鳗鲡疱疹病毒实时荧光重组酶辅助扩增(RAA)检测方法的建立及应用 被引量：1

1

作者 陈曦 杨金先 葛均青 《大连海洋大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期234-240,共7页

为建立鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)的实时荧光重组酶辅助扩增(recombinase-aided amplification,RAA)检测方法,根据AngHV的ORF 95基因序列设计引物和探针,优化反应温度,确定反应时间,并应用该方法对采集的临床样品进行... 为建立鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)的实时荧光重组酶辅助扩增(recombinase-aided amplification,RAA)检测方法,根据AngHV的ORF 95基因序列设计引物和探针,优化反应温度,确定反应时间,并应用该方法对采集的临床样品进行检测。结果表明:本研究中建立的实时荧光RAA检测方法的最佳反应温度为39℃,反应时间为20 min;实时荧光RAA检测方法的灵敏度、特异性及重复性评价显示,RAA检测AngHV的最低检测量为1×10^(2)copies/μL,可特异性地检测AngHV,与美洲鳗鲡腺瘤病毒(American eel adomavirus,AEAdoV)、蛙虹彩病毒(Rana grylio virus,RGV)、鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)和对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)均无交叉反应;实时荧光RAA检测方法的组内和组间变异系数均小于5%,表明实时荧光RAA检测方法灵敏度高、特异性强和重复性好;应用该方法对采集的25份临床样品进行检测显示,实时荧光RAA检测方法与qPCR方法的检出率一致,均为92%,高于普通PCR的检出率(76%)。研究表明,本研究中所建立的鳗鲡疱疹病毒实时荧光重组酶辅助扩增RAA检测方法快速、灵敏、可靠、准确,可用于AngHV的临床快速检测和流行病学调查。 展开更多

关键词 鳗鲡疱疹病毒(anghv) 实时荧光RAA 快速检测

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鳗鲡疱疹病毒基础RPA及RPA-LFD检测方法的比较 被引量：1

2

作者 林而舒 《渔业研究》 2024年第4期367-374,共8页

【目的】鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)是鳗鲡“脱黏败血综合征”的主要病原,对鳗鲡养殖产业造成了严重的经济损失。为达到早期预警和防止病毒扩增蔓延的目的,建立一套AngHV快速检测技术对中国鳗鲡养殖疾病防控具有重要意... 【目的】鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)是鳗鲡“脱黏败血综合征”的主要病原,对鳗鲡养殖产业造成了严重的经济损失。为达到早期预警和防止病毒扩增蔓延的目的,建立一套AngHV快速检测技术对中国鳗鲡养殖疾病防控具有重要意义。【方法】本研究根据AngHV ORF55设计了扩增引物和探针,建立了基于重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)的基础RPA及RPA侧向流层析试纸条法(RPA-LFD)检测方法,探究了不同时间和温度对基础RPA和RPA-LFD扩增效果的影响,并比较了2种方法的灵敏度、特异性和临床应用效果。【结果】本研究建立的AngHV基础RPA及RPA-LFD快速检测方法扩增产物大小为394 bp;2种检测方法都仅需20~40 min即可完成检测过程;温度的变化对检测方法的影响不大,37~43℃范围内均能得到较好的扩增效果;2种检测方法均与鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus)、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus)和鲤疱疹病毒(Cyprinid herpesvirus)无交叉反应,表现出良好的特异性;RPA-LFD检测方法具有更高的检测灵敏度,检出限至1.32×10^(0)copies/mL,基础RPA检出限至1.32×10^(3)copies/mL;检测实验室保存的20份鳗鲡病料DNA,2种方法检测的结果一致,阳性率均为30%,表明AngHV基础RPA和RPALFD检测方法均具有良好的临床应用潜力。【结论】AngHV基础RPA和RPA-LFD检测方法十分适用于基层科研单位、鳗鲡产品加工场及养殖场的病毒检测,丰富了AngHV检测手段的可选性。 展开更多

