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小鼠SGK1基因真核表达载体的构建及鉴定
1
作者 张丽娜 巴隆 孟峻 《吉林大学学报(医学版)》 北大核心 2025年第1期51-57,共7页
目的:构建含有小鼠血清和糖皮质激素诱导激酶(SGK)1基因的真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry,并观察载体在转染HEK293细胞后的表达情况。方法:PCR法扩增SGK1目的基因片段,并与经过HindⅢ和SbfⅠ双酶切的pcDNA3.1-MYC-C-mcherry载... 目的:构建含有小鼠血清和糖皮质激素诱导激酶(SGK)1基因的真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry,并观察载体在转染HEK293细胞后的表达情况。方法:PCR法扩增SGK1目的基因片段,并与经过HindⅢ和SbfⅠ双酶切的pcDNA3.1-MYC-C-mcherry载体连接。酶切和测序验证成功后,采用脂质体转染法将pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry转染至HEK293细胞中,Western blotting法测定HEK293细胞中真核表达载体的表达情况。结果:酶切载体条带位于5200 bp,目的基因条带位于3100 bp,与预期结果相符。Snap Gene软件比对,pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry的测序结果与预期序列一致,表明真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry构建成功。Western blotting法观察到转染后的HEK293细胞在相对分子质量49000附近显现出明显的条带,真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry成功表达。结论:成功构建真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry,为后续研究SGK1基因对小鼠受精卵细胞早期发育的作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 血清和糖皮质激素诱导激酶1 真核表达载体 HEK293细胞 载体构建 质粒
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蛋鸡CCND1基因真核表达载体的构建及在卵泡不同发育时期的时空表达模式研究
2
作者 邹贤群 余静 +1 位作者 刘永杰 陈晓霞 《饲料研究》 北大核心 2025年第9期64-69,共6页
试验旨在探究细胞周期蛋白D1(CCND1)基因在蛋鸡卵泡不同发育时期的时空表达模式,进一步研究CCND1基因的分子生物学作用,构建真核表达载体,并预测CCND1基因在蛋鸡卵泡发育过程中的具体分子作用。选用150日龄海兰褐蛋鸡不同大小的卵泡为... 试验旨在探究细胞周期蛋白D1(CCND1)基因在蛋鸡卵泡不同发育时期的时空表达模式,进一步研究CCND1基因的分子生物学作用,构建真核表达载体,并预测CCND1基因在蛋鸡卵泡发育过程中的具体分子作用。选用150日龄海兰褐蛋鸡不同大小的卵泡为试验材料,运用半定量RT-PCR、免疫组化等技术,在分子水平上进行时空表达模式研究与分析。通过酶切位点BamH I和XhoI的双酶切验证连接产物的正确性后进行测序,将测序正确的真核表达载体转染至鸡卵巢的颗粒细胞,利用实时荧光定量PCR技术对转染效果进行确认。结果显示,卵泡直径为5~6 mm和6~7 mm的CCND1的mRNA表达量显著高于其他各卵泡(P<0.05)。在前等级卵泡的卵母细胞和间质中可以观察到CCND1蛋白定位。经过菌落PCR扩增和测序分析,成功构建了真核表达载体pYr-adshuttle-4-CCND1,并将其有效转染至鸡卵泡的颗粒细胞。研究表明,试验可推测CCND1基因在蛋鸡卵泡生长发育过程中发挥一定的作用,为未来的基因功能研究和潜在应用提供了必要的分子基础和工具支持。 展开更多
关键词 蛋鸡 细胞周期蛋白D1(CCND1) 卵泡 真核表达载体 时空表达
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脑心肌炎病毒VP22A基因真核表达载体的构建 被引量：1
3
作者 邵帅 纪晓岚 +1 位作者 刘明启 李琼毅 《中国动物保健》 2025年第1期240-241,共2页
为构建脑心肌炎病毒VP2 2A基因真核表达载体。参考EMCV毒株基因组序列,设计VP2 2A基因特异性引物,PCR扩增VP22A基因目的片段,双酶切目的基因和pc DNA3.1-Flag质粒产生相同的黏性末端,使用T4 DNA连接酶连接相同的黏性末端,连接产物转化至... 为构建脑心肌炎病毒VP2 2A基因真核表达载体。参考EMCV毒株基因组序列,设计VP2 2A基因特异性引物,PCR扩增VP22A基因目的片段,双酶切目的基因和pc DNA3.1-Flag质粒产生相同的黏性末端,使用T4 DNA连接酶连接相同的黏性末端,连接产物转化至DH5α感受态细胞,菌液PCR鉴定阳性单克隆菌落,对阳性单克隆提取重组质粒并双酶切进行验证,对阳性重组质粒进行测序。重组质粒双酶切和测序结果表明,pc DNA3.1-Flag-VP2和pc DNA3.1-Flag-2A真核表达载体构建成功。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 VP2基因 2A基因 真核表达载体
