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用于全基因组易位测序的Nalm6-Cas9细胞系的构建
1
作者
李倾城
黄俊彬
+5 位作者
薛红漫
杨默
朱澂明
李志光
董俊超
陈纯
《中国实验血液学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第5期1384-1390,共7页
目的:为进行基于CRISPR-Cas9的全基因组高通量易位测序,利用慢病毒转导构建表达Cas9蛋白的Nalm6-Cas9单克隆细胞系。方法:使用慢病毒载体lentiCas9-Blast、psPAX2和pMD2.G共转染HEK293T细胞包装病毒,病毒感染Nalm6细胞后使用杀稻瘟菌素(...
目的:为进行基于CRISPR-Cas9的全基因组高通量易位测序,利用慢病毒转导构建表达Cas9蛋白的Nalm6-Cas9单克隆细胞系。方法:使用慢病毒载体lentiCas9-Blast、psPAX2和pMD2.G共转染HEK293T细胞包装病毒,病毒感染Nalm6细胞后使用杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选,通过有限稀释法获得多个表达Cas9蛋白的单克隆细胞株。Western blot检测单克隆细胞株中Cas9蛋白的表达水平,细胞计数检测单克隆细胞株的细胞增殖活性。构建lentiCRISPRv2GFP-Δcas9、lentiCRISPRv2GFP-Δcas9-AF4、lentiCRISPRv2GFP-Δcas9-MLL质粒,并分别与pSPAX2、pMD2.G质粒共转染包装病毒,收集病毒感染Nalm6-Cas9单克隆细胞株,使用T载体克隆检测单克隆细胞株的Cas9蛋白的功能。结果:Western blot结果显示,Nalm6-Cas9_1-6单克隆细胞株高水平表达Cas9蛋白;细胞计数分析结果显示,Nalm6-Cas9_1-6单克隆细胞株细胞增殖活性与对照细胞比较无显著差异;T载体克隆检测显示,Nalm6-Cas9_1-6单克隆细胞株Cas9蛋白具有高水平切割活性,对AF4和MLL基因的编辑效率在90%以上。结论:本研究得到了稳定表达高活性Cas9蛋白的Nalm6-Cas9_1-6单克隆细胞株,为基于CRISPR/Cas9全基因组高通量易位测序技术探究治疗相关性白血病中MLL易位连接机制提供依据。
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关键词
Nalm6细胞系
Cas9蛋白
慢病毒
治疗相关性白血病
全
基因组
高通量
易位
测
序
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职称材料
与家族性系统性红斑狼疮有关的PLD2基因新突变及其功能分析
2
作者
彭琳
袁新科
+2 位作者
陈李笑
陈斯佳
陈科
《中南大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第3期234-239,共6页
目的:系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是严重危害人类健康的自身免疫性结缔组织病,遗传因素在SLE的发病中起关键作用。本研究探讨与家族性SLE有关的磷脂酶D2(phospholipase D2,PLD2)基因新突变,并进一步探讨该突变致...
目的:系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是严重危害人类健康的自身免疫性结缔组织病,遗传因素在SLE的发病中起关键作用。本研究探讨与家族性SLE有关的磷脂酶D2(phospholipase D2,PLD2)基因新突变,并进一步探讨该突变致SLE的可能机制。方法:收集SLE患者、患者父母及147例正常对照的静脉血,抽提全血DNA。对患者及其父母行全基因组高通量测序,并对测序结果采用多种生物信息学方法进行分析。进一步构建野生型(wild type,wt)、突变型(mutant type,mu)及阴性对照PLD2质粒并转染293细胞,采用蛋白质印迹法检测各组293细胞中调控PLD2-Ras信号通路的关键基因HRAS的蛋白质表达水平。结果:在该SLE家系中,女性SLE患者及其母亲、Ⅱ及Ⅲ代各1例有典型的SLE临床表现,且均较早出现狼疮性肾炎,其遗传特点符合常染色体显性遗传。发现患者及其母亲新的PLD2杂合突变(c.2722C>T),且患者父亲及其他正常对照中未发现该突变。与转染wtPLD2质粒和阴性对照PLD2质粒比较,转染muPLD2质粒的293细胞中HRAS的蛋白质表达水平显著上调(均P<0.05)。结论:PLD2 c.2722C>T突变可能是导致该SLE家系发病的原因之一。
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关键词
系统性红斑狼疮
PLD2
基因
HRAS
全
基因组
高通量
测
序
PLD2-Ras信号通路
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职称材料
题名
用于全基因组易位测序的Nalm6-Cas9细胞系的构建
1
作者
李倾城
黄俊彬
薛红漫
杨默
朱澂明
李志光
董俊超
陈纯
机构
中山大学附属第七医院(深圳)儿科儿童血液肿瘤专科
中山大学附属第七医院(深圳)科研中心
香港中文大学儿科血液学/肿瘤学/BMT系
中山大学中山医学院
出处
《中国实验血液学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第5期1384-1390,共7页