关键词 鳗鲡 鳗鲡疱疹病毒(anghv) 重组酶聚合酶等温扩增(RPA) 重组酶聚合酶等温扩增-侧向流层析试纸条法(RPA-LFD)

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鳗鲡病毒性疾病病料中鳗鲡疱疹病毒的PCR检测 被引量：20

3

作者 葛均青 杨金先 +2 位作者 李友娟 陈强 林天龙 《福建农业学报》 CAS 2012年第9期961-964,共4页

结合流行病学、临床症状、病理变化等对2006～2012年收集的发病濒死鳗鲡病料进行分类,确定疑似鳗鲡病毒性疾病病料36份,提取病料主要内脏器官(肝、脾、肾)DNA,进行鳗鲡疱疹病毒的PCR检测。从"脱粘败血病"、"红头病"... 结合流行病学、临床症状、病理变化等对2006～2012年收集的发病濒死鳗鲡病料进行分类,确定疑似鳗鲡病毒性疾病病料36份,提取病料主要内脏器官(肝、脾、肾)DNA,进行鳗鲡疱疹病毒的PCR检测。从"脱粘败血病"、"红头病"、"烂鳃病"的鳗鲡病料中检测到6份阳性结果,表明这些疾病可能是由鳗鲡疱疹病毒引起的。DNA测序结果显示,扩增的病毒DNA聚合酶基因片段与分离自台湾、日本及欧洲的病毒株完全一致,表明这些病毒可能为同一病毒株。 展开更多

关键词 鳗鲡 鳗鲡疱疹病毒 聚合酶链式反应(PCR)

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鳗鲡疱疹病毒ORF87基因克隆及其多克隆抗体的制备 被引量：1

4

作者 陈曦 杨金先 +4 位作者 李英英 陈强 黄小红 宋铁英 葛均青 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期538-545,共8页

【目的】克隆鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)ORF87基因,分析其序列特征并制备多克隆抗体,为揭示ORF87基因在AngHV侵染过程中的作用机制提供技术支持。【方法】根据GenBank已公布AngHV参考株(NC_013668)的ORF87基因序列设计... 【目的】克隆鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)ORF87基因,分析其序列特征并制备多克隆抗体,为揭示ORF87基因在AngHV侵染过程中的作用机制提供技术支持。【方法】根据GenBank已公布AngHV参考株(NC_013668)的ORF87基因序列设计引物,从AngHV-FJ株基因组中扩增出ORF87基因,构建重组质粒pMD19-ORF87经酶切鉴定和测序验证后,采用Softberry、ProtParam、CDD、TMHMM、SignalP 5.0、PSORT及BepiPred等在线软件进行生物信息学分析;将ORF87基因克隆至p ET-32a表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测及Western blotting鉴定;以纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备ORF87多克隆抗体。【结果】克隆获得的AngHV-FJ株ORF87基因为2127 bp,与GenBank已发布的参考序列高度同源(相似性为99.72%),仅存在4个碱基突变;其编码蛋白分子量为80.1 kD,理论等电点(pI)为7.62,不稳定系数为42.38,总平均亲水性为-0.271。ORF87蛋白具有蛋白激酶C超家族(PKC-like Superfamily)的保守结构域,但不具信号肽和跨膜结构域;其亚细胞定位可能位于细胞核和细胞质膜,存在19个潜在B细胞抗原表位,即具有良好的免疫原性。AngHV-FJ株ORF87基因可在大肠杆菌中高效表达,表达获得的融合蛋白约100.0 kD,主要以包涵体形式存在;以融合蛋白免疫新西兰大白兔制备获得的ORF87多克隆抗体效价达1∶16000,能特异性识别AngHV的ORF87蛋白。【结论】AngHV-FJ株源ORF87基因经原核表达载体诱导表达获得的融合蛋白ORF87具有Serine/threonine蛋白激酶活性,以其免疫新西兰大白兔制备获得的ORF87多克隆抗体具有高效价,能特异性识别AngHV感染,可作为亚细胞定位及表达时相分析等蛋白特性研究的工具,用于解析ORF87基因在AngHV侵染过程中的作用。 展开更多