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MAVS全长及其截短体真核表达载体的构建和鉴定
4
作者 玉妹 毕冬琳 +1 位作者 郑天倚 李琼毅 《浙江农业学报》 北大核心 2025年第1期49-60,共12页
建立线粒体抗病毒蛋白(mitochondrial antiviral-signaling protein,MAVS)全长及截短体的真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达,为后续探索MAVS在病毒逃逸机制研究中的作用提供重要的实验材料。首先,根据NCBI数据库中人源MAVS的... 建立线粒体抗病毒蛋白(mitochondrial antiviral-signaling protein,MAVS)全长及截短体的真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达,为后续探索MAVS在病毒逃逸机制研究中的作用提供重要的实验材料。首先,根据NCBI数据库中人源MAVS的全长序列,设计截短体引物,通过PCR从cDNA模板中扩增出MAVS全长及不同截短体的基因片段,并将其克隆到pcDNA3.1-3xflag载体中。随后,将构建好的载体转染到HEK-293细胞中,利用RT-PCR技术检测扩增产物大小,与目的大小进行对比,用Western blot技术检测MAVS蛋白在293细胞中的表达情况。结果表明,成功构建了全长MAVS(MAVS-FL)及其截短体MAVS-△C、MAVS-△CP、MAVS-PBD、MAVS-△Tm的真核表达载体,Western blot结果表明,构建的载体蛋白在HEK-293中能够有效表达。本研究成功构建了MAVS全长及其截短体的真核表达载体,并在HEK-293细胞中表达了这些蛋白,为后续研究MAVS蛋白的功能和抗病毒机制提供了实验材料。 展开更多
关键词 线粒体抗病毒蛋白 真核表达载体 截短体构建 蛋白表达
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九龙牦牛ELOVL3基因克隆、真核表达载体构建及组织表达谱分析
5
作者 司比努尔·牙生江 者玉琦 +2 位作者 钟金城 武志娟 柴志欣 《华北农学报》 北大核心 2025年第2期201-209,共9页
极长链脂肪酸延伸酶3(ELOVL3)主要参与合成极长链脂肪酸(VLCFA),在脂肪酸代谢过程中扮演重要角色。旨为克隆九龙牦牛ELOVL3基因的蛋白编码序列,构建ELOVL3基因真核表达载体,并预测分析其生物学功能,通过PCR技术扩增九龙牦牛ELOVL3基因的... 极长链脂肪酸延伸酶3(ELOVL3)主要参与合成极长链脂肪酸(VLCFA),在脂肪酸代谢过程中扮演重要角色。旨为克隆九龙牦牛ELOVL3基因的蛋白编码序列,构建ELOVL3基因真核表达载体,并预测分析其生物学功能,通过PCR技术扩增九龙牦牛ELOVL3基因的CDS区序列,并通过同源重组将其插入到pcDNA3.1载体中以构建重组质粒。采用限制性酶切及PCR技术验证重组质粒,结合测序结果,利用在线预测软件分析其蛋白编码序列的生物学功能。另外,针对ELOVL3基因在mRNA水平和蛋白水平的表达量,进行qPCR和Western Blot检测。结果表明:九龙牦牛ELOVL3基因的蛋白编码序列全长813 bp,共编码270个氨基酸;酶切、PCR及测序鉴定,确认成功构建pcDNA3.1-ELOVL3真核表达载体。生物信息学分析结果显示,ELOVL3基因编码蛋白属于疏水性蛋白,共有6个跨膜结构域及27个磷酸化位点。系统发育树显示,与九龙牦牛亲缘关系最近的是普通牛,最远的是原鸡。此外,ELOVL3基因在九龙牦牛肺脏组织中表达量最高。 展开更多
关键词 牦牛 ELOVL3基因 基因克隆 真核表达载体构建
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多星韭AwCHI 1的克隆与分析及真核表达载体的构建 被引量：2
6
作者 赵鑫 张艳 +3 位作者 肖松 黄菊 陈瑶 孙威 《贵州师范大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2024年第2期118-126,共9页
查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)是类黄酮物质合成途径中的关键酶,能催化柚皮素查尔酮生成柚皮素,进而转化生成各种类型的黄酮类化合物。根据多星韭(Allium wullichii)转录组测序结果,运用PCR技术克隆获取多星韭查尔酮异构酶的编... 查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)是类黄酮物质合成途径中的关键酶,能催化柚皮素查尔酮生成柚皮素,进而转化生成各种类型的黄酮类化合物。根据多星韭(Allium wullichii)转录组测序结果,运用PCR技术克隆获取多星韭查尔酮异构酶的编码基因(AwCHI 1),对基因序列进行分析,同时与真核表达载体pBI121进行连接,将其转入农杆菌GV3101感受态细胞中,完成农杆菌的转化。研究结果不仅为该基因的功能解析研究奠定了基础,也为多星韭类黄酮代谢途径的研究提供了重要基因资源。 展开更多
