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高表达GFP-PBP1b融合蛋白的猪链球菌菌株的构建及PBP1b蛋白细胞定位的研究
被引量：
1
1
作者
武柳君
卫东
+3 位作者
高广娟
陈平
刘思国
张跃灵
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第11期1101-1107,共7页
为鉴定猪链球菌(Streptococcus suis)A型青霉素结合蛋白PBP1b在S.suis中的细胞定位,本研究经PCR扩增S.suis pbp1b基因融合位点上下游序列UP和DN、强启动子Peno基因片段及绿色荧光蛋白(GFP)gfp基因片段,再通过重叠延伸PCR扩增构建融合片...
为鉴定猪链球菌(Streptococcus suis)A型青霉素结合蛋白PBP1b在S.suis中的细胞定位,本研究经PCR扩增S.suis pbp1b基因融合位点上下游序列UP和DN、强启动子Peno基因片段及绿色荧光蛋白(GFP)gfp基因片段,再通过重叠延伸PCR扩增构建融合片段UP-Peno-GFP-DN。利用同源重组的方法将UP-Peno-GFP-DN转化含反向筛选标记的PSS-pbp1b中间菌株,经含7%蔗糖的TSAS平板筛选,挑单菌落进行PCR及测序鉴定。PCR及测序鉴定结果显示,获得的重组菌株中Peno-gfp片段替换了PSS-pbp1b中的PSS片段,表明融合强启动子Peno、GFP及PBP1b(GFP-PBP1b)的重组菌株P-GFP-pbp1b正确构建。以S.suis 05ZYH33株和本实验室前期构建的GFP-pbp1b为对照,培养P-GFP-pbp1b菌株并测定OD600nm值,绘制各菌株的生长曲线;采用western blot检测P-GFP-pbp1b菌株中GFP-PBP1b融合蛋白的表达水平,并与GFP-pbp1b菌株进行比较;利用Alexa Fluor 633-WGA染色,经超高分辨显微镜观察GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b菌株形态及GFP-PBP1b融合蛋白在S.suis细胞中的定位。生长曲线结果显示,S.suis融合菌株GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b均正常生长;western blot结果显示,GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b菌株均能够表达GFP-PBP1b融合蛋白,但强启动子驱动的P-GFP-pbp1b菌株中GFP-PBP1b蛋白表达量较GFP-pbp1b菌株提高了6倍(P<0.01);超高分辨显微镜观察结果显示,GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b菌株形态均正常,GFP-pbp1b菌株中GFP荧光较弱,难以定位GFP-PBP1b,而P-GFP-pbp1b菌株中GFP荧光较强,能够明显观察到融合蛋白GFP-PBP1b定位在S.suis的细胞横隔和两极。本研究通过构建高表达GFP-PBP1b融合蛋白的P-GFP-pbp1b菌株首次观察到PBP1b在S.suis中的细胞定位,为进一步研究PBP1b在S.suis细胞壁肽聚糖合成中的作用奠定了基础。
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关键词
猪链球菌
荧光
蛋白
融合菌株
a型青霉素结合蛋白
PBP1b
细胞壁肽聚糖合成
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职称材料
题名
高表达GFP-PBP1b融合蛋白的猪链球菌菌株的构建及PBP1b蛋白细胞定位的研究
被引量：
1
1
作者
武柳君
卫东
高广娟
陈平
刘思国
张跃灵
机构
新疆农业大学动物医学学院
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/动物细菌病创新团队
出处
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第11期1101-1107,共7页
基金
国家重点研发计划(2021YFD1800401)
国家自然科学基金(32172853)
中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1610302022001)。
文摘
为鉴定猪链球菌(Streptococcus suis)A型青霉素结合蛋白PBP1b在S.suis中的细胞定位,本研究经PCR扩增S.suis pbp1b基因融合位点上下游序列UP和DN、强启动子Peno基因片段及绿色荧光蛋白(GFP)gfp基因片段,再通过重叠延伸PCR扩增构建融合片段UP-Peno-GFP-DN。利用同源重组的方法将UP-Peno-GFP-DN转化含反向筛选标记的PSS-pbp1b中间菌株,经含7%蔗糖的TSAS平板筛选,挑单菌落进行PCR及测序鉴定。PCR及测序鉴定结果显示,获得的重组菌株中Peno-gfp片段替换了PSS-pbp1b中的PSS片段,表明融合强启动子Peno、GFP及PBP1b(GFP-PBP1b)的重组菌株P-GFP-pbp1b正确构建。以S.suis 05ZYH33株和本实验室前期构建的GFP-pbp1b为对照,培养P-GFP-pbp1b菌株并测定OD600nm值,绘制各菌株的生长曲线;采用western blot检测P-GFP-pbp1b菌株中GFP-PBP1b融合蛋白的表达水平,并与GFP-pbp1b菌株进行比较;利用Alexa Fluor 633-WGA染色,经超高分辨显微镜观察GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b菌株形态及GFP-PBP1b融合蛋白在S.suis细胞中的定位。生长曲线结果显示,S.suis融合菌株GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b均正常生长;western blot结果显示,GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b菌株均能够表达GFP-PBP1b融合蛋白,但强启动子驱动的P-GFP-pbp1b菌株中GFP-PBP1b蛋白表达量较GFP-pbp1b菌株提高了6倍(P<0.01);超高分辨显微镜观察结果显示,GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b菌株形态均正常,GFP-pbp1b菌株中GFP荧光较弱,难以定位GFP-PBP1b,而P-GFP-pbp1b菌株中GFP荧光较强,能够明显观察到融合蛋白GFP-PBP1b定位在S.suis的细胞横隔和两极。本研究通过构建高表达GFP-PBP1b融合蛋白的P-GFP-pbp1b菌株首次观察到PBP1b在S.suis中的细胞定位,为进一步研究PBP1b在S.suis细胞壁肽聚糖合成中的作用奠定了基础。
关键词
猪链球菌
荧光
蛋白
融合菌株
a型青霉素结合蛋白
PBP1b
细胞壁肽聚糖合成
Keywords
Streptococcus suis
fluorescent protein fusion strain
penicillin-binding protein
PBP1b
cell wall peptidoglycan synthesis
分类号
S852.61 [农业科学—基础兽医学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
高表达GFP-PBP1b融合蛋白的猪链球菌菌株的构建及PBP1b蛋白细胞定位的研究
武柳君
卫东
高广娟
陈平
刘思国
张跃灵
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023
1
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