关键词 鳗鲡疱疹病毒(anghv) ORF87基因 原核表达 多克隆抗体 免疫原性

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鳗鲡疱疹病毒ORF95基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 被引量：6

5

作者 李友娟 葛均青 +1 位作者 宋铁英 林天龙 《福建农业学报》 CAS 2012年第8期787-791,共5页

鳗鲡疱疹病毒(Anguillae herpesvirus,AngHV)是淡水鳗鲡的主要病毒性疾病病原之一。根据鳗鲡疱疹病毒(AngHV-1)的基因组序列(GenBank:NC-013668)设计引物,扩增鳗鲡疱疹病毒福建株(AngHV-FJ)ORF95基因的开放阅读框序列,克隆至pMD19-T载体... 鳗鲡疱疹病毒(Anguillae herpesvirus,AngHV)是淡水鳗鲡的主要病毒性疾病病原之一。根据鳗鲡疱疹病毒(AngHV-1)的基因组序列(GenBank:NC-013668)设计引物,扩增鳗鲡疱疹病毒福建株(AngHV-FJ)ORF95基因的开放阅读框序列,克隆至pMD19-T载体;经限制性内切酶酶切和测序鉴定,进一步将其克隆至原核表达载体pET-32a,构建了表达质粒32a-ORF95,将其转化表达菌株BL21(DE3),经IPTG诱导,实现了ORF95在大肠杆菌中的高效表达。在0.1mmol.L-1 IPTG、23℃诱导14h的条件下,可溶性ORF95蛋白的表达量较高,经镍柱纯化获得了高纯度的融合蛋白。 展开更多

关键词 鳗鲡疱疹病毒 ORF95 基因克隆 原核表达

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从患败血症欧洲鳗鲡检出疱疹病毒 被引量：8

6

作者 卓玉琛 樊海平 林煜 《电子显微学报》 CAS CSCD 2008年第1期73-76,共4页

本文对2005年、2006年的春、夏和秋季,福建省各养殖区患败血症的欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)进行超微病理学研究,经电镜观察,患败血症欧洲鳗鲡鳃、肝和肠组织细胞内检出疱疹病毒。鳃上皮细胞核内病毒核衣壳,呈圆形或双环状,直径约80 nm... 本文对2005年、2006年的春、夏和秋季,福建省各养殖区患败血症的欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)进行超微病理学研究,经电镜观察,患败血症欧洲鳗鲡鳃、肝和肠组织细胞内检出疱疹病毒。鳃上皮细胞核内病毒核衣壳,呈圆形或双环状,直径约80 nm^100 nm,核心或致密,或空壳。鳃上皮细胞和成纤维细胞胞浆内可查见成熟病毒粒子,有包膜,呈圆形、核衣壳致密、直径约130 nm^150 nm。肝细胞和肠粘膜上皮细胞核内所查见的病毒核衣壳,呈圆形或双环状,多数核心密度高。文中还讨论了感染细胞核内与疱疹病毒核衣壳共存的直径30 nm^40 nm的微泡样结构的性质。在病鳗感染细胞内所检出病毒的形态学和形态发生学特征符合疱疹病毒科(Herpesviridae)病毒的形态。 展开更多

关键词 疱疹病毒 欧洲鳗鲡 败血症

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鳗鲡疱疹病毒ORF51基因的原核表达及多克隆抗体的制备 被引量：5

7

作者 李友娟 郭凤达 +1 位作者 葛均青 林天龙 《福建农林大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2014年第5期490-494,共5页

将鳗鲡疱疹病毒(AngHV)福建株(AngHV-FJ)ORF51基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建表达质粒pGEX-4T-2-ORF51,将其转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导后,收集表达菌体,进行SDS-PAGE分析和免疫印迹试验验证,结果表明,获得了... 将鳗鲡疱疹病毒(AngHV)福建株(AngHV-FJ)ORF51基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建表达质粒pGEX-4T-2-ORF51,将其转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导后,收集表达菌体,进行SDS-PAGE分析和免疫印迹试验验证,结果表明,获得了高效表达的AngHV-FJ ORF51融合蛋白.经割胶回收纯化,获得高纯度的融合表达蛋白.用纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的兔抗ORF51多克隆抗体.这为进一步研究ORF51蛋白的结构和功能及开展AngHV病的防治研究提供了重要的研究基础. 展开更多