关键词 类黄酮 查尔酮异构酶 多星韭 真核表达载体
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新型冠状病毒Nsp1基因真核表达载体的构建及对宿主蛋白质翻译的影响 被引量：1
7
作者 王宏宇 田志飘 +8 位作者 刘红线 郑亮 于雯 吴志军 Matthew Kay 高振秋 曹宏伟 耿荣庆 张华 《黑龙江八一农垦大学学报》 2024年第1期84-90,共7页
非结构蛋白1(Non-structural protein 1,Nsp1)作为新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2)的毒力决定因子,在调控冠状病毒复制方面有重要作用。为更有效地研究SARS-CoV-2 Nsp1蛋白的生物学功能,成... 非结构蛋白1(Non-structural protein 1,Nsp1)作为新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2)的毒力决定因子,在调控冠状病毒复制方面有重要作用。为更有效地研究SARS-CoV-2 Nsp1蛋白的生物学功能,成功构建SARS-CoV-2Nsp1基因的真核表达载体,并验证其抑制宿主及外源蛋白质翻译的功能。通过PCR技术扩增SARS-CoV-2Nsp1基因后,利用同源重组技术将其连接至pEGFP-N1载体上。经双酶切和测序结果鉴定,SARS-CoV-2Nsp1基因成功克隆至pEGFP-N1载体上。将重组质粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1转染至HEK-293T细胞和HeLa细胞中,经嘌呤霉素标记后,利用Western Blot和考马斯亮蓝染色检测重组质粒的表达以及嘌呤霉素信号。结果表明,重组质粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1在HEK-293T细胞和HeLa细胞中成功表达,并验证其抑制宿主蛋白质和外源转入细胞蛋白质的翻译,为更深入研究SARS-CoV-2 Nsp1蛋白的功能奠定基础。 展开更多
关键词 新型冠状病毒 Nsp1基因 真核载体构建 蛋白翻译
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猪源hnRNPA1基因克隆及其真核表达载体构建
8
作者 王文锋 高跃美 +4 位作者 金奕欣 张丽媛 宋丹丹 罗廷荣 李晓宁 《南方农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第11期3426-3435,共10页
【目的】克隆猪源异质性核糖核蛋白A1(hnRNPA1)基因编码区(CDS)序列并构建其真核表达载体,为探究猪源hnRNPA1蛋白结构及其生物学特性提供理论参考。【方法】利用总RNA提取试剂盒提取PK-15细胞总RNA并反转录合成cDNA,以此为模板,采用Snap... 【目的】克隆猪源异质性核糖核蛋白A1(hnRNPA1)基因编码区(CDS)序列并构建其真核表达载体,为探究猪源hnRNPA1蛋白结构及其生物学特性提供理论参考。【方法】利用总RNA提取试剂盒提取PK-15细胞总RNA并反转录合成cDNA,以此为模板,采用SnapeGene设计hnRNPA1基因特异性扩增引物,PCR扩增获得hnRNPA1基因CDS序列。通过ProtParam、ExPASy-ProtScale、TMHMM-1.0、SignalP-6.0、SPOMA、SWISS-MODEL和NetPhos 3.1等预测hnRNPA1蛋白的理化性质、结构及磷酸化位点。构建pcDNA3.0-hnRNPA1-Flag真核表达载体并转染HEK-293T细胞,通过实时荧光定量PCR、Western blottiing和免疫荧光染色试验检测hnRNPA1基因真核表达载体构建情况、hnRNPA1蛋白在细胞中的表达及分布情况。【结果】成功克隆猪源hnRNPA1基因CDS序列。生物信息学分析结果显示,hnRNPA1基因CDS序列全长963 bp,编码320个氨基酸残基,hnRNPA1蛋白分子量约为35 kD,理论等电点(pI)为9.27,脂肪系数为38.34,不稳定系数为43.87(大于40.00),蛋白结构相对不稳定,总平均亲水性指数(GRAVY)为-0.879,属于亲水性蛋白,不含跨膜结构域和信号肽,二级结构由α-螺旋(16.56%)、无规则卷曲(72.50%)和延伸链(10.94%)组成,存在48个潜在的磷酸化位点。Western blotting检测结果显示,真核表达载体pcDNA3.0-hnRNPA1-Flag转染HEK-293T细胞后能成功表达hnRNPA1蛋白。免疫荧光染色结果显示,hnRNPA1蛋白主要在胞质中表达。【结论】成功克隆猪源hnRNPA1基因CDS序列。猪源hnRNPA1蛋白为不稳定的亲水性蛋白,不含跨膜结构域和信号肽,二级结构主要为无规则卷曲。成功构建pcDNA3.0-hnRNPA1-Flag真核表达载体,hnRNPA1蛋白主要在胞质中表达。 展开更多
关键词 猪 hnRNPA1基因 生物信息学分析 表达载体构建
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水牛SFRP 1基因序列分析、真核表达载体构建及组织表达分析 被引量：1
