鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2) ORF25蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备 被引量：7

1

作者 彭俊杰 张琪 +5 位作者 贾路路 林蠡 袁军法 曾令兵 周勇 刘学芹 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期96-101,共6页

利用PCR方法扩增鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)ORF25基因的部分基因序列,并将扩增产物连接到原核表达载体pGEX-KG,成功构建了CyHV-2-ORF25-KG重组质粒。IPTG将其诱导后,SDS-PAGE分析表明:目的蛋白得到表达,分子质量大小为42ku,且主要以包涵体... 利用PCR方法扩增鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)ORF25基因的部分基因序列,并将扩增产物连接到原核表达载体pGEX-KG,成功构建了CyHV-2-ORF25-KG重组质粒。IPTG将其诱导后,SDS-PAGE分析表明:目的蛋白得到表达,分子质量大小为42ku,且主要以包涵体形式存在;用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,多次免疫后通过细胞融合,筛选出1株单抗5C6;经间接免疫荧光试验和Western blot试验验证,这株单抗可以识别CyHV-2ORF25蛋白。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒ⅱ型 ORF25蛋白 原核表达 单克隆抗体

在线阅读 下载PDF 职称材料

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72单克隆抗体的制备及应用

2

作者 徐超楠 孙雨雨 +3 位作者 王佳 郭宝琴 魏畅 李强 《水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期598-605,共8页

鲤疱疹病毒Ⅱ型是引起鲫造血器官坏死病的重要病原。为建立基于抗原水平的免疫检测方法,通过原核表达方法制备鲤疱疹病毒Ⅱ型核衣壳蛋白ORF72,将纯化的ORF72蛋白免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术筛选获得单克隆抗体1B3、4B1、4C2、5F4和5H... 鲤疱疹病毒Ⅱ型是引起鲫造血器官坏死病的重要病原。为建立基于抗原水平的免疫检测方法,通过原核表达方法制备鲤疱疹病毒Ⅱ型核衣壳蛋白ORF72,将纯化的ORF72蛋白免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术筛选获得单克隆抗体1B3、4B1、4C2、5F4和5H9。免疫印迹分析显示,上述5株单抗均可特异性识别重组蛋白ORF72;免疫荧光分析显示,仅单抗4C2可与感染鲤疱疹病毒Ⅱ型的鲫脾脏发生阳性反应。利用单抗4C2通过间接免疫荧光技术对鲤疱疹病毒Ⅱ型感染鎏金金鱼鳍条细胞系(RyuF-2)后ORF72蛋白表达情况进行检测,结果显示,感染后36 h可检测到阳性信号,并且随着感染时间的延长,细胞中ORF72的表达量明显增加。本试验制备的单克隆抗体4C2为体外进一步探究鲤疱疹病毒Ⅱ型在细胞内的复制机制及建立病鱼免疫检测手段奠定了基础。 展开更多

关键词 异育银鲫 鲤疱疹病毒ⅱ型 ORF72 单克隆抗体 间接免疫荧光

在线阅读 下载PDF 职称材料

感染鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)的异育银鲫血液生理生化指标及相应组织学变化 被引量：3

3

作者 林秀秀 叶元土 +9 位作者 吴萍 腾峰 王敏 蒋蓉 段荣会 陈卓 高李松 刘进 蔡春芳 罗其刚 《水产学杂志》 CAS 2016年第2期16-23,共8页