关键词 鳗鲡疱疹病毒 ORF51 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体

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鳗鲡疱疹病毒ORF8基因的克隆表达及转录时相分析 被引量：2

8

作者 陈曦 李英英 +2 位作者 陈强 宋铁英 葛均青 《大连海洋大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期10-15,共6页

为研究鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)ORF8基因的特性,根据GenBank中AngHV参考株(NC_013668)的ORF8序列设计引物,采取PCR方法从分离的AngHV福建病毒株(AngHV-FJ)基因组中扩增出特异性片段,克隆至pMD19-T载体,经酶切和测序验... 为研究鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)ORF8基因的特性,根据GenBank中AngHV参考株(NC_013668)的ORF8序列设计引物,采取PCR方法从分离的AngHV福建病毒株(AngHV-FJ)基因组中扩增出特异性片段,克隆至pMD19-T载体,经酶切和测序验证,获得了ORF8的基因序列。结果表明:经生物信息学分析,ORF8编码的蛋白稳定性较好,存在跨膜结构且抗原表位多,符合病毒囊膜蛋白的特征;经转录时相分析,ORF8是病毒的早期基因(early gene,E),可能在病毒感染的早期阶段就发挥作用;将ORF8克隆至表达载体pET-32a,转化入大肠杆菌E.coli BL21中,以IPTG诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE及Western blot检验,实现了ORF8在大肠杆菌中的高效表达,进一步通过割胶的方法获得了相对分子质量约为44000的高纯度融合表达蛋白。本研究为下一步评价该表达蛋白的免疫效果和制备抗体,以及开发免疫诊断试剂和疫苗提供了研究基础。 展开更多

关键词 鳗鲡疱疹病毒 ORF8基因 转录时相 克隆 原核表达

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鳗鲡疱疹病毒FJ株ORF51基因的克隆及生物信息学分析 被引量：5

9

作者 李友娟 葛均青 林天龙 《福建农业学报》 CAS 2014年第4期314-318,共5页

为了解本课题组分离的鳗鲡疱疹病毒福建株(AngHV-FJ)ORF51的结构特征,扩繁了AngHV-FJ,提取其基因组DNA,经PCR扩增,获得ORF51基因,将其克隆至pMD19-T载体中,进行DNA测序,用生物信息学方法分析AngHV-FJ ORF51基因及其编码蛋白的结构和功... 为了解本课题组分离的鳗鲡疱疹病毒福建株(AngHV-FJ)ORF51的结构特征,扩繁了AngHV-FJ,提取其基因组DNA,经PCR扩增,获得ORF51基因,将其克隆至pMD19-T载体中,进行DNA测序,用生物信息学方法分析AngHV-FJ ORF51基因及其编码蛋白的结构和功能。结果显示,扩增到长约720bp的ORF51基因序列,其与GeneBank上鳗鲡疱疹病毒欧洲株(AngHV-1)ORF51基因的序列完全一致。该基因编码239个氨基酸;预测ORF51基因编码蛋白的分子量为26 107.1Da,等电点为7.66,是疏水性蛋白且偏碱性;有4个跨膜域;抗原表位预测显示抗原性较好;结构预测显示,存在1个N-糖基化位点、1个O-糖基化位点、10个磷酸化位点;亚细胞定位预测显示其主要存在于内质网。本研究为解析ORF51的功能及开展AngHV的基因工程疫苗研究奠定了基础。 展开更多