文摘
目的:为进行基于CRISPR-Cas9的全基因组高通量易位测序,利用慢病毒转导构建表达Cas9蛋白的Nalm6-Cas9单克隆细胞系。方法:使用慢病毒载体lentiCas9-Blast、psPAX2和pMD2.G共转染HEK293T细胞包装病毒,病毒感染Nalm6细胞后使用杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选,通过有限稀释法获得多个表达Cas9蛋白的单克隆细胞株。Western blot检测单克隆细胞株中Cas9蛋白的表达水平,细胞计数检测单克隆细胞株的细胞增殖活性。构建lentiCRISPRv2GFP-Δcas9、lentiCRISPRv2GFP-Δcas9-AF4、lentiCRISPRv2GFP-Δcas9-MLL质粒,并分别与pSPAX2、pMD2.G质粒共转染包装病毒,收集病毒感染Nalm6-Cas9单克隆细胞株,使用T载体克隆检测单克隆细胞株的Cas9蛋白的功能。结果:Western blot结果显示,Nalm6-Cas9_1-6单克隆细胞株高水平表达Cas9蛋白;细胞计数分析结果显示,Nalm6-Cas9_1-6单克隆细胞株细胞增殖活性与对照细胞比较无显著差异;T载体克隆检测显示,Nalm6-Cas9_1-6单克隆细胞株Cas9蛋白具有高水平切割活性,对AF4和MLL基因的编辑效率在90%以上。结论:本研究得到了稳定表达高活性Cas9蛋白的Nalm6-Cas9_1-6单克隆细胞株,为基于CRISPR/Cas9全基因组高通量易位测序技术探究治疗相关性白血病中MLL易位连接机制提供依据。
关键词
Nalm6细胞系
Cas9蛋白
慢病毒
治疗相关性白血病
全
基因组
高通量
易位
测
序
Keywords
Nalm6cell lines
Cas9protein
lentivirus
therapy-related leukemia
high-throughput genome-wide translocation sequencing
分类号
R733 [医药卫生—肿瘤]
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职称材料
题名
与家族性系统性红斑狼疮有关的PLD2基因新突变及其功能分析
2
作者
彭琳
袁新科
陈李笑
陈斯佳
陈科
机构
长沙市第一医院肾内科
中南大学湘雅三医院内分泌科
出处
《中南大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第3期234-239,共6页
基金
国家自然科学基金(81870589)
湖南省卫生健康委员会科研课题(B2017030,B2019135)。
文摘
目的:系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是严重危害人类健康的自身免疫性结缔组织病,遗传因素在SLE的发病中起关键作用。本研究探讨与家族性SLE有关的磷脂酶D2(phospholipase D2,PLD2)基因新突变,并进一步探讨该突变致SLE的可能机制。方法:收集SLE患者、患者父母及147例正常对照的静脉血,抽提全血DNA。对患者及其父母行全基因组高通量测序,并对测序结果采用多种生物信息学方法进行分析。进一步构建野生型(wild type,wt)、突变型(mutant type,mu)及阴性对照PLD2质粒并转染293细胞,采用蛋白质印迹法检测各组293细胞中调控PLD2-Ras信号通路的关键基因HRAS的蛋白质表达水平。结果:在该SLE家系中,女性SLE患者及其母亲、Ⅱ及Ⅲ代各1例有典型的SLE临床表现,且均较早出现狼疮性肾炎,其遗传特点符合常染色体显性遗传。发现患者及其母亲新的PLD2杂合突变(c.2722C>T),且患者父亲及其他正常对照中未发现该突变。与转染wtPLD2质粒和阴性对照PLD2质粒比较,转染muPLD2质粒的293细胞中HRAS的蛋白质表达水平显著上调(均P<0.05)。结论:PLD2 c.2722C>T突变可能是导致该SLE家系发病的原因之一。
关键词
系统性红斑狼疮
PLD2
基因
HRAS
全
基因组
高通量
测
序
PLD2-Ras信号通路
Keywords
systemic lupus erythematosus
phospholipase D2 gene
HRAS
high-throughput genomewide sequencing
phospholipase D2-Ras signaling pathway
分类号
R593.241 [医药卫生—内科学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
用于全基因组易位测序的Nalm6-Cas9细胞系的构建
李倾城
黄俊彬
薛红漫
杨默
朱澂明
李志光
董俊超
陈纯
《中国实验血液学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2022
0
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
与家族性系统性红斑狼疮有关的PLD2基因新突变及其功能分析
彭琳
袁新科
陈李笑
陈斯佳
陈科
《中南大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2021
0
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职称材料
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