9
作者 黄丽清 段安琴 +2 位作者 郑海英 杨春艳 尚江华 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期1807-1818,共12页
【目的】获取水牛分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)基因CDS区序列,并预测其编码蛋白的结构功能,构建SFRP 1基因真核表达载体,检测SFRP 1基因在水牛不同组织中的表达情况,为探索SFRP 1基因在水牛生长发育中的作用奠定基础。【方法】以水牛卵... 【目的】获取水牛分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)基因CDS区序列,并预测其编码蛋白的结构功能,构建SFRP 1基因真核表达载体,检测SFRP 1基因在水牛不同组织中的表达情况,为探索SFRP 1基因在水牛生长发育中的作用奠定基础。【方法】以水牛卵巢组织cDNA为模板,通过RT-PCR对SFRP 1基因CDS区序列进行扩增并测序,利用生物信息学在线分析软件对水牛SFRP 1基因与不同物种进行比对和系统进化树构建,并预测SFRP1蛋白理化性质、信号肽、跨膜结构等。将获得的目的基因连接至pCMV-HAhyPBase-mcheery载体并转染至水牛颗粒细胞,检测转染后荧光和基因表达情况。通过实时荧光定量PCR检测水牛不同组织中SFRP 1基因表达情况。【结果】水牛SFRP 1基因CDS区长927 bp,共编码308个氨基酸。多重序列比对结果显示,水牛SFRP 1基因氨基酸序列与黄牛、牦牛、山羊、虎鲸、黑猩猩、北极狐、猫、人、小鼠的相似性分别为100%、100%、99.65%、98.58%、98.23%、98.23%、98.58%、98.23%、96.45%,存在CRD_FZ、NTR_like和DUF3367结构域。水牛SFRP 1基因核苷酸序列与黄牛、绵羊、山羊、牦牛、野牛、马鹿、野骆驼、猪、人的相似性分别为97.3%、95.9%、95.8%、94.5%、94.2%、93.7%、80.4%、78.5%和77.3%。系统进化树结果显示,水牛与黄牛、牦牛、野牛聚为一支。生物信息学分析结果显示,SFRP1蛋白呈碱性,为不稳定蛋白;第1—15位氨基酸处存在信号肽,为分泌型蛋白,存在跨膜结构,主要定位于细胞外;存在21个磷酸化位点和8个O-糖基化修饰位点。二级结构主要由α-螺旋、延伸链和无规则卷曲构成;水牛、黄牛、人的SFRP1蛋白三级结构高度相似。成功构建pCMV-mcheery-SFRP1真核表达载体并转染水牛颗粒细胞,转染72 h后pCMV-mcheery-SFRP1重组质粒组细胞内SFRP 1基因表达量极显著高于对照组(P<0.01)。实时荧光定量PCR结果显示,SFRP 1基因在水牛不同组织中均有表达,且在脾脏中表达量最高,极显著高于其他组织(P<0.01)。【结论】SFRP 1基因在不同物种以及遗传进化过程中具有高保守性,在水牛不同组织中广泛表达。研究结果为今后探究SFRP 1基因在水牛生长发育中的功能及分子机制奠定基础。 展开更多
关键词 水牛 SFRP 1基因 序列分析 真核表达载体 组织表达
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羊口疮病毒F1L基因真核表达载体的构建及鉴定
10
作者 蒋尊 安红艳 +3 位作者 孙创奇 葛佳仪 梁倩 鲜思美 《贵州畜牧兽医》 2024年第1期57-59,共3页
为构建羊口疮病毒F1L基因的真核表达载体,以ORFV-DZ分离株基因组作为模板,PCR特异性扩增F1L基因,扩增产物与pEGFP-N1质粒连接构建重组质粒pEGFP-F1L,经测序和酶切验证的阳性重组子转染HEK-293t细胞进行表达,通过荧光显微镜观察和Western... 为构建羊口疮病毒F1L基因的真核表达载体,以ORFV-DZ分离株基因组作为模板,PCR特异性扩增F1L基因,扩增产物与pEGFP-N1质粒连接构建重组质粒pEGFP-F1L,经测序和酶切验证的阳性重组子转染HEK-293t细胞进行表达,通过荧光显微镜观察和Western blotting对融合蛋白的表达进行鉴定。结果:PCR产物长度为1 029 bp,与F1L基因片段长度相符;阳性重组质粒pEGFP-F1L转染HEK-293t细胞可观察到明显绿色荧光,表达的融合蛋白大小约65 ku,与预期相符。结论:试验成功构建了pEGFP-F1L真核表达载体。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 F1L基因 真核表达载体
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羊口疮病毒 ORF116 基因真核表达载体的构建 被引量：1
11
作者 覃绍洋 周伟杰 庞峰 《贵州畜牧兽医》 2024年第4期57-59,共3页