关键词 鳗鲡疱疹病毒 ORF51基因 克隆测序 生物信息学分析

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患“红肝病”鳗鲡疱疹病毒的分离和鉴定 被引量：4

10

作者 卓玉琛 《福建农业学报》 CAS 北大核心 2015年第2期117-120,共4页

利用鳗鲡疱疹病毒(HVA)DNA聚合酶基因引物对患病双色鳗鲡和美洲鳗鲡进行PCR检测(PCR检测结果仅有双色鳗鲡),获得约394bp的目的条带,测序表明扩增出的条带为AHV的DNA聚合酶基因片段,与GeneBank公布的HQ992949、GU233800、FJ940765等6个... 利用鳗鲡疱疹病毒(HVA)DNA聚合酶基因引物对患病双色鳗鲡和美洲鳗鲡进行PCR检测(PCR检测结果仅有双色鳗鲡),获得约394bp的目的条带,测序表明扩增出的条带为AHV的DNA聚合酶基因片段,与GeneBank公布的HQ992949、GU233800、FJ940765等6个鳗鲡疱疹病毒基因同源性为100%,与GU205167、AF363783鳗鲡疱疹病毒基因同源性为99%。将患病双色鳗鲡、美洲鳗鲡肝脏和肾脏组织的除菌滤液,接种EPC细胞,细胞7d出现CPE,双色鳗鲡株传代至15代,美洲鳗鲡株传代至5代。 展开更多

关键词 鳗鲡 疱疹病毒 PCR 病毒分离

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鳗鲡疱疹病毒ORF115基因克隆、转录时相分析及原核表达

11

作者 陈曦 杨金先 +2 位作者 陈华 陈强 葛均青 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期2684-2691,共8页

【目的】克隆鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)ORF115基因,获得ORF115基因序列生物信息学特征,分析其在病毒入侵细胞过程中的转录时相并进行原核表达,为解析ORF115基因的特性和功能及开发免疫学诊断技术和亚单位疫苗打下基础... 【目的】克隆鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)ORF115基因,获得ORF115基因序列生物信息学特征,分析其在病毒入侵细胞过程中的转录时相并进行原核表达,为解析ORF115基因的特性和功能及开发免疫学诊断技术和亚单位疫苗打下基础。【方法】根据GenBank已公布AngHV参考株(NC_013668)的基因序列,设计特异性引物扩增ORF115基因,从分离的AngHV-FJ福建株(AngHV-FJ)基因组中扩增出ORF115基因,克隆至pMD19-T载体,经酶切鉴定和测序验证,获得ORF115基因序列。采用Softberry、ProtParam、TMHMM、SignalP 5.0、PSORTⅡ及BepiPred等在线软件进行生物信息学分析;采用反转录PCR(RT-PCR)对ORF115基因进行转录时相分析;将ORF115基因克隆至表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测及Western blotting鉴定。【结果】克隆获得的AngHV-FJ ORF115基因全长318 bp,与GenBank已发布的参考序列相似性为100%;生物信息学预测表明,AngHV-FJ ORF115基因编码蛋白的分子量为11.8 kD,理论等电点(p I)为6.04,不稳定系数为16.38,总平均亲水性指数为0.172,属酸性弱疏水蛋白,较稳定;OR115蛋白存在跨膜结构,无信号肽,主要分布于细胞质中,有长片段抗原表位;转录时相分析结果表明,ORF115基因的转录本在病毒感染细胞后6 h即可检出,于感染24 h达峰值,随后无明显变化,属于病毒晚期基因。SDS-PAGE及Western blotting分析结果显示,ORF115基因可在大肠杆菌中表达,表达蛋白大小与预期一致,约32 kD。【结论】AngHV ORF115基因属于病毒晚期基因,其编码蛋白属酸性弱疏水蛋白,有长片段抗原表位,可能在病毒感染晚期发挥作用。获得的ORF115原核表达蛋白可用于制备多克隆抗体及AngHV亚单位疫苗开发。 展开更多

关键词 鳗鲡疱疹病毒(anghv) ORF115基因 转录时相 原核表达 晚期基因

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养殖鳗鲡疱疹病毒和支原体共感染的超微形态学证据 被引量：2