于江苏大丰金鹿合作社采集三种状态的异育银鲫Carassius auratus gibelio样本,试验1组(H)来自未发生过鲤疱疹病毒(Cy HV-2)病的2个池塘(面积200×667m2),即为无Cy HV-2病症状的病毒携带者;试验2组(IH)和试验3组(I)为正在发病的2个池... 于江苏大丰金鹿合作社采集三种状态的异育银鲫Carassius auratus gibelio样本,试验1组(H)来自未发生过鲤疱疹病毒(Cy HV-2)病的2个池塘(面积200×667m2),即为无Cy HV-2病症状的病毒携带者;试验2组(IH)和试验3组(I)为正在发病的2个池塘(面积200×667m2),IH组有轻微的Cy HV-2病症状,而I组为典型的Cy HV-2病症状,测定其血成分、血清生化指标,并观察肠道和肝胰脏的组织病理学,以探讨异育银鲫感染鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)的发病机制。结果表明:IH组和I组鲫除淋巴细胞百分比显著升高外(P<0.05),中性粒细胞和单核细胞百分比、红细胞和血栓细胞数、血红蛋白、血栓细胞压积均显著低于H组(P<0.05);I组淋巴细胞百分比显著高于IH组(P<0.05),而中性粒细胞百分比却显著低于IH组(P<0.05),其他各项指标无显著差异。IH组和I组除天门冬氨酸基转移酶/丙氨酸氨基转移酶、白蛋白、白球比例比H组显著升高外(P<0.05),胆碱酯酶和碱性磷酸酶活性、总胆汁酸、甘油三酯、高密度脂蛋白/低密度脂蛋白均显著下降(P<0.05)。I组与IH组结果比较,天门冬氨酸基转移酶、天门冬氨酸基转移酶/丙氨酸氨基转移酶、白蛋白、白球比例均出现显著升高(P<0.05),而胆碱酯酶、碱性磷酸酶出现显著下降(P<0.05),总胆汁酸含量下降了38倍,下降明显,其他均无显著变化。扫描电镜观察发现,H组红细胞表面光滑完整,IH和I组均有一定的损伤;相比H组,IH组、I组的肝胰脏和肠道的组织结构损伤,且随着患病严重性的增加而加重。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒ⅱ型 异育银鲫 血液成分 生化指标 组织病理

在线阅读 下载PDF 职称材料

鲤疱疹病毒2型orf153基因编码蛋白的可溶性表达及多克隆抗体的制备

4

作者 王娜 张舟 +2 位作者 张旻 景宏丽 吴绍强 《水产学杂志》 2024年第6期53-58,96,共7页

为制备鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)ORF153蛋白多克隆抗体,经分析优化合成orf153基因片段,并将其克隆至pSUMO-Mut载体中,构建pSUMO-Mut-orf153原核表达质粒,然后将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中,经IPTG低温诱导,获得可溶性的重组蛋白ORF... 为制备鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)ORF153蛋白多克隆抗体,经分析优化合成orf153基因片段,并将其克隆至pSUMO-Mut载体中,构建pSUMO-Mut-orf153原核表达质粒,然后将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中,经IPTG低温诱导,获得可溶性的重组蛋白ORF153。SDS-PAGE电泳和Western blot实验结果表明,表达的可溶性重组蛋白与His单抗产生特异性反应,反应原性良好。将鉴定正确的重组蛋白亲和纯化后免疫新西兰大白兔,制备抗CyHV-2 ORF153蛋白的多克隆抗体。采用ORF153蛋白和感染CyHV-2的阳性组织液为抗原的间接ELISA方法,分别检测纯化后抗体的效价不低于1∶256000和1∶32000,多克隆抗体能特异性识别重组蛋白和感染CyHV-2的组织上清。本实验可为ORF153蛋白功能研究及CyHV-2血清学诊断方法建立奠定基础。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒2型 ORF153蛋白 可溶性表达 类泛素蛋白修饰分子(small ubiquitin-like modifier SUMO)标签 多克隆抗体

在线阅读 下载PDF 职称材料

转录因子NF-κB对鲤疱疹病毒Ⅱ型基因启动子的表达调控研究

5

作者 谢雅晴 龙晨 吕利群 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期88-93,共6页

为深入探究NF-κB信号通路对CyHV-2感染过程的影响,在CyHV-2感染的GiCF细胞中加入NF-κB激动剂,通过RT-qPCR和Western Blot分析在感染24、72、96 h后CyHV-2编码基因在转录和翻译水平的表达情况。结果显示,在加入NF-κB激动剂后的72、96 ... 为深入探究NF-κB信号通路对CyHV-2感染过程的影响,在CyHV-2感染的GiCF细胞中加入NF-κB激动剂,通过RT-qPCR和Western Blot分析在感染24、72、96 h后CyHV-2编码基因在转录和翻译水平的表达情况。结果显示,在加入NF-κB激动剂后的72、96 h,CyHV-2编码基因转录和翻译水平均明显高于对照组,提示NF-κB促进CyHV-2编码基因的转录及翻译。为进一步阐明NF-κB如何影响CyHV-2的转录和翻译,利用生物信息学软件预测CyHV-2部分编码基因的启动子序列中和NF-κB的结合位点,采用双荧光素酶报告基因实验分析NF-κB对启动子活性的影响。结果表明,NF-κB过表达提高了病毒基因启动子活性,提示NF-κB可以通过促进CyHV-2基因的启动子活性来增强病毒复制水平。研究结果有助深入探究CyHV-2基因的表达翻译机制,也为开发基于NF-κB信号通路靶点的新的抗病毒抑制剂提供理论支撑。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒ⅱ型 NF-ΚB 启动子 转录调控 双荧光素酶报告基因

