A型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法的建立 被引量：9

1

作者 孙雨 宋晓晖 +7 位作者 王睿男 李秀梅 肖颖 任雪建 李晓霞 魏巍 杨林 王传彬 《动物医学进展》 北大核心 2020年第8期29-36,共8页

为建立动物血清中的A型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法,通过获得的A型口蹄疫病毒VP1融合蛋白与相关单克隆抗体建立了A型口蹄疫病毒抗体竞争化学发光检测试剂盒。该方法能够特异性的定量检测猪、牛、羊血清中的A型口蹄疫病毒VP... 为建立动物血清中的A型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法,通过获得的A型口蹄疫病毒VP1融合蛋白与相关单克隆抗体建立了A型口蹄疫病毒抗体竞争化学发光检测试剂盒。该方法能够特异性的定量检测猪、牛、羊血清中的A型口蹄疫病毒VP1蛋白抗体,敏感性高,特异性强,对其他相关的偶蹄类动物病原无交叉反应,批内变异系数小于10%,批间变异系数小于15%,具有良好的重复性。对该方法的特异性指标和敏感性指标进行了验证,同国产的A型口蹄疫抗体检测试剂盒进行了比较,阳性样品符合率为92.63%,阴性样品符合率为93.98%,总符合率为93.17%。建立的A型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法,特异性高,敏感性强,操作简单、快速,具有较高的应用推广价值。 展开更多

关键词 a型口蹄疫病毒 化学发光 免疫分析 检测方法

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A型口蹄疫病毒VP1蛋白间接ELISA检测方法的建立 被引量：6

2

作者 卢清侠 刘畅 +4 位作者 郭官鹏 邢广旭 刘运超 邓瑞广 张改平 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期30-35,共6页

以原核表达经纯化复性制备的A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白代替传统病毒抗原包被,建立快速、安全、有效的A型FMDV抗体ELISA检测方法。对前期制备的A型VP1蛋白进行Western-Blot检测,结果表明,VP1蛋白能够特异性识别A型FMDV阳性牛血清,可作... 以原核表达经纯化复性制备的A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白代替传统病毒抗原包被,建立快速、安全、有效的A型FMDV抗体ELISA检测方法。对前期制备的A型VP1蛋白进行Western-Blot检测,结果表明,VP1蛋白能够特异性识别A型FMDV阳性牛血清,可作为检测抗原建立检测A型FMDV抗体的方法。以最佳质量浓度1mg/L VP1蛋白为检测抗原,方阵滴定法确定最佳检测血清稀释度为1∶50[V(血清)∶V(封闭液)],最佳的酶标二抗稀释度为1∶2 000[V(酶标二抗)∶V(封闭液)],建立A型FMDV抗体ELISA检测方法。该方法的敏感性为94.32%,特异性为99.09%,批内与批间重复试验变异系数均小于8%。采用该方法检测201份临床血清,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达92.54%。研制的VP1-ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控A型口蹄疫抗体水平。 展开更多

关键词 a型口蹄疫病毒 VP1蛋白 间接ELISA

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A型口蹄疫病毒VP1蛋白竞争ELISA检测方法的初步建立 被引量：3

3

作者 颜健华 何奇松 +7 位作者 蒋家霞 冯淑萍 黄胜斌 胡巧云 易春华 许瑞胜 梁晟 熊毅 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第5期2268-2272,共5页

用纯化的融合蛋白p GEX-6p-1-VP1作为包被抗原,4E12单抗为检测抗体与待检血清竞争固相抗原,建立了单抗竞争ELISA方法来检测口蹄疫A型抗体,并进行了反应条件的优化,确定阴阳临界值。结果表明,抗原最适包被浓度为0.625μg/m L,待检血清稀... 用纯化的融合蛋白p GEX-6p-1-VP1作为包被抗原,4E12单抗为检测抗体与待检血清竞争固相抗原,建立了单抗竞争ELISA方法来检测口蹄疫A型抗体,并进行了反应条件的优化,确定阴阳临界值。结果表明,抗原最适包被浓度为0.625μg/m L,待检血清稀释度为1∶2,单抗最大稀释度为1∶400,酶标抗体工作浓度为1∶5000,封闭液、待检血清和单抗作用时间分别为60、60、45 min;阴阳性判断抑制率(PI)≥30%为阳性。与液相阻断ELISA检测试剂盒比对,符合率为84.8%。试验表明,建立的单抗竞争ELISA检测方法具有特异性强、稳定性好等优点,可用于口蹄疫A型血清抗体的检测,这为口蹄疫A型免疫抗体水平检测、疫情监控及流行病学调查提供了技术平台。 展开更多

