目的建立一种病原宏基因高通量测序方法,并验证其检测性能。方法筛选不同核酸投入量的文库构建条件,分别测试5 ng、50 ng、100 ng 3种核酸投入量,20 min、25 min、30 min 3种片段化时间,7个、5个、3个3种扩增循环数,通过分析文库浓度和...目的建立一种病原宏基因高通量测序方法,并验证其检测性能。方法筛选不同核酸投入量的文库构建条件,分别测试5 ng、50 ng、100 ng 3种核酸投入量,20 min、25 min、30 min 3种片段化时间,7个、5个、3个3种扩增循环数,通过分析文库浓度和片段大小,确定最佳建库条件。选择真菌、革兰阳/阴性细菌的代表菌:白念珠菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌和格特隐球菌,按照1∶1的投入量,制备3种不同浓度混合菌悬液,分别添加10^(6)个/mL的T细胞悬液,制备参考品。通过参考品确认自建方法(方法1)的性能,并以方法2(DNA样本文库构建试剂盒联合探针锚定聚合测序法)为对照,确认两种方法一致性。结果确定了新建病原宏基因测序鉴定方法的最佳建库条件:核酸投入量50 ng,核酸打断时间20 min,PCR扩增循环数5个。方法1阳性符合率(准确性)、阴性符合率(特异性)可达100%,检出限为500 CFU/mL,线性样本中各种微生物检出每百万序列数(reads per million,RPM)的相关系数(r)>0.9,细菌检出变异系数(CV)在10%以内,真菌CV约为20%。以方法2对照,二者检测结果一致性为100%。结论建立一种病原微生物宏基因测序鉴定方法,该方法结果准确、稳定可靠,适用于肺泡灌洗液类样本的病原微生物检测。展开更多
文摘目的建立一种病原宏基因高通量测序方法,并验证其检测性能。方法筛选不同核酸投入量的文库构建条件,分别测试5 ng、50 ng、100 ng 3种核酸投入量,20 min、25 min、30 min 3种片段化时间,7个、5个、3个3种扩增循环数,通过分析文库浓度和片段大小,确定最佳建库条件。选择真菌、革兰阳/阴性细菌的代表菌:白念珠菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌和格特隐球菌,按照1∶1的投入量,制备3种不同浓度混合菌悬液,分别添加10^(6)个/mL的T细胞悬液,制备参考品。通过参考品确认自建方法(方法1)的性能,并以方法2(DNA样本文库构建试剂盒联合探针锚定聚合测序法)为对照,确认两种方法一致性。结果确定了新建病原宏基因测序鉴定方法的最佳建库条件:核酸投入量50 ng,核酸打断时间20 min,PCR扩增循环数5个。方法1阳性符合率(准确性)、阴性符合率(特异性)可达100%,检出限为500 CFU/mL,线性样本中各种微生物检出每百万序列数(reads per million,RPM)的相关系数(r)>0.9,细菌检出变异系数(CV)在10%以内,真菌CV约为20%。以方法2对照,二者检测结果一致性为100%。结论建立一种病原微生物宏基因测序鉴定方法,该方法结果准确、稳定可靠,适用于肺泡灌洗液类样本的病原微生物检测。