在线阅读 下载PDF 职称材料

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25截短蛋白的多克隆抗体制备与免疫原性分析 被引量：6

6

作者 周勇 史玉恒 +5 位作者 范玉顶 刘文枝 江南 赵建青 许晨 曾令兵 《淡水渔业》 CSCD 北大核心 2018年第6期40-45,共6页

鲫(Carassius auratus)造血器官坏死症是我国养殖鲫中新出现的一种传染性病毒性疾病,其病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2),为研制针对该病的有效诊断试剂和疫苗,分析了Cy HV-2 ORF25基因编码蛋白的抗原表位,利用原核表达系统对Cy HV-2 ORF2... 鲫(Carassius auratus)造血器官坏死症是我国养殖鲫中新出现的一种传染性病毒性疾病,其病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2),为研制针对该病的有效诊断试剂和疫苗,分析了Cy HV-2 ORF25基因编码蛋白的抗原表位,利用原核表达系统对Cy HV-2 ORF25编码蛋白富含抗原表位的区域进行截短表达,制备了抗Cy HV-2 ORF25编码蛋白的多克隆抗体,通过间接免疫荧光和免疫保护力测定等实验研究了截短表达蛋白的免疫原性。结果显示,原核表达的截短蛋白t ORF25分子质量约为28 k W,蛋白纯化后免疫日本大耳兔制备的多克隆抗体可特异性识别在Gi CB上增殖的Cy HV-2。将截短表达蛋白t ORF25免疫异育银鲫后,感染Cy HV-2,其相对免疫保护率达47%。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒ⅱ型 ORF25截短蛋白 原核表达 多克隆抗体 免疫原性

在线阅读 下载PDF 职称材料

鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)灭活疫苗制备及其免疫效力测定 被引量：2

7

作者 潘晓艺 蔺凌云 +5 位作者 朱悦 姚嘉赟 尹文林 刘忆瀚 陈凡 沈锦玉 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期1143-1150,共8页

鲫造血器官坏死病是由鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)引起的危害我国养殖鲫鱼(Carassius auratus)最严重的病毒性疾病。为制备有效预防鲫造血器官坏死病的灭活疫苗,以CyHV-2代表流行株CNDF-TB2015为疫苗株,以CSC细胞系进行病毒增殖,并采用不同... 鲫造血器官坏死病是由鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)引起的危害我国养殖鲫鱼(Carassius auratus)最严重的病毒性疾病。为制备有效预防鲫造血器官坏死病的灭活疫苗,以CyHV-2代表流行株CNDF-TB2015为疫苗株,以CSC细胞系进行病毒增殖,并采用不同浓度的病毒对不同规格鲫鱼进行攻毒,建立攻毒模型。结果表明,培养的病毒滴度达10^(10)TCID_(50)/mL,以4×10^(7)TCID_(50)/尾的剂量腹腔注射感染体重300 g的鲫鱼可造成100%的死亡率。对病毒灭活剂甲醛、β-丙内酯和BEI灭活条件进行筛选优化,对疫苗免疫佐剂763A、IMS1312、铝胶和M402进行筛选,结果表明,浓度为10^(8.3) TCID_(50)/mL的病毒液最佳灭活条件为终浓度10 mmol/L的BEI 37℃灭活72 h,疫苗制备最佳佐剂为水佐剂IMS1312。对灭活疫苗的最小免疫剂量、最佳免疫剂量和有效免疫产生期进行测定,结果表明,要获得70%以上保护率的最小免疫剂量为8×10^(6)TCID_(50)/尾,最佳免疫剂量为4×10^(7)TCID_(50)/尾,在免疫4周后保护率可达80%,5周后保护率达到100%。制备的灭活疫苗为鲫造血器官坏死病的免疫预防提供了有力手段,也为其他水产动物病毒灭活疫苗的制备提供了借鉴。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒2型 鲫造血器官坏死病 灭活疫苗 免疫效力