关键词 a型口蹄疫病毒 VP1蛋白 竞争ELISA

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A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达·纯化及活性检测 被引量：4

4

作者 李菁 林彤 +4 位作者 高闪电 丛国正 独军政 邵军军 常惠芸 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2010年第10期5248-5250,共3页

[目的]表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1,并对其进行纯化和相关活性的检测。[方法]以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组质粒pGEM-VP1为模板,用特异性表达引物扩增其编码区,经酶切后与pGEX-4T-1、pPROExHTb等原核表达载体相连,转化大肠杆菌BL21(DE3... [目的]表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1,并对其进行纯化和相关活性的检测。[方法]以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组质粒pGEM-VP1为模板,用特异性表达引物扩增其编码区,经酶切后与pGEX-4T-1、pPROExHTb等原核表达载体相连,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达菌株,经IPTG诱导表达,以实现VP1蛋白的表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并对2种载体重组菌进行超声裂解,取上清和沉淀电泳,用金属螯合亲合层析法对His-VP1进行纯化。[结果]SDS-PAGE电泳分析显示pPRO-VP1诱导后目的条带为33ku,与预期结果相符;目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带;His-VP1可与A型口蹄疫病毒豚鼠灭活阳性血清发生特异性的反应。[结论]表达及纯化了具有高特异性的A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1,为深入研究结构蛋白VP1在口蹄疫病毒致病机制中的作用奠定了基础。 展开更多

关键词 a型口蹄疫病毒 结构蛋白VP1 表达及纯化

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A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达纯化及活性检测 被引量：2

5

作者 刘畅 卢清侠 +5 位作者 杨继飞 王世红 王寅彪 郭官鹏 邓瑞广 张改平 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期7-12,共6页

为获得具有活性的A型FMDV VP1蛋白,以A型vp1重组质粒pMD19T-A-vp1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV vp1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET28a连接,构建重组质粒pET-Avp1。经IPTG诱导表达含重组质粒pET-A-vp1的E.coli BL21(DE3)菌后,... 为获得具有活性的A型FMDV VP1蛋白,以A型vp1重组质粒pMD19T-A-vp1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV vp1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET28a连接,构建重组质粒pET-Avp1。经IPTG诱导表达含重组质粒pET-A-vp1的E.coli BL21(DE3)菌后,SDS-PAGE显示VP1蛋白以包涵体形式获得高效表达,蛋白分子质量约为29ku。通过对IPTG浓度及诱导时间进行优化,结果表明,在37℃条件下,IPTG终浓度为0.3mmol/L,诱导表达6h后,VP1蛋白的表达量最大。Western-Blot分析表明,VP1重组蛋白能够被A型口蹄疫阳性血清特异性识别。ELISA检测结果显示,VP1包涵体蛋白经洗涤纯化,尿素浓度梯度透析复性后具有较高的活性。 展开更多

关键词 a型口蹄疫病毒 VP1蛋白 原核表达 蛋白纯化 活性鉴定

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A型口蹄疫病毒型特异性抗原的可溶性原核表达及多克隆抗体的制备 被引量：1

6

作者 高闪电 常惠芸 +3 位作者 独军政 丛国正 邵军军 林彤 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期821-824,共4页

