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H3N2亚型猪流感病毒HA1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 被引量:1
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作者 司维 谭茜宇 +3 位作者 徐玲芸 罗廷荣 李晓宁 顾金燕 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第4期1739-1749,共11页
【目的】获得免疫原性良好的H3N2亚型猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)血凝素(haemagglutinin, HA)头部结构域HA1蛋白,并制备特异性多克隆抗体,用于HA1蛋白的鉴定及功能研究。【方法】本研究通过扩增A型SIV(A/swine/Guangdong/04... 【目的】获得免疫原性良好的H3N2亚型猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)血凝素(haemagglutinin, HA)头部结构域HA1蛋白,并制备特异性多克隆抗体,用于HA1蛋白的鉴定及功能研究。【方法】本研究通过扩增A型SIV(A/swine/Guangdong/04/2005(H3N2))毒株的HA1片段,采用同源重组方法构建原核表达载体pET-28a(+)-H3N2-HA1,经PCR和测序鉴定正确后将重组阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。对HA1蛋白表达条件(诱导温度、诱导时间、IPTG浓度)进行优化,通过镍柱亲和层析法纯化蛋白。将获得的重组蛋白与QuickAntibody-Mouse3W佐剂混合后以肌内注射方式免疫BALB/c小鼠,制备H3N2亚型SIV HA1蛋白多克隆抗体,并通过ELISA、Western blotting和免疫荧光试验(IFA)对多克隆抗体的效价、反应性及特异性进行鉴定。【结果】本研究成功构建原核表达载体pET-28a(+)-H3N2-HA1;H3N2亚型SIV HA1重组蛋白在1 mmol/L IPTG 26℃诱导10 h时表达量最高,且主要以包涵体形式表达,蛋白分子质量大小约为39.5 ku。成功制备5株H3N2亚型SIV HA1蛋白多克隆抗体,效价均为1∶1 638 400。Western blotting和IFA鉴定结果显示,制备的多克隆抗体可特异性识别真核表达的H3N2亚型SIV HA1蛋白,与H1N1亚型SIV、H7N9亚型禽流感病毒(AIV)等其他亚型流感病毒的HA1蛋白均不发生反应,具有良好的反应性及特异性。【结论】本研究成功表达并纯化了免疫原性良好的H3N2亚型SIV HA1蛋白,制备了反应性及特异性良好的鼠源多克隆抗体,为深入研究H3N2亚型SIV HA1蛋白的生物学功能提供了重要工具。 展开更多
关键词 猪流感病毒(SIV) H3N2亚型 HA1蛋白 原核表达 多克隆抗体
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基于新型昆虫杆状病毒flashBACTM表达系统表达鸭腺病毒3型Fiber-1蛋白
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作者 肖雅清 孟凯 +4 位作者 董雯雯 袁小远 李桂明 刘明超 翟向和 《山东农业科学》 北大核心 2025年第7期139-144,共6页
鸭腺病毒3型(DAdV-3)近些年来被多地报道,给我国的养禽业带来较大损失。纤突蛋白(Fiber)在介导鸭腺病毒感染和诱导体液免疫中发挥着重要作用。本研究基于昆虫杆状病毒flashBACTM表达系统对DAdV-3的Fiber-1蛋白进行重组表达,获得目的蛋... 鸭腺病毒3型(DAdV-3)近些年来被多地报道,给我国的养禽业带来较大损失。纤突蛋白(Fiber)在介导鸭腺病毒感染和诱导体液免疫中发挥着重要作用。本研究基于昆虫杆状病毒flashBACTM表达系统对DAdV-3的Fiber-1蛋白进行重组表达,获得目的蛋白。因该系统将LacZ基因整合到苜蓿银纹蛾核型多角体病毒(AcMNPV),重组后开启LacZ表达,其借助蓝白斑实现对阳性病毒的筛选,免除空斑筛选过程,大大节省实验时间;通过Western blot验证Fiber-1蛋白在昆虫Sf9细胞中成功表达。本研究结果可为深入探究Fiber-1蛋白在DAdV-3感染机制中的作用以及相关的生物制品制备奠定基础。 展开更多
关键词 昆虫杆状病毒表达系统 鸭腺病毒3型 蛋白表达 Fiber-1
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坦布苏病毒NS1蛋白的原核表达、生物信息学分析及鼠源多克隆抗体制备
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作者 李娜 林翠 +4 位作者 吴诚诚 张帆帆 谭佳 黄江南 李海琴 《南方农业学报》 北大核心 2025年第3期962-972,共11页
