目的:为了研制更加安全的鼠伤寒沙门菌弱毒株,本研究构建了鼠伤寒沙门菌SL1344Δsip B基因缺失突变株。方法:首先构建含缺失585 bp sipB基因的重组自杀性质粒PREΔsipB,利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选出SL1344的s...目的:为了研制更加安全的鼠伤寒沙门菌弱毒株,本研究构建了鼠伤寒沙门菌SL1344Δsip B基因缺失突变株。方法:首先构建含缺失585 bp sipB基因的重组自杀性质粒PREΔsipB,利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选出SL1344的sip B缺失株。结果:PCR及测序结果表明SL1344ΔsipB构建成功。进一步生物学特性研究表明,缺失株SL1344ΔsipB保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12:i:1,2,且能够稳定遗传缺失585 bp的sipB基因,生长速度没有发生明显改变;但是,与亲本株SL1344相比,其毒力发生明显改变,缺失株SL1344ΔsipB口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为1.70×108CFU,毒力较亲本株SL1344降低至1.4%,免疫保护效力实验显示,对6周龄BALB/c小鼠免疫后第17天,鼠伤寒沙门菌野生株攻毒有50%的保护率。在给小鼠免疫后第14天血清抗体IgG达到最高。结论:结果表明,SL1344ΔsipB基因缺失株构建成功,遗传稳定,毒力明显降低,且具有较好的免疫原性,为研究鼠伤寒沙门菌sipB基因与其致病力之间的关系提供了方法,并为研制安全有效的沙门菌疫苗弱毒株奠定了基础。展开更多
目的分析CCDC115(Coiled-Coil Domain-Containing Protein 115)的蛋白性质,利用Ccdc115基因缺失的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7),探究CCDC115对胞内鼠伤寒沙门菌生存的影响,为开展CCDC115功能研究及调控胞内沙门菌生存的机制研...目的分析CCDC115(Coiled-Coil Domain-Containing Protein 115)的蛋白性质,利用Ccdc115基因缺失的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7),探究CCDC115对胞内鼠伤寒沙门菌生存的影响,为开展CCDC115功能研究及调控胞内沙门菌生存的机制研究提供理论基础。方法采用生物信息学分析,对CCDC115的基本性质进行探究。依据CRISPR/Cas9基因编辑技术构建RAW264.7-Ccdc115-KO细胞系。将鼠伤寒沙门菌感染RAW264.7及RAW264.7-Ccdc115-KO细胞,通过RT-qRCR、Western Blot、CFU(Colony-Forming Units)计数、酸化成像研究CCDC115在鼠伤寒沙门菌胞内生存中的作用。结果CCDC115是由2个α螺旋及中间无序区组成的不稳定蛋白,无跨膜结构域。成功构建敲除Ccdc115基因的RAW264.7细胞系。鼠伤寒沙门菌感染细胞后,在RAW264.7细胞中mRNA水平和蛋白水平CCDC115表达增加,并且在RAW264.7-Ccdc115-KO细胞内增殖数量是RAW264.7细胞的1.5倍。在吞噬体酸化成像中,鼠伤寒沙门菌吞噬体在RAW264.7细胞中发生酸化,而在RAW264.7-Ccdc115-KO细胞中没有发生酸化。结论成功构建RAW264.7-Ccdc115-KO细胞系;CCDC115在鼠伤寒沙门菌感染过程中表达增加,并可能通过使吞噬体发生酸化抑制鼠伤寒沙门菌在细胞内生存。展开更多