目的可溶性表达A型口蹄疫病毒型特异性结构蛋白VP1,制备型特异性的兔抗A型FMDV VP1多克隆抗体。方法以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因重组克隆载体pGEM-AVP1为模板,设计表达引物,经PCR扩增获得上游带有OmpT信号肽编码序列的VP1基因编码区... 目的可溶性表达A型口蹄疫病毒型特异性结构蛋白VP1,制备型特异性的兔抗A型FMDV VP1多克隆抗体。方法以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因重组克隆载体pGEM-AVP1为模板,设计表达引物,经PCR扩增获得上游带有OmpT信号肽编码序列的VP1基因编码区,将其克隆至该表达载体pET-30a(+)中,构建可溶性原核表达载体pET-30a-OmpT-AVP1。将该重组质粒转化大肠杆菌工程菌株BL21-(DE3)-plysS,经IPTG诱导表达,以金属离子螯合层析法对可溶性表达的VP1融合蛋白进行纯化,然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,以ELISA、Western blot和间接免疫荧光法分别对多克隆抗体进行鉴定。结果 SDS-PAGE电泳分析显示pET-30a-OmpT-AVP1重组菌经诱导后表达一Mr约为33 000的VP1融合蛋白,与预期结果相符。目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带。Western blot分析结果显示,VP1蛋白可与豚鼠抗A型口蹄疫病毒阳性血清反应。用纯化VP1蛋白免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12 800以上,具有较高的型特异性,并且可与同型FMDV细胞培养物中的病毒抗原发生反应。结论制备了具有高亲和性和特异性的兔抗A型FMDV结构蛋白VP1多克隆抗体,为A型FMDV易感动物的抗体筛查及病原鉴定奠定了基础。 展开更多

关键词 a型口蹄疫病毒 结构蛋白VP1 原核表达 可溶性 OmpT信号肽

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A型口蹄疫病毒VP3基因的克隆及原核表达 被引量：1

7

作者 刘航 杨晓燕 +3 位作者 刘明 赵海波 郭华花 田永强 《江苏农业科学》 CSCD 北大核心 2012年第6期33-35,共3页

从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT-PCR获得cDNA。并根据FM-DV全基因组序列设计了1对针对VP3基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP3并亚克隆入pMD 18-T载体。将鉴定出的阳性质粒和表达载体PET32a用BamHⅠ、H... 从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT-PCR获得cDNA。并根据FM-DV全基因组序列设计了1对针对VP3基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP3并亚克隆入pMD 18-T载体。将鉴定出的阳性质粒和表达载体PET32a用BamHⅠ、HindⅢ双酶切回收后连接,获得阳性重组质粒PET32-VP3。用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP3,并用SDS-PAGE进行检测,表达产物用镍亲和树脂进行纯化。结果证明口蹄疫病毒VP3蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步研究提供了重要的材料。 展开更多

关键词 a型口蹄疫病毒 VP3基因 克隆 原核表达

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A型口蹄疫病毒多肽抗原表位的原核表达及多克隆抗体的制备 被引量：1

8

作者 程凯慧 沈付娆 +5 位作者 邹积振 苗自利 解晓莉 张亮 杨宏军 何洪彬 《江苏农业科学》 2019年第8期184-187,共4页

为构建A型口蹄疫病毒多肽抗原表位的原核表达载体,并制备多克隆抗体,利用基因合成技术将不同株的A型口蹄疫病毒抗原表位A-A10-61-VP1(第141～160位氨基酸)、A-A10-61-VP1(第200～212位氨基酸)、A22Iraq-VP1(第136～164位氨基酸)串联,在... 为构建A型口蹄疫病毒多肽抗原表位的原核表达载体,并制备多克隆抗体,利用基因合成技术将不同株的A型口蹄疫病毒抗原表位A-A10-61-VP1(第141～160位氨基酸)、A-A10-61-VP1(第200～212位氨基酸)、A22Iraq-VP1(第136～164位氨基酸)串联,在其间引入合适的linker序列,重组得到pET-28a(+)质粒中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体。成功构建了A型口蹄疫病毒抗原表位原核表达载体,获得高纯度重组蛋白和含A型口蹄疫病毒抗体的兔抗血清,为A型口蹄疫病毒诊断试剂盒的研发和A型口蹄疫病毒表位多肽疫苗的研究奠定基础。 展开更多

关键词 a型口蹄疫病毒 抗原表位 重组蛋白 多肽疫苗

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抗A型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测方法的建立 被引量：4

9

作者 孙静 周国辉 +3 位作者 王幸 李超斯 魏萍 于力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期146-150,共5页