[目的]对坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)NS1蛋白进行生物信息学分析,原核表达NS1蛋白并制备鼠源NS1多克隆抗体,为TMUV检测及NS1蛋白功能研究提供理论基础。[方法]使用ProtParam、ProtScale、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、NetPhos 3.1、NetN... [目的]对坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)NS1蛋白进行生物信息学分析,原核表达NS1蛋白并制备鼠源NS1多克隆抗体,为TMUV检测及NS1蛋白功能研究提供理论基础。[方法]使用ProtParam、ProtScale、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、NetPhos 3.1、NetNGlyc-1.0、YinOYang-1.2、SOPMA、AlphaFold2等生物信息学软件分析NS1蛋白氨基酸组成、理论等电点、亲/疏水性、跨膜结构域、信号肽、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构。扩增NS1基因,构建重组质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞表达NS1蛋白。NS1蛋白经尿素处理后使用Ni^(2+)-NTA亲和层析纯化并浓缩,随后使用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。制备鼠源NS1多克隆抗体,建立间接ELISA检测方法,检测鼠源NS1多克隆抗体效价和特异性。[结果]生物信息学分析结果显示,NS1蛋白编码320个氨基酸残基,分子质量约36.1 kD,理论等电点8.24,为稳定的亲水性蛋白。NS1蛋白不存在跨膜结构域和信号肽,具有42个磷酸化位点(22个丝氨酸位点、17个苏氨酸位点和3个酪氨酸位点)和13个糖基化位点(3个N-糖基化位点和10个O-糖基化位点)。NS1蛋白二级结构中α-螺旋占21.88%,延伸链占25.00%,β-转角占11.87%,无规则卷曲占41.25%,NS1蛋白三级结构由2个结构域组成。成功构建原核表达载体pET-28a-NS1,经纯化后成功获得NS1蛋白。制备的鼠源NS1多克隆抗体经间接ELISA检测效价达1∶3276800,可用于TMUV的特异性检测和间接免疫荧光分析。[结论]NS1蛋白不含信号肽和跨膜结构域,为亲水性蛋白,适合在原核系统内表达。利用原核表达系统成功构建pET-28a-NS1,通过尿素变性及Ni~2+-NTA亲和层析纯化后得到纯度和生物学活性较高的NS1蛋白。成功制备效价高、特异性强的鼠源NS1多克隆抗体,可用于TMUV的特异性检测。 展开更多
关键词 坦布苏病毒 NS1蛋白 原核表达 多克隆抗体
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猪捷申病毒5型VP1蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立
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作者 邵永恒 倪民婷 +6 位作者 高梦玲 汤娇 张耕馨 林圣宇 刘光亮 陈佳宁 王雯慧 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第2期883-889,共7页
旨在建立针对猪捷申病毒(porcine teschovirus,PTV)5型的间接ELISA检测方法,为其防控提供物质储备。PTV是猪的一种急性、烈性病原,以高发病率和高致死率为主要特征。其临床表现包括脑炎、肺炎、繁殖障碍、心肌炎及腹泻等多种症状。但该... 旨在建立针对猪捷申病毒(porcine teschovirus,PTV)5型的间接ELISA检测方法,为其防控提供物质储备。PTV是猪的一种急性、烈性病原,以高发病率和高致死率为主要特征。其临床表现包括脑炎、肺炎、繁殖障碍、心肌炎及腹泻等多种症状。但该病原亚型众多,不同亚型间临床表现差异较大,且缺乏高效、特异的血清学检测方法,阻碍了对PTV-5的防治。本研究针对危害较大的PTV-5构建了pET-30a-VP1重组质粒,通过原核表达获得了VP1蛋白,以纯化的VP1为包被抗原,经条件优化成功建立了针对PTV-5的间接ELISA方法。该方法与常见猪源病毒标准阳性血清无交叉反应,最低检测稀释度为1∶3200,批内与批间变异系数均低于10%,具有良好的特异性、敏感性和重复性。利用该方法对东北地区279份临床样本进行检测,其阳性率为67.74%,与报道的流行情况相符。本研究建立的间接ELISA检测方法综合评价良好,为PTV-5的临床检测提供技术支持。 展开更多
关键词 猪捷申病毒 VP1蛋白 原核表达 间接ELISA
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口蹄疫病毒VP1蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
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作者 张芳源 杜文琪 +2 位作者 杨大为 李桂梅 单虎 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期82-90,共9页