12

作者 卓玉琛 《电子显微学报》 CAS CSCD 2014年第2期168-171,共4页

2011和2012年福建省各养殖区引进的美洲鳗鲡(Anguilla Rostrata)和双色鳗鲡(Anguilla bicolor bicolor)在玻璃鳗培育阶段普遍发生"红肝病",导致了较高的发病率和死亡率,给养殖生产造成严重的危害。本文应用透射电镜(TEM)对各... 2011和2012年福建省各养殖区引进的美洲鳗鲡(Anguilla Rostrata)和双色鳗鲡(Anguilla bicolor bicolor)在玻璃鳗培育阶段普遍发生"红肝病",导致了较高的发病率和死亡率,给养殖生产造成严重的危害。本文应用透射电镜(TEM)对各养殖区患"红肝病"的美洲鳗鲡和双色鳗鲡进行超微病理研究。结果显示:在患病美洲鳗鲡鳃组织的肌肉细胞间质中的纤维母细胞查见胞核内许多排列无序的疱疹病毒核衣壳,多数呈空心双环状,直径约80 nm^100 nm,少数核心致密呈线点状或蝌蚪状。在患病双色鳗鲡鳃上皮细胞核旁胞浆内可查见个别成熟病毒粒子。根据所检出病毒的形态和形态发生学特征可以确定该病毒为疱疹病毒科(Herpesviridae)的成员。另外,在病鳗肾细胞的细胞突起之间和细胞外可查见许多大小不等、形态多样,呈杆状、球形、哑铃形或橄榄形,有双层脂质外膜,无细胞壁的支原体(pleuro-pneumonia-like organism,PPLO)。本研究在国内首次应用TEM显微镜意外地在自然感染的养殖鳗鲡组织细胞中检出疱疹病毒和支原体,为鳗鲡"红肝病"的防控提供了有价值的科学依据。 展开更多

关键词 鳗鲡 疱疹病毒 支原体 共感染 电镜

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鳗鲡疱疹病毒的流行情况与控制技术 被引量：8

13

作者 樊海平 杨明 +1 位作者 张蕉霖 钟全福 《科学养鱼》 2019年第8期46-48,共3页

在欧洲鳗鲡、美洲鳗鲡、花鳗鲡以及双色鳗鲡的试养过程及以后规模养殖中,部分养殖场的不同品种、不同养殖阶段发生了较为严重的疾病,如南美洲产美洲鳗鲡和欧洲鳗鲡的脱黏败血症、北美洲产美洲鳗鲡和双色鳗鲡的红肝症、花鳗鲡脱黏症等疾... 在欧洲鳗鲡、美洲鳗鲡、花鳗鲡以及双色鳗鲡的试养过程及以后规模养殖中,部分养殖场的不同品种、不同养殖阶段发生了较为严重的疾病,如南美洲产美洲鳗鲡和欧洲鳗鲡的脱黏败血症、北美洲产美洲鳗鲡和双色鳗鲡的红肝症、花鳗鲡脱黏症等疾病,尤其是规模化养殖过程中的欧洲鳗鲡和美洲鳗鲡的脱黏症以及美洲鳗鲡红肝症一旦暴发,均引起较高的死亡率,导致了严重经济损失。 展开更多

关键词 鳗鲡苗 疱疹病毒 美洲鳗鲡 双色鳗鲡 欧洲鳗鲡 日本鳗鲡 流行情况

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鳗鲡肾脏细胞系的建立及其对鳗鲡疱疹病毒的敏感性 被引量：8

14

作者 李苗苗 吴斌 +4 位作者 林楠 王晓伟 江小斌 林国清 樊海平 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期237-244,共8页