为了构建羊口疮病毒ORF116基因的真核表达载体,以ORFV-JS株基因组为参考序列,PCR特异性扩增ORF116基因;将ORF116基因与pEGFP-N1载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞,菌液PCR和测序筛选鉴定阳性单克隆;阳性克隆扩大培养后提取pEGFP-ORF116... 为了构建羊口疮病毒ORF116基因的真核表达载体,以ORFV-JS株基因组为参考序列,PCR特异性扩增ORF116基因;将ORF116基因与pEGFP-N1载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞,菌液PCR和测序筛选鉴定阳性单克隆;阳性克隆扩大培养后提取pEGFP-ORF116重组质粒,并进行酶切鉴定。结果:ORF116基因PCR产物为696 bp;菌液PCR共得到3个阳性单克隆,测序结果正确;pEGFP-ORF116重组质粒双酶切得到696 bp的ORF116基因片段。结论:试验成功构建了羊口疮病毒ORF116基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的表达及编码蛋白的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 ORF116基因 克隆 真核表达载体
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山药生长素运输载体基因的表达特点及其对N-(1-奈基)邻氨甲酰苯甲酸的响应
12
作者 尹冬 徐升胜 +4 位作者 段延碧 程园 郭凤根 王仕玉 龙雯虹 《山东农业科学》 北大核心 2025年第4期32-39,共8页
为了探讨生长素运输载体基因AUXs和PINs在山药(Dioscorea opposita)生长发育过程中的作用,本研究采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术,通过筛选合适的内参基因,系统研究了生长素运输载体基因AUXs和PINs在山药不同部位茎蔓及其他组织中的... 为了探讨生长素运输载体基因AUXs和PINs在山药(Dioscorea opposita)生长发育过程中的作用,本研究采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术,通过筛选合适的内参基因,系统研究了生长素运输载体基因AUXs和PINs在山药不同部位茎蔓及其他组织中的表达模式,以及其对N-(1-奈基)邻氨甲酰苯甲酸(NPA)的响应。结果如下:利用Delta Ct、NormFinder、geNorm和Comparative△Ct软件对8个候选内参基因(MYB、GADPH、TRX-2、ACT-1、EF-1α、F-box、HIS、α-TUB)的稳定性进行评价,筛选出MYB基因可用作山药不同部位茎蔓中生长素运输载体基因表达分析的内参基因。RT-qPCR分析结果表明,DoAUX2、DoAUX3、DoPIN1、DoPIN3和DoPIN7基因在山药茎蔓幼嫩部位的上端表达量高于下端表达量;DoAUX1、DoAUX2和DoPIN3基因在茎蔓成熟部位的上端表达量高于下端表达量;DoPIN3基因在茎蔓幼嫩部位和成熟部位的上端表达量高于下端。生长素运输载体基因在山药茎尖、叶片、根系、珠芽、雄花及雌花中均有表达,其中,DoAUX1、DoAUX2和DoPIN7基因在叶片中的表达量最高,DoAUX3和DoPIN1基因在茎尖中的表达量显著高于其他组织,DoPIN3和DoPIN6基因在根系中的表达量显著高于其他组织,表现出明显的组织特异性。与清水对照相比,NPA处理显著影响DoAUX1、DoAUX2、DoAUX3、DoPIN1、DoPIN3、DoPIN6和DoPIN7基因的表达,且大多表现为下调表达。综上,生长素运输载体基因通过调控生长素在山药不同组织中的分布调控其生长发育,NPA能通过调控生长素运输载体基因的表达影响生长素在山药植株中的运输。 展开更多
关键词 生长素运输载体基因 山药 表达特点 茎蔓 N-(1-奈基)邻氨甲酰苯甲酸(NPA)
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绵羊GSTA2基因克隆、生物信息学分析及真核表达载体构建 被引量：1
13
作者 邱丽霞 林秀 +4 位作者 曹忻 杨华 杨永林 余乾 张文喆 《中国草食动物科学》 CAS 北大核心 2024年第2期1-9,共9页
为阐明绵羊谷胱甘肽S转移酶α2(Glutathione S-transferase alpha 2,GSTA2)基因功能,利用牛GSTA2基因序列设计引物,提取绵羊皮肤组织总RNA,应用RT-PCR、基因克隆、生物信息学对GSTA2基因进行研究,构建真核表达载体,转染绵羊皮肤成纤维细... 为阐明绵羊谷胱甘肽S转移酶α2(Glutathione S-transferase alpha 2,GSTA2)基因功能,利用牛GSTA2基因序列设计引物,提取绵羊皮肤组织总RNA,应用RT-PCR、基因克隆、生物信息学对GSTA2基因进行研究,构建真核表达载体,转染绵羊皮肤成纤维细胞,应用qPCR技术检测GSTA2基因的表达。结果表明,克隆到绵羊GSTA2基因672 bp编码区序列(GenBank登录号:OR440604.1),编码223个氨基酸,分子量为25.39 ku。氨基酸比对和系统进化树分析表明,绵羊与牛的GSTA2相似度最高,达87.39%。GSTA2的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。构建的真核表达载体pcDNA3.1-GSTA2转染绵羊皮肤成纤维细胞后,GSTA2基因表达量极显著上调(P <0.001)。说明成功克隆了绵羊新基因GSTA2的CDS序列,并成功构建了其真核表达载体。 展开更多