在线阅读 下载PDF 职称材料

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4基因的克隆、表达与免疫学检测方法 被引量：12

8

作者 周勇 范玉顶 +4 位作者 徐进 马杰 江南 刘文枝 曾令兵 《淡水渔业》 CSCD 北大核心 2017年第1期61-65,共5页

根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,Cy HV-2)ORF 4基因序列(Gen Bank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到ORF 4基因编码框全长序列1 041 bp,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-ORF 4。... 根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,Cy HV-2)ORF 4基因序列(Gen Bank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到ORF 4基因编码框全长序列1 041 bp,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-ORF 4。将p ET-32a-ORF 4重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到融合表达的重组蛋白,融合表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,其分子质量约为57 ku,与预期大小一致。将纯化的重组蛋白免疫日本大耳兔,制备了多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000,Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接免疫荧光检测结果表明:该多克隆抗体可与由Cy HV-2感染引起细胞病变的异育银鲫脑组织细胞(GICB)发生特异性的结合。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒ⅱ型 ORF4 原核表达 多克隆抗体 免疫荧光检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

异育银鲫造血器官坏死症病鱼体内鲤疱疹病毒Ⅱ型的电镜观察与超微病理学特征 被引量：6

9

作者 林秀秀 叶元土 +9 位作者 吴萍 腾峰 王敏 蒋蓉 段荣会 陈卓 高李松 刘进 蔡春芳 罗其刚 《水产学杂志》 CAS 2016年第1期17-23,共7页

为分析患鲫造血器官坏死症异育银鲫Carassius auratus gibelio体内不同器官组织中鲤疱疹病毒（CyHV-2）粒子的形态结构、分布和发生过程,采集患病异育银鲫体肾、脾脏、头肾、肝胰脏、肠道、鳃各组织样本,利用透射电镜观察疱疹病毒和组... 为分析患鲫造血器官坏死症异育银鲫Carassius auratus gibelio体内不同器官组织中鲤疱疹病毒（CyHV-2）粒子的形态结构、分布和发生过程,采集患病异育银鲫体肾、脾脏、头肾、肝胰脏、肠道、鳃各组织样本,利用透射电镜观察疱疹病毒和组织细胞超微病理学。在所采集器官组织中均观察到鲤疱疹病毒Ⅱ型的DNA内核、空衣壳、实心核衣壳、含包膜成熟病毒共4种不同成熟时期的病毒粒子,不同时期的病毒粒子直径分别为65-90nm、90-180nm、90-180nm、170-220nm;体肾和脾脏中含有大量的Cy HV-2病毒,而头肾、肝胰脏、肠道和鳃中病毒粒子较少;CyHV-2病毒主要感染体肾、头肾、脾脏的吞噬细胞,导致机体免疫机能改变;组织细胞病理学观察发现吞噬细胞核边缘化,核内染色质变性,核膜溶解,线粒体嵴断裂,出现空泡,个别细胞溶解坏死。通过PCR检测和电镜观察病毒粒子结构特征,确诊异育银鲫感染Cy HV-2病毒,主要器官组织细胞中均有CyHV-2病毒,且在细胞核中完成复制和组装,在细胞质中获得外膜。感染Cy HV-2病毒的异育银鲫主要器官组织均受到一定的损伤。 展开更多

关键词 异育银鲫 鲤疱疹ⅱ型病毒(cyhv-2) 鲤出血病 超微结构

在线阅读 下载PDF 职称材料

鲤疱疹病毒2型微滴式数字PCR检测方法的建立及比较分析 被引量：11

10

作者 赵欣 贾鹏 +8 位作者 刘莹 王津津 史秀杰 潘广 郑晓聪 于力 何俊强 刘荭 吴志新 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2017年第4期126-133,共8页

本研究建立了定量检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,并与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测方法的灵敏性、重复性、特异性和临床样品检测做... 本研究建立了定量检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,并与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测方法的灵敏性、重复性、特异性和临床样品检测做了比较分析。结果表明,与qPCR相比,ddPCR具有相同的特异性,其灵敏性比qPCR低20倍。在定量CyHV-2 DNA时,ddPCR(R^2=0.994)和qPCR(R^2=0.994)均表现出良好的线性关系,且2种检测方法间的定量值呈正相关(R^2=0.989)。在定量检测相同稀释度的CyHV-2 DNA时,qPCR的定量值始终比ddPCR高10倍。ddPCR的组内和组间重复变异系数(CV)分别为0.59%–11.26%和6.55%–23.21%,而qPCR为16.57%–27.56%和22.31%–56.73%,说明ddPCR具有更好的稳定性。在临床样品定量检测时,ddPCR的检出率稍高于qPCR。本研究建立的ddPCR能够准确定量检测CyHV-2,将为CyHV-2相关研究提供有益参考。 展开更多