为开展鳗鲡病毒性疾病流行病学调查和病原生物学研究,进行鳗鲡病毒的分离、培养和鉴定,研究采用组织块培养法,以欧洲鳗鲡肾脏组织为材料,建立了欧洲鳗鲡肾脏细胞系(European eel kidney cell line,EEK),EEK形态呈类纤维状,经过约12个月... 为开展鳗鲡病毒性疾病流行病学调查和病原生物学研究,进行鳗鲡病毒的分离、培养和鉴定,研究采用组织块培养法,以欧洲鳗鲡肾脏组织为材料,建立了欧洲鳗鲡肾脏细胞系(European eel kidney cell line,EEK),EEK形态呈类纤维状,经过约12个月的培养,已成功传至38代。通过对其培养液、血清浓度和培养温度等条件进行优化,发现DMEM/F12、L15培养液均适合其正常生长和增殖,而在MEM培养液中无法正常生长;在5%—15%FBS(Fetal Bovine Serum)浓度范围内,其生长速度随FBS浓度的升高而增快,当FBS浓度高于20%或过低于5%时,其生长速率有所减慢;在22—27℃时生长良好,但当温度低于17℃和高于32℃时细胞生长速度明显减慢。对EEK细胞进行鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AnHV)敏感性实验,结果表明该细胞系对鳗鲡疱疹病毒敏感,可产生明显的细胞病变。EEK的建立丰富了鱼类细胞系的种类,为鳗鲡病毒性疾病诊断、病毒性病原学研究和病毒疫苗研制提供了重要实验材料。 展开更多

关键词 欧洲鳗鲡 细胞系 鳗鲡疱疹病毒 敏感性

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鳗鲡疱疹病毒与鳗鲡圆环病毒双重PCR检测方法的建立 被引量：2

15

作者 林而舒 卓玉琛 +4 位作者 陈斌 林煜 钟全福 樊海平 曾占壮 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第11期1394-1399,共6页

【目的】建立能同时检测鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus, AHV)与鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus,EeCV)的双重PCR法。【方法】优选PCR引物组合,建立鳗鲡疱疹病毒与鳗鲡圆环病毒的双重PCR检测方法,探究双重PCR扩增条件,并检验该方法的... 【目的】建立能同时检测鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus, AHV)与鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus,EeCV)的双重PCR法。【方法】优选PCR引物组合,建立鳗鲡疱疹病毒与鳗鲡圆环病毒的双重PCR检测方法,探究双重PCR扩增条件,并检验该方法的特异性、灵敏性和临床样品检测效果。【结果】双重PCR法同时扩增出鳗鲡疱疹病毒690 bp和鳗鲡圆环病毒338 bp特异性片段,与猪圆环病毒(Porcine circovirus)、鸭圆环病毒(Duck circovirus)、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus)和鲤疱疹病毒(Cyprinid herpesvirus)的核酸不发生扩增反应。鳗鲡疱疹病毒和鳗鲡圆环病毒重组质粒标准品的最低全检出量为5.0×10^(-4)μg·mL^(-1)。用所建立的双重PCR方法对50份临床病鳗进行检验,其中鳗鲡疱疹病毒的感染率为16%,鳗鲡圆环病毒的感染率为68%,共感染率为8%。该感染率与单一PCR检测结果完全一致。【结论】建立的鳗鲡疱疹病毒和鳗鲡圆环病毒双重PCR检测法不仅特异性强、灵敏度高、重复性好,而且临床应用效果佳,为鳗鲡疱疹病毒和鳗鲡圆环病毒的快速检测提供了有效的技术支持。 展开更多

关键词 鳗鲡疱疹病毒 鳗鲡圆环病毒 双重PCR 检测方法

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应用鳗鲡肾脏细胞分离疱疹病毒及毒株理化性质试验

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作者 李苗苗 《中国动物检疫》 CAS 2022年第3期85-90,共6页

