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鲈鳜主要病毒性病原三重荧光定量PCR检测方法的建立及应用
1
作者
谭红连
韦剑成
+5 位作者
李莉萍
童桂香
苏美珍
韦信贤
杨明伟
陈静
《南方农业学报》
北大核心
2025年第8期2651-2661,共11页
【目的】建立能同时检测鲈鳜虹彩病毒(RanaV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和鲈形目鱼类弹状病毒(PFRV)的三重荧光定量PCR,为鲈鳜养殖过程中的RanaV、ISKNV、PFRV检疫、监测及临床诊断等提供简便且高效的检测方法。【方法】分别根据RanaV...
【目的】建立能同时检测鲈鳜虹彩病毒(RanaV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和鲈形目鱼类弹状病毒(PFRV)的三重荧光定量PCR,为鲈鳜养殖过程中的RanaV、ISKNV、PFRV检疫、监测及临床诊断等提供简便且高效的检测方法。【方法】分别根据RanaV-MCP基因、ISKNV-MCP基因、PFRV-G基因的保守序列设计特异性扩增引物和TaqMan-MGB探针,将目的基因片段克隆至pGM-T载体上构建重组质粒pGM-T-MCP^(RanaV)、pGM-T-MCP^(ISKNV)和pGM-T-G^(PFRV),其中,pGM-T-MCP^(RanaV)、pGM-T-MCP^(ISKNV)分别作为RanaV和ISKNV的标准品DNA,pGM-T-G^(PFRV)则以SalⅠ酶切后经体外转录获得PFRV标准品RNA;以标准品为模板进行三重荧光定量PCR反应条件优化及标准曲线制定,并分别进行敏感性、特异性、重复性及临床应用试验。【结果】优化后的三重荧光定量PCR反应体系30.0μL:2×Fast One Step Probe RT-qPCR Mix 15.0μL,引物RanaV-qF/RanaV-qR(10μmol/L)、ISKNV-qF/ISKNV-qR(10μmol/L)、PFRV-qF/PFRV-qR(10μmol/L)各0.6μL,探针RanaV-qP(5μmol/L)0.9μL,探针ISKNV-qP(5μmol/L)0.9μL,探针PFRV-qP(5μmol/L)1.2μL,核酸模板3.0μL,灭菌DEPC水补足至30.0μL。建立的三重荧光定量PCR对RanaV、ISKNV和PFRV标准品均具有较高的扩增效率(Eff.>95.0%),其标准曲线线性关系良好(RSq≥0.999),可实现对RanaV、ISKNV和PFRV的同步定量分析;对RanaV、ISKNV、PFRV标准品的检测灵敏度可达10 copies/反应,对鲈鳜组织样品的检测灵敏度为10 copies/mg;与草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)等鱼类常见病原均无交叉反应;检测RanaV、ISKNV、PFRV的组内及组间重复试验的C_t值变异系数均低于2.00%。采用建立的三重荧光定量PCR对采自广西各地养殖场的鲈鳜样品(大口黑鲈95份,鳜68份)进行检测,结果发现,RanaV阳性检出率为19.0%,ISKNV阳性检出率为14.7%,PFRV阳性检出率为4.3%。【结论】基于TaqMan-MGB探针建立的三重荧光定量PCR能同时检测RanaV、ISKNV和PFRV,具有灵敏度高、特异性强、准确可靠、操作简单、快速高效的特点,可为鲈鳜的苗种检疫、疫情监测及临床诊断提供更简便、更高效的技术手段。RanaV、ISKNV和PFRV感染在广西鲈鳜养殖中已流行,大口黑鲈以RanaV感染为主,鳜则以ISKNV感染为主,且存在混合感染及无临床症状的潜伏感染。
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关键词
大口黑鲈
鳜
虹彩
病毒
(RanaV)
传染性脾肾坏死
病毒
(ISKNV)
鲈形目
鱼类
弹状病毒
(
pfrv
)
三重荧光定量PCR
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职称材料
加州鲈鱼弹状病毒病流行特点及综合防控技术
被引量：
5
2
作者
雷燕
《当代水产》
2015年第5期76-,共1页
加州鲈鱼原名大口黑鲈,属鲈形目,太阳鱼科。是一种肉质鲜美、抗病力强、生长迅速、易起捕、适温较广的名贵肉食性鱼类。我国于1983年引进加州鲈鱼苗,并于1985年人工繁殖成功,鱼苗被广泛养殖,均取得较好的经济效益。但随着养殖规模的扩大...