关键词 微滴式数字PCR 鲤疱疹病毒2型 实时荧光定量PCR 定量检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72基因克隆、蛋白原核表达和抗体制备 被引量：4

11

作者 李双 向涛 +4 位作者 周海峰 吴霆 顾伟 王文 孟庆国 《江苏农业科学》 2019年第14期62-65,共4页

异育银鲫作为我国重要的淡水经济鱼类,其鳃出血病为主要病害,并造成重大经济损失,该病病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus Ⅱ,CyHV-2).目前,研究主要在该病的检测和病理方面,对于免疫学检测方面研究较少.本研究根据CyHV-2ORF72... 异育银鲫作为我国重要的淡水经济鱼类,其鳃出血病为主要病害,并造成重大经济损失,该病病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus Ⅱ,CyHV-2).目前,研究主要在该病的检测和病理方面,对于免疫学检测方面研究较少.本研究根据CyHV-2ORF72基因序列设计了1对特异性引物,利用患病异育银鲫肾脏DNA作为模板,通过PCR扩增得到CyHV-2ORF72基因全长,该基因序列全长为1113bp,可编码370个氨基酸的蛋白.该基因与pET-28a表达载体连接构建重组原核表达载体pET-ORF72转入大肠杆菌中,经IPTG诱导表达得到了分子量约为45ku的重组蛋白,与预测的蛋白大小基本一致.将纯化的重组蛋白皮下多点注射免疫新西兰大耳兔制备了ORF72的多克隆抗体,经Western Blotting检测抗体能与病毒粗提液有良好反应,特异性较好,本结果可为下一步建立疫苗和免疫检测方法奠定基础. 展开更多

关键词 异育银鲫 鲤疱疹病毒ⅱ型 ORF72 多克隆抗体 WESTERN BLOTTING

在线阅读 下载PDF 职称材料

细胞MEK1/2蛋白及其相关通路在单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)复制中的作用 被引量：4

12

作者 屠静 张浩 +4 位作者 周琦 王波 曹眸 黄海 彭宜红 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期839-845,共7页

基于细胞Raf/MEK/ERK信号通路与病毒复制的关系,应用Western印迹检测p-ERK1/2蛋白的表达、用终点滴定法测定病毒增殖量(TCID50),以及观察感染细胞的细胞病变效应(CPE)等,揭示单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)复制与ERK通路的关系.结果表明,HSV-... 基于细胞Raf/MEK/ERK信号通路与病毒复制的关系,应用Western印迹检测p-ERK1/2蛋白的表达、用终点滴定法测定病毒增殖量(TCID50),以及观察感染细胞的细胞病变效应(CPE)等,揭示单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)复制与ERK通路的关系.结果表明,HSV-2的复制可引起细胞ERK通路的活化;用U0126预先抑制ERK通路的活化,或用特异性siRNA敲减MEK1/2基因的表达可显著地抑制病毒复制.提示ERK信号通路以及MEK1/2蛋白对HSV-2的复制具有重要的作用.该研究对进一步阐明细胞ERK通路各激酶蛋白在病毒复制中的作用机制、寻找抗病毒作用靶标等奠定了良好的基础. 展开更多

关键词 单纯疱疹病毒ⅱ型 ERK信号通路 MEK1/2 小干扰RNA

在线阅读 下载PDF 职称材料

鲤疱疹病毒Ⅱ型的核酸恒温扩增微流控快速检测芯片的建立 被引量：3

13

作者 齐立斐 毛瑞 +3 位作者 吴萍 王倬 叶元土 杜昱光 《沈阳农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期220-226,共7页

鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)主要感染锦鲤、鲫鱼及其变种,导致造血器官坏死,其致死率高,给养殖业造成了巨大损失。为建立一种快速、灵敏、准确的CyHV-2检测方法,可于大规模暴发之前进行疫情的早期诊断和及时防控,对C... 鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)主要感染锦鲤、鲫鱼及其变种,导致造血器官坏死,其致死率高,给养殖业造成了巨大损失。为建立一种快速、灵敏、准确的CyHV-2检测方法,可于大规模暴发之前进行疫情的早期诊断和及时防控,对CyHV-2建立了一种集核酸快速提取方法、竞争性互补介导核酸恒温扩增(competitive annealing mediated isothermal amplification,CAMP)与微流控芯片(microfluidic chip)于一体的检测方法。以CyHV-2基因保守区域片段为靶序列设计特异性引物,通过条件优化建立了一种基于CAMP技术的CyHV-2可视化检测方法,并且对该方法进行了特异性、灵敏性及临床样本的检测进行评估。结果表明:所建立CAMP方法的灵敏度最低检测限为10拷贝;对与其基因型有较高相似性的鲤疱疹病毒Ⅲ型(Cyprinid herpesvirus3,CyHV-3)无非特异性扩增,特异性良好;用本方法对89批次的临床样本进行检测,显示灵敏度及特异性均为100%。核酸快速提取的方法能够较快获得纯度较高的核酸,缩短了核酸提取时间,且极大节约了检测成本,具有操作简单、样本用量少等特点,且经核酸快速提取方法处理的病鱼组织样本能够满足CAMP现场检测的要求。此外,将针对CyHV-2所建立的CAMP可视化检测方法结合微流控芯片,可实现多目标病原的高通量、多指标筛查,将极大提高检测效率。本试验对鲤疱疹病毒Ⅱ型所建立的核酸快速提取、CAMP检测及微流控芯片的方法可在70min内实现对该病毒的现场快速检测及诊断,极大地提高了对CyHV-2疫病的早期防控能力,将为CyHV-2的快速检测及疫情早期预警提供参考。所建立的方法亦可应用于其他经济水生生物病原的现场快速检测及后续防控。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒ⅱ型 CAMP 核酸快速提取 现场检测 微流控芯片

在线阅读 下载PDF 职称材料

siRNA干扰对鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF57基因表达的影响 被引量：2

14

作者 金李萍 潘晓艺 +7 位作者 蔺凌云 姚嘉赟 曹铮 尹文林 赖迎迢 陶家发 刘忆瀚 沈锦玉 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期537-544,共8页

研究通过在异育银鲫脊髓细胞系(Spinal cord tissue cell lines of Carassius auratus gibelio,CSC)中对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)ORF57进行RNA干扰,以探究其对CyHV-2病毒复制的影响。首先,以FAM标记的异育银鲫β-... 研究通过在异育银鲫脊髓细胞系(Spinal cord tissue cell lines of Carassius auratus gibelio,CSC)中对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)ORF57进行RNA干扰,以探究其对CyHV-2病毒复制的影响。首先,以FAM标记的异育银鲫β-actin的siRNA进行CSC细胞转染条件的优化,再将针对CyHV-2 ORF57基因设计的3条siRNA,转染CSC细胞,并进行病毒感染,评估siRNA对病毒复制和致细胞病变的影响。转染条件优化结果显示,在siRNA浓度为80 nmol/L,转染液维持24h后更换维持液,β-actin基因表达量最低且观察到的荧光点数量最多。而ORF57-siRNAs干扰结果显示,ORF57-siRNA-2组表现出了较强的抑制效果,在接毒48h时,ORF57-siRNA-2处理组的ORF57基因表达量降到相对于Mock组的33.55%(P<0.01),并且各ORF57-siRNA组都表现出了延缓CyHV-2致细胞病变的时间和强度,抑制时间可达120h。TCID_(50)结果显示,不同组的ORF57-siRNAs均能降低病毒滴度,其中ORF57-siRNA-2将病毒原液TCID_(50)108.487/mL下降至106.776/mL。研究结果表明,干扰ORF57的表达可大大降低CyHV-2的致细胞病变力和复制率,ORF57在CyHV-2复制与致细胞病变中起重要作用。本研究为CyHV-2基于siRNA技术的抗病毒治疗和弱毒株的改造提供了借鉴。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒ⅱ型 RNA干扰 ORF57 小干扰RNA 异育银鲫脊髓细胞系 TCID_(50)

在线阅读 下载PDF 职称材料

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66截短蛋白多克隆抗体的制备及互作多肽筛选 被引量：3

15

作者 张小米 阙顺政 +2 位作者 龙晨 王浩 吕利群 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期796-802,共7页