为建立口蹄疫病毒(FMDV)快速、高效的血清学检测方法,根据GenBank收录的FMDV-O型国内流行株VP1基因(GenBank登录号:JN998085.1),构建重组质粒pCold TF-VP1,通过原核表达系统获得VP1蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达和反应... 为建立口蹄疫病毒(FMDV)快速、高效的血清学检测方法,根据GenBank收录的FMDV-O型国内流行株VP1基因(GenBank登录号:JN998085.1),构建重组质粒pCold TF-VP1,通过原核表达系统获得VP1蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达和反应原性后,将纯化后的蛋白作为抗原,建立FMDV抗体间接ELISA方法。结果显示,重组质粒成功转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,并以可溶性蛋白形式表达。建立的FMDV抗体间接ELISA方法其抗原包被最佳浓度0.5μg/mL,使用1%BSA溶液封闭效果最佳,血清最佳稀释度1∶600,酶标二抗最佳工作浓度1∶8000,且具有良好的特异性、灵敏性和重复性,与商品化试剂盒比较,符合率为90.2%。本试验在大肠杆菌中成功表达并纯化了FMDV的VP1蛋白,并建立了FMDV抗体间接ELISA方法,为口蹄疫的监测、诊断及试剂盒的开发提供了参考。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 VP1蛋白 原核表达 间接ELISA
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猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白1α原核表达及其多克隆抗体的制备
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作者 张铭芳 任佳慧 +4 位作者 张亚慈 位雪丹 申艾娟 张昂克 段红 《河南农业大学学报》 北大核心 2025年第5期838-848,共11页
【目的】制备非结构蛋白1α(non-structural protein 1α,NSP1α)多克隆抗体,为深入研究NSP1α蛋白功能提供物质基础,并为猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)防控靶点的选择提供新思路。【方法】... 【目的】制备非结构蛋白1α(non-structural protein 1α,NSP1α)多克隆抗体,为深入研究NSP1α蛋白功能提供物质基础,并为猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)防控靶点的选择提供新思路。【方法】以pCAGGS-NSP1α-HA质粒为模板,聚合酶链式反应扩增NSP1α基因,利用相关生物信息学在线软件分析PRRSV SD16毒株NSP1α基因和其他PRRSV毒株NSP1α基因序列同源性、蛋白的理化性质、氨基酸亲-疏水性、跨膜结构域、信号肽序列、磷酸化位点、二级和三级结构。通过EcoR I和Xho I酶切位点将NSP1α克隆至pET-28a-His原核表达载体。测序正确的pET-28a-NSP1α-His质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达感受态细胞,将诱导表达、纯化复性后的NSP1α蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,Western blot和间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)鉴定制备的多克隆抗体的反应原性,通过Western blot和激光共聚焦分析NSP1α蛋白亚细胞分布。【结果】信息学分析结果表明,SD16毒株NSP1α蛋白有501个氨基酸,为不稳定的疏水性蛋白,其序列与HLJ毒株序列同源性最高,与I型PRRSV序列同源性最低;NSP1α蛋白无信号肽序列,无跨膜结构域,存在13个磷酸化位点;二级结构主要包含α-螺旋、延伸链和无规则卷曲。将获得的高纯度并且有活性的NSP1α蛋白进行小鼠免疫,检测其血清抗体效价可达1∶64000。Western blot和IFA结果显示,制备的多克隆抗体特异性识别PRRSV NSP1α蛋白。Western blot和激光共聚焦结果显示,NSP1α蛋白主要定位在细胞核内。【结论】成功表达、纯化了PRRSV NSP1α蛋白并制备了鼠源多克隆抗体,该多克隆抗体与PRRSV NSP1α蛋白具有良好的反应活性和特异性。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 非结构蛋白1α 原核表达 多克隆抗体 生物学特性
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菠萝AcCAX1克隆及表达分析
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作者 陈金绘 姚艳丽 +8 位作者 王文波 谭丹 吴青松 贺军军 朱祝英 付琼 徐娟 李川玲 张秀梅 《山西农业大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第1期52-60,共9页