关键词 绵羊 GSTA2基因 克隆 生物信息学 真核表达载体
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鸡IL-18真核表达载体的构建及其对IBD灭活疫苗免疫增强作用的研究 被引量：11
14
作者 张春杰 程相朝 +2 位作者 李银聚 吴庭才 赵德明 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第9期617-621,共5页
目的 :探讨鸡IL 18的功能活性及对鸡用疫苗的免疫增强作用。方法 :将鸡IL 18编码区cDNA定向克隆至pcDNA3载体构建了鸡IL 18真核表达质粒 ,与传染性法氏囊病 (IBD)灭活疫苗联合应用 ,通过中和抗体的检测、胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B... 目的 :探讨鸡IL 18的功能活性及对鸡用疫苗的免疫增强作用。方法 :将鸡IL 18编码区cDNA定向克隆至pcDNA3载体构建了鸡IL 18真核表达质粒 ,与传染性法氏囊病 (IBD)灭活疫苗联合应用 ,通过中和抗体的检测、胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA增殖反应的观察 ,研究了其对IBD胚毒灭活疫苗的免疫增强效果。结果 :同时接种IBD灭活疫苗和IL 18真核表达质粒的免疫鸡所产生的中和抗体效价在接种第 2 8天后明显高于单纯疫苗组 (P <0 0 5 ) ;其T、B淋巴细胞的增殖反应也强于单纯疫苗组 ,尤其是T淋巴细胞的增殖反应从接种后第 2 1天开始即明显强于单纯疫苗组 (P <0 0 5 ) ;接种后第 4 2天时进行的攻毒试验结果表明 ,同时接种IL 18表达质粒的试验组鸡获得 93 3%的保护 ,而单纯疫苗接种组的保护率只有 86 7%。结论 :鸡IL 18真核表达质粒在鸡体内得到了良好表达 ,表达产物不但具有明显的增强IBD灭活疫苗诱导细胞免疫的作用 ;同时 ,对于中和抗体水平的提高、B淋巴细胞增殖反应的加强也具有明显的作用。科技大学禽病研究室应用IBDV地方野毒株 (L0 15和L0 17株 )所制备的胚毒灭活油乳苗。1 1 2　实验用鸡　为洛阳市新安县机械化鸡场提供的 1日龄健康罗曼雏公鸡 ,自饲养至所需日龄。1 1 展开更多
关键词 鸡 IL-18 真核表达载体 免疫增强作用
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pVAX-WIF-1真核表达载体的构建及其抗肺癌作用 被引量：5
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作者 安宁 罗心梅 +4 位作者 叶苏娟 王宇 杨蔚菡 蒋倩倩 朱文 《中国肺癌杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第7期409-415,共7页
背景与目的 WIF-1是肺癌中重要的抑癌基因之一,其编码蛋白WIF-1能够通过抑制Wnt/β-catenin信号通路达到抑制肿瘤生长增殖及促进凋亡等抗肺癌作用。本研究旨在利用美国食品和药品管理委员会认可用于临床治疗的p VAX载体,构建p VAX-WIF-... 背景与目的 WIF-1是肺癌中重要的抑癌基因之一,其编码蛋白WIF-1能够通过抑制Wnt/β-catenin信号通路达到抑制肿瘤生长增殖及促进凋亡等抗肺癌作用。本研究旨在利用美国食品和药品管理委员会认可用于临床治疗的p VAX载体,构建p VAX-WIF-1真核表达载体,初步探究p VAX-WIF-1在体内外对A549肺癌细胞的抗肿瘤作用。方法应用PCR方法扩增人WIF-1编码序列片段,构建p VAX-WIF-1载体后转染肺癌A549细胞,Western blot检测WIF-1基因的表达;采用MTT法、Hoechst3235染色和流式细胞术分别检测p VAX-WIF-1在体外对肺癌A549细胞增殖、凋亡作用的影响;构建A549小鼠皮下瘤模型,探究p VAX-WIF-1在体内的抗肺癌作用。结果真核表达质粒载体p VAX-WIF-1构建成功,p VAX-WIF-1转染A549细胞后,WIF-1蛋白表达升高。p VAX-WIF-1转染A549后能抑制细胞增殖和诱导凋亡。动物体内结果表明,p VAX-WIF-1能有效抑制肺癌肿瘤生长。结论本研究成功构建了p VAX-WIF-1真核表达质粒,p VAX-WIF-1能明显抑制A549肺癌细胞增殖和促进凋亡,有效抑制A549皮下瘤生长。本研究将为WIF-1基因的肺癌临床治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 肺癌 WIF-1基因 A549 基因治疗 真核表达载体
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鸡IL-18真核表达载体的构建及其对新城疫疫苗免疫增强作用的研究 被引量：20
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作者 程相朝 赵德明 +2 位作者 吴庭才 李银聚 张春杰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期476-481,共6页