为深入探究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)在感染过程中的生物学功能,构建了ORF66截短基因的原核表达质粒pET28a-tORF66,转化至BL21感受态细胞后利用IPTG(Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside)16℃诱导蛋白表达,经... 为深入探究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)在感染过程中的生物学功能,构建了ORF66截短基因的原核表达质粒pET28a-tORF66,转化至BL21感受态细胞后利用IPTG(Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside)16℃诱导蛋白表达,经尿素溶解透析获得溶解的重组蛋白后免疫6周龄小鼠,制备鼠抗tORF66多克隆抗体。将纯化后重组蛋白进行噬菌体展示以此来筛选互作蛋白。经Western Blot检测显示,抗体能够识别感染鲫鳍条细胞系GICF细胞中的鲤疱疹病毒Ⅱ型,效价较高,特异性较好。噬菌体淘选结果通过生物信息学分析显示,得到一条出现频次最高的多肽N′-LHLHQNRMSLSR-C′。该多肽与金鱼基因组中的3个基因有较高的同源性,推断其可能与rORF66重组蛋白相互作用。这将为深入探究ORF66在CyHV-2病毒感染过程中的生物学功能、开发抗CyHV-2病毒新药物及寻找潜在的药物靶点提供新依据。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒ⅱ型 ORF66截短蛋白 原核表达 多克隆抗体 噬菌体展示

在线阅读 下载PDF 职称材料

鲤疱疹病毒2型研究进展 被引量：15

16

作者 袁锐 陈静 +3 位作者 刘训猛 吴亚锋 王晶晶 方苹 《水产学杂志》 CAS 北大核心 2019年第1期38-45,共8页

鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)是引起鲫和金鱼造血器官坏死病的病原,在世界多个国家传播、流行,给鲫、金鱼和异育银鲫养殖业造成巨大经济损失。本文简要综述了鲤疱疹病毒2型的病原学、流行病学、诊断以及防控等研究进展... 鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)是引起鲫和金鱼造血器官坏死病的病原,在世界多个国家传播、流行,给鲫、金鱼和异育银鲫养殖业造成巨大经济损失。本文简要综述了鲤疱疹病毒2型的病原学、流行病学、诊断以及防控等研究进展,以期为鲤疱疹病毒2型基础研究和疾病防控策略提供参考。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒2型 鲫造血器官坏死 金鱼造血器官坏死 防控

在线阅读 下载PDF 职称材料

不同方法保存的患病异育银鲫中鲤疱疹病毒2型DNA提取和PCR扩增效果分析

17

作者 卢俊 陆宏达 +1 位作者 岳蒙蒙 操艮萍 《淡水渔业》 CSCD 北大核心 2015年第6期53-58,101,共7页

以患鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)疾病的异育银鲫(Carassius auratus gibelio)肾脏为实验材料,采用-20℃冷冻、100%乙醇、Dafano's液、10%福尔马林、Zenker's液、Müller's液、2.5%戊二醛、Helly... 以患鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)疾病的异育银鲫(Carassius auratus gibelio)肾脏为实验材料,采用-20℃冷冻、100%乙醇、Dafano's液、10%福尔马林、Zenker's液、Müller's液、2.5%戊二醛、Helly's液、Mossman's液、Bouin's液和Carnoy's液不同方法进行保存,通过微量分光光度计检测和琼脂糖凝胶电泳探讨不同保存方法对病毒DNA提取效果、常规PCR扩增效果和巢式PCR扩增效果的影响。结果表明:从病鱼肾脏中提取DNA时,除100%乙醇保存方法与-20℃冷冻保存组一样可以提取高质量的DNA外,其它保存方法对DNA提取有不同程度的影响,100%乙醇保存方法和保存的材料可以用作于鲤疱疹病毒2型DNA的提取;常规PCR扩增时,100%乙醇、Zenker's液、2.5%戊二醛、Helly's液、Bouin's液和Carnoy's液保存方法与-20℃冷冻保存组具有相同的效果,在362 bp处出现明亮一致的清晰单一目的条带,这6种保存方法及其保存的材料可以用作鲤疱疹病毒2型的常规PCR扩增;巢式PCR扩增时,100%乙醇、Dafano's液、10%福尔马林、Zenker's液、Müller's液、2.5%戊二醛、Helly's液、Mossman's液、Bouin's液和Carnoy's液所有保存方法与-20℃冷冻保存组具有相同的效果,在339 bp处出现明亮一致的清晰单一目的条带,这些保存方法及其保存的材料均可以用作于鲤疱疹病毒2型的巢式PCR扩增,在采用巢式PCR进行检测和诊断患鲤疱疹病毒2型疾病上具有应用价值。 展开更多

关键词 异育银鲫(Carassius auratus gibelio) 鲤疱疹病毒2型 保存 DNA提取 PCR

在线阅读 下载PDF 职称材料

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其免疫原性分析

18

作者 孟少东 姜新宇 +4 位作者 葛恒 胡光耀 杨大佐 张家林 李强 《大连海洋大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期393-398,共6页