加州鲈鱼原名大口黑鲈,属鲈形目,太阳鱼科。是一种肉质鲜美、抗病力强、生长迅速、易起捕、适温较广的名贵肉食性鱼类。我国于1983年引进加州鲈鱼苗,并于1985年人工繁殖成功,鱼苗被广泛养殖,均取得较好的经济效益。但随着养殖规模的扩大,加州鲈鱼的病害问题日益凸显,如烂鳃病、溃疡病、诺卡氏菌病、车轮虫病。
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关键词
加州鲈
鱼
弹状病毒
诺卡氏菌病
大口黑鲈
虹彩
病毒
病
肉食性
鱼类
车轮虫病
烂鳃病
鲈形目
人工繁殖
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职称材料
题名
鲈鳜主要病毒性病原三重荧光定量PCR检测方法的建立及应用
1
作者
谭红连
韦剑成
李莉萍
童桂香
苏美珍
韦信贤
杨明伟
陈静
机构
广西水产科学研究院/广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室
农业农村部中国(广西)—东盟水产种质资源综合开发与利用重点实验室
广西水产畜牧学校
出处
《南方农业学报》
北大核心
2025年第8期2651-2661,共11页
基金
广西重点研发计划项目(桂科农AB2506910047)
国家现代农业产业技术体系广西特色淡水鱼创新团队项目(nycytxgxcxtd-2021-08-02)
+1 种基金
广西农业科技自筹经费项目(Z202299)
广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室自主研究项目(2022-A-03-01)。
文摘
【目的】建立能同时检测鲈鳜虹彩病毒(RanaV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和鲈形目鱼类弹状病毒(PFRV)的三重荧光定量PCR,为鲈鳜养殖过程中的RanaV、ISKNV、PFRV检疫、监测及临床诊断等提供简便且高效的检测方法。【方法】分别根据RanaV-MCP基因、ISKNV-MCP基因、PFRV-G基因的保守序列设计特异性扩增引物和TaqMan-MGB探针,将目的基因片段克隆至pGM-T载体上构建重组质粒pGM-T-MCP^(RanaV)、pGM-T-MCP^(ISKNV)和pGM-T-G^(PFRV),其中,pGM-T-MCP^(RanaV)、pGM-T-MCP^(ISKNV)分别作为RanaV和ISKNV的标准品DNA,pGM-T-G^(PFRV)则以SalⅠ酶切后经体外转录获得PFRV标准品RNA;以标准品为模板进行三重荧光定量PCR反应条件优化及标准曲线制定,并分别进行敏感性、特异性、重复性及临床应用试验。【结果】优化后的三重荧光定量PCR反应体系30.0μL:2×Fast One Step Probe RT-qPCR Mix 15.0μL,引物RanaV-qF/RanaV-qR(10μmol/L)、ISKNV-qF/ISKNV-qR(10μmol/L)、PFRV-qF/PFRV-qR(10μmol/L)各0.6μL,探针RanaV-qP(5μmol/L)0.9μL,探针ISKNV-qP(5μmol/L)0.9μL,探针PFRV-qP(5μmol/L)1.2μL,核酸模板3.0μL,灭菌DEPC水补足至30.0μL。建立的三重荧光定量PCR对RanaV、ISKNV和PFRV标准品均具有较高的扩增效率(Eff.>95.0%),其标准曲线线性关系良好(RSq≥0.999),可实现对RanaV、ISKNV和PFRV的同步定量分析;对RanaV、ISKNV、PFRV标准品的检测灵敏度可达10 copies/反应,对鲈鳜组织样品的检测灵敏度为10 copies/mg;与草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)等鱼类常见病原均无交叉反应;检测RanaV、ISKNV、PFRV的组内及组间重复试验的C_t值变异系数均低于2.00%。采用建立的三重荧光定量PCR对采自广西各地养殖场的鲈鳜样品(大口黑鲈95份,鳜68份)进行检测,结果发现,RanaV阳性检出率为19.0%,ISKNV阳性检出率为14.7%,PFRV阳性检出率为4.3%。【结论】基于TaqMan-MGB探针建立的三重荧光定量PCR能同时检测RanaV、ISKNV和PFRV,具有灵敏度高、特异性强、准确可靠、操作简单、快速高效的特点,可为鲈鳜的苗种检疫、疫情监测及临床诊断提供更简便、更高效的技术手段。RanaV、ISKNV和PFRV感染在广西鲈鳜养殖中已流行,大口黑鲈以RanaV感染为主,鳜则以ISKNV感染为主,且存在混合感染及无临床症状的潜伏感染。
关键词
大口黑鲈
鳜
虹彩
病毒
(RanaV)
传染性脾肾坏死
病毒
(ISKNV)
鲈形目
鱼类
弹状病毒
(
pfrv
)
三重荧光定量PCR
Keywords
Micropterus salmoides
Siniperca chuats
ranavirus(RanaV)
infectious spleen and kidney necrosis virus(ISKNV)
Perciformes fish Rhabdoviridae(
pfrv
)
triplex fluorescence quantitative PCR
分类号
S941.41 [农业科学—水产养殖]
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职称材料
题名
加州鲈鱼弹状病毒病流行特点及综合防控技术
被引量：
5
2
作者
雷燕
机构
广州利洋水产科技股份有限公司
出处
《当代水产》
2015年第5期76-,共1页
文摘
加州鲈鱼原名大口黑鲈,属鲈形目,太阳鱼科。是一种肉质鲜美、抗病力强、生长迅速、易起捕、适温较广的名贵肉食性鱼类。我国于1983年引进加州鲈鱼苗,并于1985年人工繁殖成功,鱼苗被广泛养殖,均取得较好的经济效益。但随着养殖规模的扩大,加州鲈鱼的病害问题日益凸显,如烂鳃病、溃疡病、诺卡氏菌病、车轮虫病。
关键词
加州鲈
鱼
弹状病毒
诺卡氏菌病
大口黑鲈
虹彩
病毒
病
肉食性
鱼类
车轮虫病
烂鳃病
鲈形目
人工繁殖
分类号
S943 [农业科学—水产养殖]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
鲈鳜主要病毒性病原三重荧光定量PCR检测方法的建立及应用
谭红连
韦剑成
李莉萍
童桂香
苏美珍
韦信贤
杨明伟
陈静
《南方农业学报》
北大核心
2025
0
在线阅读
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职称材料
2
加州鲈鱼弹状病毒病流行特点及综合防控技术
雷燕
《当代水产》
2015
5
在线阅读
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职称材料
已选择
0
条
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参考文献
引证文献
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