为研究鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AnHV)毒株的理化性质,用鳗鲡肾脏细胞(European eel kidney cell,EEK)从福建省某鳗鲡养殖场出现"脱黏败血病"典型症状的欧洲鳗鲡组织中分离得到一株病毒株,采用电镜观察、PCR检测和... 为研究鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AnHV)毒株的理化性质,用鳗鲡肾脏细胞(European eel kidney cell,EEK)从福建省某鳗鲡养殖场出现"脱黏败血病"典型症状的欧洲鳗鲡组织中分离得到一株病毒株,采用电镜观察、PCR检测和DNA测序对其进行鉴定,并对分离毒株进行温度和酸碱度敏感性试验。结果显示:分离毒株感染EEK可产生明显的细胞病变效应。细胞培养上清中存在直径近200 nm的病毒粒子,细胞核内有大量病毒粒子聚集。用AnHV特异性引物对病料组织和感染细胞培养物进行PCR检测,均能扩增出约394 bp的目的条带,PCR产物测序序列与所公布的AnHV基因序列相似性达99%以上。分离到的AnHV经30℃处理30 min后,滴度下降不显著;40℃、50℃处理30 min后,滴度均明显下降;60℃处理30 min后AnHV失活;AnHV经pH3和pH11处理后滴度均明显下降。本试验成功应用EEK分离鉴定出了一株AnHV,进一步证实了同源的细胞系分离同一鱼类病毒的有效性。该AnHV毒株对温度和酸碱度均比较敏感,可利用其理化性质防控鳗鲡疱疹病毒病发生。 展开更多

关键词 鳗鲡肾脏细胞 鳗鲡疱疹病毒 分离 鉴定 理化性质

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欧洲首次从鳗鲡中分离出疱疹病毒

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作者 李凯年 《畜牧兽医科技信息》 2001年第7期7-7,共1页

1998年用鳗鲡肾细胞系(EK—1)在荷兰从发病的欧洲鳗鲡中分离出一种细胞致病性因子,并用电镜定性为一种疱疹病毒。这种病毒在EK—1细胞中繁殖良好,而在不同鱼种的细胞(鲑的RTG—2细胞和黑头软口鲦的FHM细胞)中繁殖不良。

关键词 疱疹病毒 日本鳗鲡 欧洲鳗鲡 致病性 黑头软口鲦 水产养殖 肾细胞 回顾性检查 组织匀浆 种细胞

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美洲鳗鲡“脱黏败血综合征”病原的分离鉴定及其致病性研究 被引量：3

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作者 杨金先 李英英 +3 位作者 陈强 陈曦 宋铁英 葛均青 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期138-143,共6页

为明确美洲鳗鲡“脱黏败血综合征”的病原,本研究采集福建省某养殖场的美洲鳗鲡病料组织样品制备病理切片,观察各组织病变,结果显示,病鳗的鳃、肝脏和肾脏呈现广泛性红细胞渗出和组织细胞变性、坏死。将病料样品接种鳗鲡肾脏细胞系(EK)... 为明确美洲鳗鲡“脱黏败血综合征”的病原,本研究采集福建省某养殖场的美洲鳗鲡病料组织样品制备病理切片,观察各组织病变,结果显示,病鳗的鳃、肝脏和肾脏呈现广泛性红细胞渗出和组织细胞变性、坏死。将病料样品接种鳗鲡肾脏细胞系(EK)进行病毒的分离,对分离病毒经电镜观察,结果显示,接种病料样品匀浆液的EK细胞出现合胞体病变,可见细胞核内有大量直径约120 nm的病毒。提取病毒基因后作为模板,采用PCR鉴定,结果证实其为鳗鲡疱疹病毒(AngHV),将其命名为AngHV-20713。进一步扩增分离病毒的ORF71基因并分析其同源性和遗传进化关系,结果显示,AngHV-20713与其它AngHV的同源性为93.6%~99.0%,且与分离自美洲鳗鲡的AngHV亲缘关系最近。将分离病毒以106 pfu/尾腹腔注射健康的美洲鳗鲡和欧洲鳗鲡,进行人工感染实验,结果显示,AngHV-20713对鳗鲡具有致病性,感染鳗鲡可见体表黏液脱落、胸鳍出血等“脱黏败血综合征”症状,并导致美洲鳗鲡60%的发病率和20%的死亡率,而感染的欧洲鳗鲡死亡率高达56.7%。利用qPCR从感染病毒的美洲鳗鲡各组织内均可检测到AngHV,从内脏可再次分离培养到AngHV-20713,表明AngHV是美洲鳗鲡“脱黏败血综合征”的病原。本研究为深入开展鳗鲡“脱黏败血综合征”的防控研究奠定了基础。 展开更多

关键词 美洲鳗鲡 脱黏败血综合征 鳗鲡疱疹病毒 病原

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