为进一步研究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)ORF4蛋白的功能,通过PCR扩增CyHV-2 ORF4基因,并构建重组穿梭质粒pFastBac HTA-ORF4,将其转化至大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞后获得重组杆粒Bacmid-ORF4;采用脂质体法转染Sf9... 为进一步研究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)ORF4蛋白的功能,通过PCR扩增CyHV-2 ORF4基因,并构建重组穿梭质粒pFastBac HTA-ORF4,将其转化至大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞后获得重组杆粒Bacmid-ORF4;采用脂质体法转染Sf9细胞后,利用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot鉴定重组蛋白,采用His亲和层析柱纯化重组蛋白,并通过小鼠免疫试验分析其免疫原性。结果表明:转染72 h后Sf9细胞逐渐呈现出细胞变圆、细胞核明显增大的形态变化;间接免疫荧光结果显示,重组杆状病毒感染的Sf9细胞中出现了明显的绿色荧光;Western blot结果显示,纯化的CyHV-2 ORF4蛋白能够与抗His单抗发生特异性反应;小鼠免疫试验显示,纯化的CyHV-2 ORF4蛋白能诱导小鼠产生特异性免疫反应。研究表明,本研究中获得的CyHV-2 ORF4蛋白有较好的免疫原性,为CyHV-2 ORF4蛋白的功能解析提供了良好材料。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒ⅱ型(cyhv-2) 杆状病毒表达 ORF4蛋白 免疫原性

在线阅读 下载PDF 职称材料

鲤疱疹病毒Ⅱ型检测技术的研究进展 被引量：1

19

作者 郭宝琴 魏畅 李强 《水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第6期943-950,共8页

鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirusⅡ,CyHV-2),又称为疱疹造血器官坏死病毒(或金鱼造血器官坏死病毒),属疱疹病毒目、疱疹病毒科、鲤疱疹病毒属(Cyprinivirus)。由于是第二个分离自鲤科鱼类的疱疹病毒,该病毒被国际病毒系统分类委员... 鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirusⅡ,CyHV-2),又称为疱疹造血器官坏死病毒(或金鱼造血器官坏死病毒),属疱疹病毒目、疱疹病毒科、鲤疱疹病毒属(Cyprinivirus)。由于是第二个分离自鲤科鱼类的疱疹病毒,该病毒被国际病毒系统分类委员会命名为鲤疱疹病毒Ⅱ型[1-2]。该病毒为双链DNA病毒,无囊膜包被的核衣壳呈六角形或球形,囊膜包被下的病毒粒子成椭圆形,大小为175~200nm[3]。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒ⅱ型 免疫学检测 分子生物学检测 细胞培养分离

在线阅读 下载PDF 职称材料

异育银鲫中鲤疱疹病毒Ⅱ型载量测定方法的建立 被引量：2

20

作者 李双 吴霆 +2 位作者 顾伟 孟庆国 王文 《水产养殖》 CAS 2018年第4期21-25,30,共6页

异育银鲫是我国重要的淡水养殖品种,但是鲤疱疹病毒Ⅱ型对其造成了重大经济损失,该病毒致死率几乎可以达到100%。为了能够有效预防和控制该病毒,需要建立一种高效灵敏的定量方法。为此,本实验室根据CyHV-16基因序列设计引物,利用SYBR Gr... 异育银鲫是我国重要的淡水养殖品种,但是鲤疱疹病毒Ⅱ型对其造成了重大经济损失,该病毒致死率几乎可以达到100%。为了能够有效预防和控制该病毒,需要建立一种高效灵敏的定量方法。为此,本实验室根据CyHV-16基因序列设计引物,利用SYBR Green法建立了异育银鲫中鲤疱疹病毒Ⅱ型Realtime PCR方法,可以定量鲫鱼体内疱疹病毒载量,绘制了标准曲线,根据各个组织中病毒的拷贝数分析出该病毒在不同组织中的表达分布,其中脾、肾组织中表达量较高,鳃、肝、肠、肌肉等组织中表达量较低。这些数据为预防和控制异育银鲫Ⅱ型疱疹病毒奠定了实验和研究基础。 展开更多

关键词 异育银鲫 鲤疱疹病毒ⅱ型 荧光定量PCR 病毒载量

在线阅读 下载PDF 职称材料