[目的]克隆鉴定菠萝Ca^(2+)/H^(+)反向转运蛋白AcCAX1,并对其全长序列和表达谱进行分析,可为该蛋白的功能研究奠定基础。[方法]利用PCR扩增和基因克隆技术获得AcCAX1的cDNA全长序列;通过生物信息学方法对该基因编码的氨基酸序列进行结... [目的]克隆鉴定菠萝Ca^(2+)/H^(+)反向转运蛋白AcCAX1,并对其全长序列和表达谱进行分析,可为该蛋白的功能研究奠定基础。[方法]利用PCR扩增和基因克隆技术获得AcCAX1的cDNA全长序列;通过生物信息学方法对该基因编码的氨基酸序列进行结构预测、序列比对和进化树分析;最后结合实时荧光定量PCR技术检测AcCAX1对不同离子、不同温度胁迫以及不同植物激素的响应。[结果]该基因开放阅读框为1428 bp,编码1个由475个氨基酸组成、相对分子质量50801.11 Da、理论等电点为6.24的稳定疏水蛋白。序列分析表明,AcCAX1氨基酸序列中包含11个典型的跨膜结构域,组成了2个保守的Ca^(2+)/H^(+)反向转运蛋白结构域。CAX1蛋白二级结构中α螺旋占比最大为58.74%,其次是无规则卷曲、延伸链和β-折叠,占比分别为21.68%、14.95%和4.63%。实时荧光定量PCR分析表明,AcCAX1的转录水平可以受外源CaCl2和NaCl诱导升高,受MnCl2处理降低。AcCAX1在菠萝老叶和茎中转录水平较高,在果实和花蕾中较低。烟草亚细胞定位结果显示,AcCAX1在细胞膜、细胞质以及细胞核中均存在表达。此外,AcCAX1启动子区域包含大量非生物胁迫响应元件,并且AcCAX1转录水平受4℃低温和37℃高温胁迫显著抑制。[结论]AcCAX1作为菠萝中Ca^(2+)/H^(+)反向转运蛋白,可能在菠萝非生物胁迫响应中发挥重要作用。 展开更多
关键词 菠萝 AcCAX1 Ca^(2+)/H^(+)反向转运蛋白 基因表达 胁迫响应
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H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白在昆虫细胞中的表达与鉴定
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作者 张洁 崔鹏飞 +10 位作者 张元成 邢鑫 王丛丛 颜成 王燕 陈源 朱春成 缪葭皓 陈素娟 邓国华 陈化兰 《中国家禽》 北大核心 2024年第11期40-44,共5页
研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的神经氨酸酶(NA)蛋白。试验为获得具有良好反应原性的NA蛋白,将H5N1亚型AIV(DK/YN/S4469/2022)密码子优化后的N1基因插入载体pFastBac1,构建的重组转移载体pFastBac1... 研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的神经氨酸酶(NA)蛋白。试验为获得具有良好反应原性的NA蛋白,将H5N1亚型AIV(DK/YN/S4469/2022)密码子优化后的N1基因插入载体pFastBac1,构建的重组转移载体pFastBac1-N1转化至DH10Bac感受态细胞,经过蓝白斑筛选获得阳性重组杆粒rBacmid-N1,然后将重组杆粒转染至sf9昆虫细胞,获得N1亚型重组杆状病毒。结果显示:N1重组蛋白在sf9昆虫细胞中正确表达,并且该重组蛋白具有良好的反应原性,能够与N1蛋白单克隆抗体3F3发生特异性反应,其仅能识别N1亚型鸡血清,特异性较好。研究成功制备了N1重组蛋白,为NA蛋白表达方法提供参考并为临床血清样品的N1抗体检测方法的建立奠定基础。 展开更多
关键词 禽流感病毒 杆状病毒表达系统 N1蛋白 血清抗体
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家榆UpNOA1的克隆及其互作蛋白的筛选
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作者 刘晓天 何毓琦 +1 位作者 刘畅 薛华 《生物技术通报》 北大核心 2025年第6期297-306,共10页
【目的】一氧化氮相关蛋白NOA1与植物体内NO水平有关,可能参与植物多种生理活动。克隆UpNOA1,分析其在家榆各组织中的表达情况,筛选与UpNOA1互作的蛋白,为研究家榆UpNOA1的功能提供依据。【方法】以家榆(Ulmus pumila L.)为试验材料,克... 【目的】一氧化氮相关蛋白NOA1与植物体内NO水平有关,可能参与植物多种生理活动。克隆UpNOA1,分析其在家榆各组织中的表达情况,筛选与UpNOA1互作的蛋白,为研究家榆UpNOA1的功能提供依据。【方法】以家榆(Ulmus pumila L.)为试验材料,克隆UpNOA1基因,运用生物信息学分析其结构域、进化树等,采用RT-qPCR分析UpNOA1的组织特异性表达情况。构建载体进行原核表达分析,获得纯化UpNOA1蛋白。利用His-PULL DOWN筛选并初步分析UpNOA1的互作蛋白。【结果】家榆UpNOA1编码区全长1698 bp,共编码565个氨基酸,包含1个保守的GTP/Mg2+结合位点。经预测,UpNOA1蛋白定位于叶绿体。UpNOA1蛋白与美国榆UaNOA1蛋白序列同源性最高。RT-qPCR分析发现,UpNOA1在叶片中表达量最高,种子次之。经HisPULL DOWN筛选,共获得131个UpNOA1互作蛋白,且与遗传信息处理相关的核糖体蛋白最多。经比对,有25个蛋白与抗逆和GTP相关。【结论】克隆获得UpNOA1,在叶片中表达量最高,种子次之。鉴定到131个UpNOA1互作蛋白,其中有25个蛋白与抗逆和GTP相关。 展开更多
关键词 家榆 NOA1 组织特异性表达 PULL DOWN 互作蛋白
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牛冠状病毒S1蛋白的真核表达及间接ELISA方法的建立与应用 被引量:2
