酯和少量的顺式-14-二十九烯;和倒茬相比,长期连作根际土壤酯类、烯烃类和苯类物质都有明显的积累。随连作年限的延长,微生物群落利用碳源的能力呈现先增加后降低的趋势,连作4 a时最强;而连作10 a时微生物群落对主要碳源的利用能力总体较弱,以碳水化合物为碳源基质的微生物类群代谢能力显著降低;以碳水化合物、羧酸类化合物和氨基酸为代谢基质的微生物类群组成明显受到抑制。主要磷脂脂肪酸中,以16∶1、16∶0、18∶2ω6t和18∶1ω9c表征的PLFA含量较高,不同类型的PLFA含量随连作时间的增加呈现单峰型变化趋势,连作4 a时土壤微生物生物量最高;随着连作年限的增加,细菌/微生物群落生物量比值升高,而真菌/微生物群落生物量比值下降;倒茬种植明显改善了土壤主要微生物群落生物量及结构组成。长期连作产生的邻苯二甲酸二丁异酯及顺式-14-二十九烯积累,可能是导致马铃薯连作障碍的主要化感物质;这些化学物质显著改变了土壤微生物群落结构与功能,连作4 a可能是马铃薯连作栽培障碍的临界点。 展开更多

关键词 马铃薯 连作障碍 GC-MS分析 群落水平生理活性(clpps) 磷脂脂肪酸(PLFAs)

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结核分枝杆菌Rv2460c基因的克隆,表达及编码产物的免疫特性分析 被引量：1

16

作者 康月茜 张春燕 +3 位作者 穆柳青 卢楠 杨春 李岱容 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期790-794,共5页

目的:对结核分枝杆菌Rv2460c基因(编码Clp P2蛋白)进行克隆,表达,并评价其编码产物的免疫原性。方法:扩增结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)H37Rv的Rv2460c基因,构建重组质粒p ET32a(+)-Clp P2,用IPTG诱导表达,利用亲和层... 目的:对结核分枝杆菌Rv2460c基因(编码Clp P2蛋白)进行克隆,表达,并评价其编码产物的免疫原性。方法:扩增结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)H37Rv的Rv2460c基因,构建重组质粒p ET32a(+)-Clp P2,用IPTG诱导表达,利用亲和层析法进行纯化。用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白Clp P2的表达和鉴定。用生物信息学对Mtb Clp P2的免疫原性分析和表位预测。酶联免疫吸附法(ELISA)测定兔和TB病人血清anti-Clp P2滴度。结果:重组Clp P2蛋白酶在大肠杆菌中以包涵体形式表达,经bandscan软件分析纯化蛋白的纯度为93%。生物信息学分析Mtb Clp P2蛋白具有多个优势B细胞表位和T细胞表位。ELISA法测定兔抗血清效价为1∶64 000;检测肺结核病人血清中anti-Clp P2抗体水平高于健康对照人群。结论:成功纯化了重组蛋白Clp P2和制备了特异性兔抗Clp P2多克隆抗体,实验和信息学均表明Mtb Clp P2蛋白酶有较强的免疫原性。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 重组蛋白clpp2 免疫原性

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老化油泥处理过程中的微生物群落变化特征 被引量：3

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作者 王翔 张朝 +3 位作者 王世杰 汪群慧 李发生 郭观林 《环境科学研究》 EI CAS CSCD 北大核心 2012年第9期998-1004,共7页

通过在油田现场构建2个中试规模的生物堆(秸秆添加堆和对照堆)对老化油泥进行处理,运用BIOLOGTM系统对油泥中微生物群落水平的生理特性进行分析,测定其微生物代谢活性、代谢多样性及代谢特征差异性,以研究堆体各层次间微生物群落代谢特... 通过在油田现场构建2个中试规模的生物堆(秸秆添加堆和对照堆)对老化油泥进行处理,运用BIOLOGTM系统对油泥中微生物群落水平的生理特性进行分析,测定其微生物代谢活性、代谢多样性及代谢特征差异性,以研究堆体各层次间微生物群落代谢特征的变化规律.结果表明,与对照堆相比,秸秆添加堆的多项生理特性指标均得到显著提升,其中微生物代谢多样性指数变化范围由1.64～3.02升至2.83～3.29,并且表现出时间上的稳定性和空间层次间的均质性;在微生物碳源代谢特征的差异性分析中,对照堆各层次随时间推移表现出向其外层顺次变化的规律;油泥中总异养菌及石油烃降解菌的数量与环境温度关联性较强,石油烃降解菌的数量在试验末期取得峰值,达4.15×107CFU/g. 展开更多

关键词 老化油泥 生物堆 群落水平生理特性 总石油烃

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