利用首次从鸡新城疫疫苗接种的鸡胚脾细胞中扩增出的鸡IL 18 全基因,构建IL 18 真核表达载体(pcDNA3 IL18),并观察其对新城疫疫苗的免疫增强作用。结果表明,同时接种pcDNA3 IL18 质粒和活疫苗的免疫鸡在接种后35 d内,特别是15 d之后所... 利用首次从鸡新城疫疫苗接种的鸡胚脾细胞中扩增出的鸡IL 18 全基因,构建IL 18 真核表达载体(pcDNA3 IL18),并观察其对新城疫疫苗的免疫增强作用。结果表明,同时接种pcDNA3 IL18 质粒和活疫苗的免疫鸡在接种后35 d内,特别是15 d之后所产生的HI抗体效价和T、B淋巴细胞增殖反应均高于单纯疫苗免疫组及pcDNA3 空白质粒和疫苗联合免疫组。其中,HI抗体效价在15 d 时差异显著(P<0 05),在30 和35 d时差异极显著(P<0 01); T淋巴细胞增殖反应在15 d后均表现为差异显著(P<0 05〉或极显著(P<0 01);而单纯疫苗组与空白质粒和疫苗联合免疫组之间的各测定指标则无明显的差异(P>0 05)。在35 d时进行攻毒, pcDNA3 IL18和疫苗联合免疫组的保护率为83.3%,而单纯疫苗免疫组、空白质粒和疫苗联合免疫组鸡的保护率则分别只有61.5%和66.7%。说明该pcDNA3 IL18真核表达质粒在鸡体内得到了表达,表达产物不仅能够显著增强新城疫疫苗所诱导的细胞免疫和体液免疫反应,而且还可以明显提高疫苗的保护率。 展开更多
关键词 免疫增强作用 真核表达载体 新城疫疫苗 IL-18 构建 HI抗体效价 联合免疫 真核表达质粒 体液免疫反应 疫苗免疫 增殖反应 差异显著 B淋巴细胞 T淋巴细胞 保护率 疫苗接种 鸡新城疫 测定指标 细胞免疫 表达产物 全基因 脾细胞
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少汗型外胚层发育不良症eda-A1基因突变分析及其真核表达载体的构建 被引量：6
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作者 雷科 车团结 +3 位作者 王锦明 邓旎 张琳 何祥一 《华西口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期610-613,共4页
目的克隆少汗型外胚层发育不良症(HED)eda-A1基因并进行突变分析,同时构建eda-A1基因编码序列突变型(M)和野生型(W)的真核表达载体pcDNA3.1(-)-eda-A1-M/W,为进一步明析eda基因的功能奠定基础。方法设计含有BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点的... 目的克隆少汗型外胚层发育不良症(HED)eda-A1基因并进行突变分析,同时构建eda-A1基因编码序列突变型(M)和野生型(W)的真核表达载体pcDNA3.1(-)-eda-A1-M/W,为进一步明析eda基因的功能奠定基础。方法设计含有BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点的引物,从HED患者和正常人外周血淋巴细胞中提取总mRNA,利用RT-PCR法克隆eda-A1(M/W)基因cDNA序列;并运用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pcDNA3.1(-)载体和eda-A1基因片段,将eda-A1(M/W)插入到pcDNA3.1(-)载体中,从而构建新的真核表达载体,命名为pcDNA3.1(-)-eda-A1-M和pcDNA3.1(-)-eda-A1-W。结果成功克隆少汗型外胚层发育不良症eda-A1基因,并发现未见报道过的907位A→C错义突变,导致306位编码氨基酸由谷氨酰胺变异为脯氨酸;经PCR法、重组载体双酶切法、DNA测序验证,成功构建了pcDNA3.1(-)-eda-A1-W/M的真核表达载体。结论成功构建少汗型外胚层发育不良症eda-A1基因(突变型和野生型)真核表达载体pcDNA3.1(-)-eda-A1-M/W,为进一步研究该基因在牙齿发育中的生物学作用奠定了实验基础。 展开更多
关键词 少汗型外胚层发育不良症 eda—A1基因 突变 真核表达载体
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CH50多肽真核表达载体pCH510的构建、表达及体内趋化和抑瘤作用 被引量：7
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作者 叶仕桥 冯作化 +4 位作者 李东 张桂梅 张慧 黄波 肖徽 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2001年第1期23-26,共4页
目的 :构建重组人FN多肽的真核表达载体 ,研究体内表达对免疫细胞的趋化作用及抑制肿瘤生长的作用。方法 :采用重组DNA技术构建表达质粒 ;体内外进行基因转染 ;用Westernblot方法鉴定表达产物 ;肌肉组织切片与染色观察体内基因转染后的... 目的 :构建重组人FN多肽的真核表达载体 ,研究体内表达对免疫细胞的趋化作用及抑制肿瘤生长的作用。方法 :采用重组DNA技术构建表达质粒 ;体内外进行基因转染 ;用Westernblot方法鉴定表达产物 ;肌肉组织切片与染色观察体内基因转染后的趋化作用 ;小鼠实体瘤模型研究基因转染抑制肿瘤生长的作用。结果 :将人FNcDNA 5′端非编码区及信号肽编码区、CH5 0多肽编码区cDNA、人FNcDNA的 3′端非编码区重组连接并插入pcDNA3.1质粒 ,构建出pCH5 10。以pCH5 10转染小鼠NIH3T3细胞 ,可以表达产生CH5 0多肽。肌肉内注射转染pCH5 10可对免疫细胞产生趋化作用 ,抑制实体肿瘤的生长。结论 :质粒pCH5 10可在细胞中及小鼠体内表达 ;体内表达可对免疫细胞产生趋化作用 。 展开更多