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作者 黄金 李思远 +6 位作者 毛立 蔡旭航 谢玲玲 王府 周华 李基棕 李彬 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期2050-2060,共11页
为建立一种检测牛冠状病毒(BCoV)的抗体间接ELISA检测方法,本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达BCoV的S1蛋白,并作为包被抗原,建立BCoV的S1蛋白抗体间接ELISA检测方法,应用于临床样品检测。结果显示,S1蛋白大小约100 ku,可表达于昆虫Hi... 为建立一种检测牛冠状病毒(BCoV)的抗体间接ELISA检测方法,本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达BCoV的S1蛋白,并作为包被抗原,建立BCoV的S1蛋白抗体间接ELISA检测方法,应用于临床样品检测。结果显示,S1蛋白大小约100 ku,可表达于昆虫High5细胞培养基上清,经Western blot鉴定S1蛋白抗原性良好;经反应条件优化,确定抗原包被浓度为0.125μg·mL^(-1),血清稀释度为1∶200;采用1%明胶,于37℃封闭3 h;血清样品于37℃孵育30 min;酶标二抗的稀释度1∶25000,37℃孵育45 min;37℃避光显色13 min;临界值为0.297;经检验,该方法特异性良好;批间及批内变异系数均小于10%。当临界值为OD_(450 nm)为0.297时,若以IFA为标准,ELISA的敏感性为96.88%(31/32),特异性为87.50%(7/8),与IFA具有很强的一致性(κ=0.844,P<0.01);若以中和试验为标准,ELISA的敏感性为100.00%(31/31),特异性为88.89%(8/9),与血清中和试验具有很强的一致性(κ=0.925,P<0.01)。采用该方法对303份牛血清进行检测,BCoV阳性率为74.91%。由此说明,本研究建立的ELISA方法特异性强,敏感性高,重复性好,可用于BCoV的血清学调查和临床诊断,并可以应用于替代中和试验检测BCoV免疫后抗体水平。 展开更多
关键词 牛冠状病毒 昆虫杆状病毒表达系统 S1蛋白 间接ELISA
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蛋鸡CCND1基因真核表达载体的构建及在卵泡不同发育时期的时空表达模式研究
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作者 邹贤群 余静 +1 位作者 刘永杰 陈晓霞 《饲料研究》 北大核心 2025年第9期64-69,共6页
试验旨在探究细胞周期蛋白D1(CCND1)基因在蛋鸡卵泡不同发育时期的时空表达模式,进一步研究CCND1基因的分子生物学作用,构建真核表达载体,并预测CCND1基因在蛋鸡卵泡发育过程中的具体分子作用。选用150日龄海兰褐蛋鸡不同大小的卵泡为... 试验旨在探究细胞周期蛋白D1(CCND1)基因在蛋鸡卵泡不同发育时期的时空表达模式,进一步研究CCND1基因的分子生物学作用,构建真核表达载体,并预测CCND1基因在蛋鸡卵泡发育过程中的具体分子作用。选用150日龄海兰褐蛋鸡不同大小的卵泡为试验材料,运用半定量RT-PCR、免疫组化等技术,在分子水平上进行时空表达模式研究与分析。通过酶切位点BamH I和XhoI的双酶切验证连接产物的正确性后进行测序,将测序正确的真核表达载体转染至鸡卵巢的颗粒细胞,利用实时荧光定量PCR技术对转染效果进行确认。结果显示,卵泡直径为5~6 mm和6~7 mm的CCND1的mRNA表达量显著高于其他各卵泡(P<0.05)。在前等级卵泡的卵母细胞和间质中可以观察到CCND1蛋白定位。经过菌落PCR扩增和测序分析,成功构建了真核表达载体pYr-adshuttle-4-CCND1,并将其有效转染至鸡卵泡的颗粒细胞。研究表明,试验可推测CCND1基因在蛋鸡卵泡生长发育过程中发挥一定的作用,为未来的基因功能研究和潜在应用提供了必要的分子基础和工具支持。 展开更多
关键词 蛋鸡 细胞周期蛋白D1(CCND1) 卵泡 真核表达载体 时空表达
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表达鸡传染性贫血病毒VP1蛋白的新型重组血清4型禽腺病毒的构建 被引量:1
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作者 徐贞琦 蒋蕙如 +8 位作者 郭艺文 谢泉 殷楠 李拓凡 万志敏 邵红霞 秦爱建 张俊 叶建强 《中国家禽》 北大核心 2024年第4期47-53,共7页