为建立A型口蹄疫病毒(FMDV)病原学诊断方法,本研究应用纯化的A型FMDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得一株稳定分泌单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株5F7。经IFA特异性鉴定,5F7为一株血清型特异性MAb。亚类为IgG1/κ。间... 为建立A型口蹄疫病毒(FMDV)病原学诊断方法,本研究应用纯化的A型FMDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得一株稳定分泌单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株5F7。经IFA特异性鉴定,5F7为一株血清型特异性MAb。亚类为IgG1/κ。间接ELISA检测杂交瘤细胞上清和腹水抗体效价分别为1∶12 800和1∶105。硫氰酸盐洗脱法测定其相对亲和力常数为1.5 mol/L。应用该A型特异性MAb及实验室已制备的MAb 3D9初步建立了检测A型FMDV的抗原捕获ELISA方法。该方法可以检出2.0 ng纯化FMDV和1.0×104TCID50病毒,与O型、Asia1型FMDV及牛肠道病毒、牛呼肠孤病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,组内及组间重复性试验显示变异系数小于8%。本研究建立的抗原捕获ELISA方法为A型FMDV抗原检测提供了一种实用有效的技术手段。 展开更多

关键词 a型口蹄疫病毒 单克隆抗体 抗原捕获ELISA

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表达A型口蹄疫病毒衣壳蛋白重组腺病毒的构建 被引量：3

10

作者 宋姗姗 王海伟 +1 位作者 周国辉 于力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期262-265,共4页

为构建表达A型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组腺病毒,本研究通过人工合成A型FMDVP1-2A、2B和3C融合基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,利用E.coli BJ5183内同源重组将目的基因插入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1中,获得携带A型FMD... 为构建表达A型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组腺病毒,本研究通过人工合成A型FMDVP1-2A、2B和3C融合基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,利用E.coli BJ5183内同源重组将目的基因插入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1中,获得携带A型FMDV P1-2A-2B-3C基因的重组AdEasy-1。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞,获得重组腺病毒rAd-A09。经PCR检测,该重组腺病毒在传代过程中目的基因稳定存在,病毒滴度在第8代时可达到108.5TCID50/mL。间接免疫荧光检测和western blot分析表明,rAd-A09在AD-293细胞中产生FMDV的结构蛋白VP0、VP1和VP3。该重组腺病毒的构建为口蹄疫新型疫苗的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 a型口蹄疫病毒 重组腺病毒 衣壳蛋白

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A型与亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒嵌合基因在家蚕杆状病毒载体中的表达 被引量：2

11

作者 刘航 田永强 +2 位作者 张韵 李志勇 柳纪省 《江苏农业科学》 CSCD 北大核心 2012年第9期28-31,共4页

口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进A型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取A型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因中的VP1和VP3以及亚洲Ⅰ型蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建... 口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进A型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取A型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因中的VP1和VP3以及亚洲Ⅰ型蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法检测血淋巴中的表达产物,结果显示目的蛋白在感染病毒后108 h的蚕血淋巴中表达量最高,A型抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1 024,而亚洲Ⅰ型抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为2 048。结果表明A型和亚洲Ⅰ型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达。 展开更多

关键词 a型口蹄疫病毒 基因工程疫苗 P1—2A3C基因 家蚕杆状病毒表达系统

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口蹄疫A型病毒AF/72株标准细胞毒株的研制 被引量：1

12

作者 杜进鑫 王永录 +5 位作者 张永光 方玉珍 蒋守田 吕建亮 潘丽 刘力宽 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2009年第3期74-77,共4页

用口蹄疫A型病毒AF/72株的第3代乳鼠组织毒,通过乳鼠继续适应3代后,转适BHK-21细胞,获得该毒株的细胞毒AF/72/MF6/BF12,经测定其TCID50为10-8.0/mL;经RT-PCR获得其VP1基因序列,并与GenBank中的其他6株口蹄疫A型病毒株比对,同源性均大于8... 用口蹄疫A型病毒AF/72株的第3代乳鼠组织毒,通过乳鼠继续适应3代后,转适BHK-21细胞,获得该毒株的细胞毒AF/72/MF6/BF12,经测定其TCID50为10-8.0/mL;经RT-PCR获得其VP1基因序列,并与GenBank中的其他6株口蹄疫A型病毒株比对,同源性均大于85%;经无菌检验和外源病毒检验,纯净性达到兽用生物制品标准要求;经间接夹心ELISA测定,OD值均大于0.2,且该毒仅能被口蹄疫A型标准血清中和,具有型特异性;经紫外分光光度法测定其146S含量,均值为189 ng/mL,远大于22 ng/mL的国际标准。综合纯净性检验结果、特异性检验结果和146S含量,确定AF/72/MF6/BF12为口蹄疫A型病毒株AF/72的标准细胞毒。 展开更多

关键词 口蹄疫a型病毒 FMD 毒株

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