关键词 纤维粘连蛋白 重组多肽 肿瘤 真核表达载体 基因治疗
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真核表达载体pEGFP-claudin-1的构建及其在293T细胞中的表达 被引量：4
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作者 魏欣 张野 +5 位作者 李军 马力 潘蕾 王平忠 白雪帆 贾战生 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期444-446,共3页
目的:构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,并在293T细胞中进行表达。方法:用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增claudin-1开放读码框(ORF)基因,将其插入到pEGFP-C3载体的Xho I和BamH I酶切位点,构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,酶切鉴... 目的:构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,并在293T细胞中进行表达。方法:用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增claudin-1开放读码框(ORF)基因,将其插入到pEGFP-C3载体的Xho I和BamH I酶切位点,构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,酶切鉴定并测序。通过脂质体法转染293T细胞,进行荧光检测和Western blot分析。结果:构建了含有claudin-1 ORF的真核表达质粒pEGFP-claudin-1,转染293T细胞后,经荧光可见细胞膜有EGFP-claudin-1融合蛋白的表达,Western blot检测发现有相对分子质量(Mr)49000的蛋白条带。结论:成功地构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,并在293T细胞中表达,为研究claudin-1的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 CLAUDIN-1 绿色荧光蛋白 真核表达载体 293T细胞
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苹果ACO1转录因子MdHB-1基因的克隆及其真核表达载体的构建 被引量：5
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作者 于巧平 尹明安 +1 位作者 任小林 姜永华 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2012年第10期154-160,共7页
【目的】通过生物信息学分析,将苹果的一段EST序列初步定性为转录因子MdHB-1基因,对该基因进行克隆和真核表达载体构建,为进一步研究其分子生物学功能奠定基础。【方法】根据番茄LeACO1转录因子LeHB-1的基因序列,对苹果EST库进行Blast,... 【目的】通过生物信息学分析,将苹果的一段EST序列初步定性为转录因子MdHB-1基因,对该基因进行克隆和真核表达载体构建,为进一步研究其分子生物学功能奠定基础。【方法】根据番茄LeACO1转录因子LeHB-1的基因序列,对苹果EST库进行Blast,获得一段EST序列,根据该EST序列设计1对特异性引物,以"皇家嘎啦"苹果花器总RNA为材料,经RT-PCR得到1条长约1 000bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定及分析。将基因MdHB-1与真核表达载体pPICZA连接,构建真核表达载体pPICZA-MdHB-1,并导入毕赤酵母菌种GS115,通过PCR鉴定该载体的导入情况。【结果】克隆到苹果MdHB-1基因(GenBank登录号为JQ678788),其开放阅读框为1 011bp,编码336个氨基酸。Blastn和Blastp序列比对分析发现,MdHB-1与已登录的其他物种的HB-1基因相似性达50%～60%。该基因编码的氨基酸中存在保守序列HD-Zip结构域,该保守序列与已经报道的番茄LeHB-1、拟南芥AtHB-1的保守序列的同源性均大于85%。重组表达载体PICZA-MdHB-1构建正确并已成功导入酵母基因组中。【结论】成功克隆了苹果转录因子MdHB-1基因全长,并正确构建了其真核表达载体。 展开更多
关键词 苹果 花器 转录因子MdHB-1 克隆 真核表达载体
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