为研制新型鸡传染性贫血(CIA)高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染问题,试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统,以血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为载体,构建表达CIAV VP1蛋白的重组FAdV-4。通过间接免疫荧光... 为研制新型鸡传染性贫血(CIA)高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染问题,试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统,以血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为载体,构建表达CIAV VP1蛋白的重组FAdV-4。通过间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验对重组病毒进行验证,通过体外病毒生长曲线来研究其复制效率。结果显示:该重组病毒构建成功,能有效表达CIAV VP1蛋白,命名为rFAdV-4-CIAV-VP1,且发现rFAdV-4-CIAV-VP1在LMH细胞中的复制效率远低于野生型FAdV-4。研究表明构建的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1为CIAV和FAdV-4的联防联控提供了二联候选疫苗株。 展开更多
关键词 鸡传染性贫血病毒 VP1蛋白 CRISPR-Cas9 重组血清4型禽腺病毒 表达
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非细胞毒性浓度AFB_(1)暴露下H1N1型猪流感病毒感染3D4/21细胞的蛋白质组分析
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作者 庞思瑶 张金龙 孙雨航 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第4期1947-1957,共11页
世界范围内普遍存在黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))污染,严重危害畜禽健康。目前,全世界超过34个国家和地区对畜禽饲料中AFB_(1)的含量制定了限量标准。然而,即使低于限量标准的AFB_(1)暴露仍具有促进某些病原微生物感染的... 世界范围内普遍存在黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))污染,严重危害畜禽健康。目前,全世界超过34个国家和地区对畜禽饲料中AFB_(1)的含量制定了限量标准。然而,即使低于限量标准的AFB_(1)暴露仍具有促进某些病原微生物感染的风险。因此,本研究以3D4/21细胞为模型,首先筛选对细胞无毒性的AFB_(1)浓度,然后使用蛋白转印和TCID50法分别检测猪流感病毒(swine influenza virus, SIV)的NP蛋白相对表达量和滴度,确定非毒性浓度AFB_(1)暴露对SIV复制的影响。接下来,应用蛋白质组学平台下的TMT技术检测SIV感染组和SIV+AFB_(1)共同处理组细胞之间的差异表达蛋白和富集通路,探索AFB_(1)促进SIV复制的可能机制。结果显示,0.01μg·mL^(-1)AFB_(1)对3D4/21细胞无细胞毒性,且能够显著促进SIV复制;TMT检测显示,与SIV感染组相比SIV+AFB_(1)共同处理组细胞中242个蛋白表达上调,327个蛋白表达下调;进一步通路富集分析筛选出影响AFB_(1)促进SIV复制的差异通路137条,前5名分别为蛋白酶体通路、坏死性凋亡通路、多物种细胞凋亡通路、军团杆菌病通路和药物代谢-其他酶通路。其中细胞凋亡相关通路可能是调控AFB_(1)促进SIV复制的关键性通路,随后的DAPI染色试验也证实了这一点。本研究将为早期预防和控制因AFB_(1)污染而加剧的SIV感染奠定基础,并为探讨其他感染性疾病增加的原因提供参考。 展开更多
关键词 黄曲霉毒素B_(1) H1N1 猪流感病毒 差异表达蛋白 细胞凋亡
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PC12细胞APE/ref-1cDNA的克隆和表达 被引量:3
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作者 谢振华 王爱民 +1 位作者 刘长振 马春 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期585-589,共5页
APE Ref 1是双功能核蛋白 ,它既能在碱基切除修复过程中切除脱嘌呤 脱嘌啶位点 ,又能促进包括AP 1、Myb和NF κB等受氧化还原调节的转录因子对DNA的结合 .从PC12细胞中抽提总RNA ,经逆转录PCR(RT PCR)扩增出APE ref 1cDNA并克隆到pQE3 ... APE Ref 1是双功能核蛋白 ,它既能在碱基切除修复过程中切除脱嘌呤 脱嘌啶位点 ,又能促进包括AP 1、Myb和NF κB等受氧化还原调节的转录因子对DNA的结合 .从PC12细胞中抽提总RNA ,经逆转录PCR(RT PCR)扩增出APE ref 1cDNA并克隆到pQE3 1表达质粒上的BamHⅠ和PstⅠ位点间 .经测序表明 ,PC12细胞的APE ref 1cDNA以正确的阅读框架重组进入表达质粒 ,表达重组质粒pQE3 1 APE在宿主菌BL2 1中得到稳定表达 .SDS PAGE鉴定表明 ,带 6个组氨酸的融合蛋白分子量为 3 8kD ,并经Ni NTA琼脂糖亲和纯化得到电泳纯融合蛋白 .Western印迹证明重组蛋白为APE ref 1融合蛋白 . 展开更多
关键词 PC12细胞 ape/ref-1 RT-PCR 克隆 表达 限速酶
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猪肠病毒G型部分VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
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作者 边金妮 黄诗婷 +7 位作者 许佳乐 米雪 王奕斐 杜琛 陈樱 韦祖樟 黄伟坚 欧阳康 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第3期178-182,共5页
本研究扩增猪肠病毒G型(EV-G)的部分VP1基因,将其克隆至原核表达载体,并对其进行诱导表达,获得重组蛋白并制备多克隆抗体,通过酶联免疫吸附试验,免疫印迹试验和间接免疫荧光试验对其进行验证。结果表明,本研究制备的兔抗EV-G-VP1多克隆... 本研究扩增猪肠病毒G型(EV-G)的部分VP1基因,将其克隆至原核表达载体,并对其进行诱导表达,获得重组蛋白并制备多克隆抗体,通过酶联免疫吸附试验,免疫印迹试验和间接免疫荧光试验对其进行验证。结果表明,本研究制备的兔抗EV-G-VP1多克隆抗体具有良好的免疫原性和反应性,可以特异性识别EV-G感染Marc-145细胞表达的VP1蛋白,为猪肠病毒G型免疫学检测方法的建立提供良好的生物学材料。 展开更多
关键词 猪肠病毒G型 部分VP1蛋白 原核表达 多克隆抗体
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H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化
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作者 屈小天 王雅楠 +4 位作者 许倩茹 李雪洋 张申立 张二芹 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2024年第3期125-132,共8页
为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将... 为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-HA通过电转化法导入根癌农杆菌EHA105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DNA,PCR鉴定结果显示,HA基因已插入到水稻基因组中,重组HA基因大小为4660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组HA蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组HA蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组HA蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了H5N1亚型禽流感病毒HA重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组HA蛋白。 展开更多
关键词 H5N1亚型禽流感病毒 HA蛋白 水稻胚乳表达 蛋白质纯化
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APE/Ref-1蛋白与脑缺血/再灌注神经元损伤 被引量:1
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作者 汪效松 李智文 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第12期1695-1699,共5页
Cerebral ischemia and the aftermath of reperfusion form a hypoxic/hyperoxic sequence of events that can trigger DNA damage in neurons of central nervous system. Neuronal apoptosis will happen without immediate DNA rep... Cerebral ischemia and the aftermath of reperfusion form a hypoxic/hyperoxic sequence of events that can trigger DNA damage in neurons of central nervous system. Neuronal apoptosis will happen without immediate DNA repair. APE/Ref-1 is a multifunctional protein involoved in DNA base excision repair pathway and in redox reguiation of DNA-binding activity of AP-1 family members, which may play an important role in protection of postischemic neuronal damage. 展开更多
关键词 ape/ref-1蛋白 脑缺血 神经元 DNA损伤 DNA修复
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马疱疹病毒1型ORF2蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
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作者 杨贤斌 吴桂灵 +5 位作者 撒瑞雪 杨凯舒 张嗣玉 齐晋卫 李银涛 刘建华 《现代畜牧兽医》 2024年第6期1-5,共5页
研究旨在克隆马疱疹病毒1型(EHV-1)ORF2基因,通过大肠杆菌原核表达系统获得ORF2蛋白,制备多克隆抗体。根据EHV-1 YM2019株全基因组序列(GenBank:MT063054)设计1对引物,将ORF2基因克隆至pET-28a-ORF2原核表达载体中,通过Transetta(DE3)... 研究旨在克隆马疱疹病毒1型(EHV-1)ORF2基因,通过大肠杆菌原核表达系统获得ORF2蛋白,制备多克隆抗体。根据EHV-1 YM2019株全基因组序列(GenBank:MT063054)设计1对引物,将ORF2基因克隆至pET-28a-ORF2原核表达载体中,通过Transetta(DE3)感受态细胞,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达ORF2蛋白,使用Ni-NTA琼脂糖纯化树脂纯化,免疫BALB/c小鼠,检测多克隆抗体的效价和特异性。结果显示:ORF2基因成功克隆至原核表达载体pET-28a中,并通过大肠杆菌表达系统得到ORF2蛋白,大小约为38 ku,以包涵体的形式存在。通过Ni-NTA纯化树脂获得纯度较高的重组蛋白,能够与EHV-1阳性血清特异性结合;间接ELISA方法检测多克隆抗体的效价为1∶64000,RK-13表达的ORF2蛋白可被多克隆抗体能特异性识别。研究表明,大肠杆菌表达的ORF2重组蛋白具有良好反应原性,ORF2蛋白制备的多克隆抗体效价高、特异性强,可为ORF2蛋白的生物学功能和基因缺失疫苗的研究奠定基础。 展开更多
关键词 马疱疹病毒1 ORF2蛋白 原核表达 多克隆抗体制备
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马疱疹病毒1型UL56蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
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作者 张玉鉴 撒瑞雪 +7 位作者 吴桂灵 杨凯舒 张嗣玉 李银涛 齐晋卫 杨贤斌 邓智超 刘建华 《现代畜牧科技》 2024年第4期1-6,共6页
为制备马疱疹病毒1型(EHV-1)UL56蛋白(pUL56)的多克隆抗体。该研究根据GenBank中EHV-1 YM2019株全基因组序列,采用Ni-NTA亲和层析纯化蛋白,与弗氏佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠并制备pUL56多克隆抗体,经Western blot与间接ELISA试验测定多... 为制备马疱疹病毒1型(EHV-1)UL56蛋白(pUL56)的多克隆抗体。该研究根据GenBank中EHV-1 YM2019株全基因组序列,采用Ni-NTA亲和层析纯化蛋白,与弗氏佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠并制备pUL56多克隆抗体,经Western blot与间接ELISA试验测定多克隆抗体反应性。结果显示,纯化后的pUL56可以与EHV-1阳性血清发生反应;pUL56多克隆抗体的效价为1∶128 000,并能与pUL56特异性结合。本研究成功制备具有良好反应性的pUL56多克隆抗体,为pUL56功能特性及EHV-1致病机制的研究奠定理论基础。 展开更多
关键词 马疱疹病毒1 UL56蛋白 原核表达 多克隆抗体
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H9亚型禽流感病毒M1蛋白原核表达及免疫效果初步研究
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作者 李小凤 谢芝勋 +11 位作者 阮志华 李孟 李丹 张民秀 谢志勤 罗思思 韦悠 谢丽基 曾婷婷 张艳芳 黄娇玲 王盛 《动物医学进展》 北大核心 2024年第6期1-6,共6页
旨在原核表达H9亚型禽流感病毒(AIV)M1蛋白,初步探究其免疫效果,为研制AIV疫苗奠定基础。通过构建重组质粒pET-32a-M1,诱导表达,Western blot验证蛋白表达情况,将重组蛋白免疫接种小鼠,通过测定血清中IgG抗体效价,脾细胞培养上清多细胞... 旨在原核表达H9亚型禽流感病毒(AIV)M1蛋白,初步探究其免疫效果,为研制AIV疫苗奠定基础。通过构建重组质粒pET-32a-M1,诱导表达,Western blot验证蛋白表达情况,将重组蛋白免疫接种小鼠,通过测定血清中IgG抗体效价,脾细胞培养上清多细胞因子分泌情况评价其免疫效果。结果显示,M1重组蛋白主要以可溶性蛋白存在,Western blot结果可见特异性条带。免疫接种小鼠后,血清产生IgG抗体,抗体效价为1∶30000。小鼠脾细胞上清液IL-2、IL-4、IL-6与对照组相比较,含量显著增加(P<0.01),而抑制IL-1β、IL-5、IL-13、IL-12p70、IL-18、GM-CMF、IFN-γ、TNF-α分泌。结果表明,M1重组蛋白免疫原性良好,刺激机体产生体液免疫和细胞免疫,为禽流感疫苗深入研究奠定了基础。 展开更多
关键词 禽流感 M1蛋白 原核表达 免疫效果
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